Summary
Рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV) широко используется для клинической и доклинической доставки генов. Недооцененное применение rAAV заключается в надежной трансдукции культивируемых клеток без необходимости очистки. Для исследователей, не знакомых с rAAV, мы предлагаем протокол клонирования трансгенных кассет, производства сырых векторов и трансдукции клеточных культур.
Abstract
Рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы (rAAV) могут достигать мощной и устойчивой экспрессии трансгена без интеграции в широкий спектр типов тканей, что делает их популярным выбором для доставки генов на животных моделях и в клинических условиях. В дополнение к терапевтическому применению, rAAV являются полезным лабораторным инструментом для доставки трансгенов, адаптированных к экспериментальным потребностям исследователя и научным целям, в культивируемые клетки. Некоторые примеры включают экзогенные репортерные гены, кассеты сверхэкспрессии, РНК-интерференцию и инструменты на основе CRISPR, в том числе для полногеномных скринингов. Трансдукция rAAV менее вредна для клеток, чем электропорация или химическая трансфекция, и не требует специального оборудования или дорогостоящих реагентов для производства. Сырые лизаты или кондиционированные среды, содержащие rAAV, могут быть добавлены непосредственно в культивируемые клетки без дополнительной очистки для трансдукции многих типов клеток — недооцененная особенность rAAV. В этой статье мы представим протоколы для базового клонирования трансгенных кассет и продемонстрируем, как производить и применять сырые препараты rAAV к культивируемым клеткам. В качестве доказательства принципа мы продемонстрировали трансдукцию трех типов клеток, о которых еще не сообщалось в приложениях rAAV: клетки плаценты, миобласты и органоиды тонкой кишки. Мы обсуждаем надлежащее использование сырых препаратов rAAV, ограничения rAAV для доставки генов и соображения по выбору капсида. Этот протокол описывает простой, недорогой и эффективный метод, позволяющий исследователям добиться продуктивной доставки ДНК в клеточную культуру с помощью rAAV без необходимости трудоемких этапов титрования и очистки.
Introduction
Выяснение молекулярных основ клеточных функций часто требует экспрессии трансгенной ДНК в клеточной культуре. Для экспрессии трансгены должны проникнуть через селективную мембрану клетки и достичь ядра 1,2. Таким образом, способность эффективно обходить физические барьеры клетки и манипулировать ее центральными процессами является необходимостью применения трансгенеза для открытия новых биологических явлений. Один из подходов основан на внутренней способности вирусов доставлять и экспрессировать чужеродную ДНК 3,4.
Аденоассоциированный вирус (AAV) является одним из самых маленьких вирусов млекопитающих: его одноцепочечный геном ДНК размером 4,7 килооснования (kb) содержит два гена, rep (для репликазы) и cap (для капсида), упакованных в 60-мерный икосаэдрический капсид размером 25 нм. Гены rep/cap имеют множество промоторов, считывающих рамок и продуктов сплайсинга, которые кодируют, по крайней мере, девять уникальных белков, необходимых для репликации, производства и упаковки вируса 5,6. Кроме того, оба конца генома содержат вторичные структуры, называемые инвертированными концевыми повторами (ITR), которые необходимы для репликации ДНК, упаковки генома и последующей обработки во время трансдукции 7,8,9,10. РМЭ являются единственными элементами ДНК, которые необходимы для упаковки генома в капсид, и, следовательно, AAV может быть клонирован для доставки трансгена путем замены генов virus rep/cap на выбранные исследователем регуляторные элементы и/или гены, представляющие интерес6. Полученный в результате рекомбинантный AAV (rAAV) с геномом сконструированного вектора (VG) широко используется в клинике для генной терапии человека и добился успеха11. Недооценено использование вектора в лабораторных условиях; rAAV могут эффективно достигать экспрессии трансгена в культивируемых клетках для удовлетворения экспериментальных потребностей исследователя12.
Наиболее распространенным методом получения rAAV является трансфекция тройной плазмиды в клетки HEK293 или 293T (рис. 1). Первая плазмида, обычно называемая цис-плазмидой, содержит желаемый трансген, окруженный ITR (pAAV). В зависимости от области применения, цис-плазмиды с общими элементами, такими как сильные промоторы или инструменты на основе CRISPR, доступны для покупки. Вторая — это плазмида pRep/Cap, которая содержит гены AAV rep и cap дикого типа, предоставленные в транс-виде, т. е. на отдельной, не содержащей ITR плазмиде, экспрессирующей регуляторные и структурные элементы, которые затем взаимодействуют с цис-плазмидой, и поэтому называется транс-плазмидой. Помимо физического заключения VG, капсид влияет на клеточный тропизм12,13. Предоставляя серотип-специфичный ген кэпа в трансе, исследователи легко могут максимизировать эффективность трансдукции, выбирая оптимизированный серотип капсида для данной клетки-мишени. Наконец, как иждидопарвовирусу, AAV требуется вирус-помощник для активации экспрессии rep/cap из его вирусных промоторов, что достигается аденовирусными генами-помощниками, обеспечиваемыми третьей плазмидой, такой как pAdΔF614,15. После 72 ч трансфекции тройной плазмиды вектор может быть высвобожден из клеток-продуцентов в питательную среду путем повторных циклов замораживания/оттаивания. Затем все содержимое планшета собирают, а крупный клеточный мусор удаляют центрифугированием; полученная надосадочная жидкость представляет собой сырой препарат rAAV, готовый к последующей трансдукции.
Рисунок 1: Обзор добычи сырого вектора rAAV. Производство и трансдукция сырой нефти rAAV может быть завершена в течение 5 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
rAAV может быть более благоприятным для доставки трансгена по сравнению с другими методами трансфекции, которые обычно ассоциируются с клеточной токсичностью, низкой эффективностью и дорогими реагентами и оборудованием, такими как электропорация или трансфекция на основе химикатов/липидов16,17. rAAV обходит эти препятствия и часто обеспечивает мощную экспрессию трансгена с минимальной токсичностью и минимальным количеством ручного труда. Важно отметить, что получение rAAV и его применение в клеточной культуре является простым процессом и редко требует очистки вектора от питательной среды (рис. 1). Кроме того, rAAV не интегрирует свой VG в геном хозяина, в отличие от доставки лентивирусного трансгена, и, таким образом, снижает риск инсерционного мутагенеза18. Несмотря на потенциальные преимущества использования rAAV для доставки трансгенов, необходимо учитывать ограничения. Важно отметить, что размер трансгена, включая РМЭ, не должен превышать 4,9 кбайт из-за физических ограничений капсида, тем самым ограничивая способность исследователя эффективно доставлять крупные регуляторные элементы и трансгены. Кроме того, поскольку rAAV является неинтегрирующим вирусом, трансдукция приводит к транзиторной экспрессии трансгена в делящихся клетках и может быть непрактичной для стабильной экспрессии. Тем не менее, методы, использующие двойные шаблоны Cas9, доставляемые rAAV, и шаблоны гомологии-направленной репарации (HDR), могут быть использованы для стабильной вставки последовательностей в определенные геномные локусы, еслиисследователь этого пожелает.
Protocol
1. Получение плазмид
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол клонирует интересующий ген (GOI) в ITR-содержащую плазмиду с промотором цитомегаловируса (ЦМВ) и последовательностью полиаденилирования SV40 (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). Тем не менее, эта плазмида может быть использована без дальнейшего клонирования для получения rAAV, упаковывая удобный двойной репортер EGFP и Luciferase. Плазмиды с различными регуляторными элементами или для различных применений, например, для экспериментов на основе CRISPR, доступны в Интернете и будут следовать тем же этапам клонирования, что и ниже (см. обсуждение дополнительных этапов клонирования). Кроме того, могут быть использованы rep/cap или транс-плазмиды для разных серотипов — этот протокол будет использовать rep/cap для серотипа AAV 2.
- Приобретите бактериальные таблетки, содержащие цис-плазмиду ITR, вспомогательную плазмиду аденовируса, плазмиду rep/cap и плазмиду, содержащую GOI. Нанесите бактерии на отдельные агаровые пластины, содержащие антибиотики, специфичные для резистентности каждой плазмиды. Инкубируйте бактерии при температуре 30 °C в течение ночи, чтобы они выросли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если плазмида с ГОИ недоступна для покупки, синтетический фрагмент ДНК (см. Таблицу материалов) можно приобрести в Интернете. Кроме того, при желании можно использовать синтетический фрагмент ДНК, чтобы пропустить весь процесс ПЦР. - Возьмите по одной колонии с каждой пластины и вырастите в 3 мл буфера Лурии Бертани (LB), дополненного соответствующим антибиотиком при 30 °C в течение ночи, встряхивая при 180 оборотах в минуту. Переложите 1 мл бактерий в стерильную колбу Эрленмейера объемом 250 мл, содержащую 50 мл буфера LB с добавлением соответствующего антибиотика. Встряхните при 30 °C, 180 об/мин в течение ночи.
- Переложите бактерии в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугу на 20 минут при температуре 3 000 x g при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость. Изолируйте плазмиду с помощью набора мидипрепов с низким или свободным содержанием эндотоксинов в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: РМЭ являются нестабильными структурами. Чтобы предотвратить делеции или мутации ITR, бактериальные клетки следует выращивать при 30 °C, чтобы замедлить деление клеток и смягчить ошибки репликации. Для увеличения выхода и чистоты плазмид идеально подходит набор midiprep или maxiprep. Рекомендуется использовать набор с низким или свободным содержанием эндотоксинов, чтобы уменьшить последующее загрязнение клеток эндотоксинами. Нет необходимости проводить выделение плазмид внутри ламинарного колпака, так как контаминация плазмидного препарата маловероятна, если она выполняется на стандартном стенде.
2. Клонирование интересующего гена в AAV ITR-содержащую плазмиду
- Откройте карту плазмиды, содержащую ГОИ, в программе для просмотра ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полная кассета, включая РМЭ, не должна превышать 4,9 кб из-за ограничений физической упаковки капсида. Кроме того, амплификация ПЦР не может быть достигнута с помощью РМЭ из-за вторичных структур. Таким образом, сборка Gibson не рекомендуется для клонирования трансгена rAAV.- Перейдите на вкладку Последовательность, чтобы отобразить полную последовательность плазмиды. Прокрутите до самой 5' области последовательности GOI и нажмите на первый нуклеотид , одновременно перетаскивая внутрь к телу гена, чтобы создать передний праймер. Выпускайте после достижения температуры плавления (Tm) ~55 °C.
- Нажмите кнопку Forward Primer. Вручную включите последовательность для сайта ограничения EcoRI (5' GAATTC 3') на самом 5' конце последовательности праймеров. Кроме того, добавьте шесть дополнительных случайных оснований на 5'-конце этого сайта рестрикции, чтобы фермент мог эффективно взаимодействовать с ДНК. Нажмите кнопку Добавить праймер. Репрезентативный пример приведен на рисунке 2.
- Проверьте праймер, чтобы убедиться, что он не может образовывать шпильки или димеры праймера (за исключением места рестрикции, которое является палиндромическим). Если образуются шпильки, измените случайную последовательность шести дополнительных оснований. Кроме того, убедитесь, что праймер не связывается где-либо еще на плазмиде.
- Повторите шаги, чтобы создать обратный праймер в самой 3'-области ГОИ внутрь к телу гена. Нажмите на Reverse Primer и включите сайт ограничения NotI (5' GCGGCCGC 3').
ПРИМЕЧАНИЕ: ГОИ не может содержать сайты рестрикции EcoRI или NotI – в этом случае необходимо использовать другие ферменты рестрикции.
- Амплифицируют ГОИ в реакции ПЦР 50 мкл. Используйте необходимые отдельные компоненты из таблицы 1.
- Поместите реакцию в амплификатор и следуйте параметрам цикла из таблицы 2 для программирования. Если праймеры имеют разную T m, используйте для программы нижнюю Tm.
- Проверьте амплификацию правильного фрагмента ПЦР, добавив 1 мкл красителя с загрузкой геля (6x) к 5 мкл реакции ПЦР. Запустите лестницу ДНК и смесь ПЦР на 0,8% агарозном геле, содержащем бромид этидия, и визуализируйте с помощью ультрафиолетового света.
ВНИМАНИЕ: Бромид этидия является известным мутагеном. - Если на геле появляется одна специфическая полоса, очистите оставшийся продукт ПЦР в пробирке для ПЦР-полосок с помощью набора для очистки ПЦР на основе колонки в соответствии с инструкциями производителя. Если появляется несколько полос (из-за неспецифической амплификации), иссеките нужную полосу и очистите ДНК с помощью набора для гелевой экстракции в соответствии с инструкциями производителя.
- Дигестируют очищенный продукт ПЦР и основную плазмиду pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 в реакции 50 мкл с требуемыми отдельными компонентами из таблицы 3 в течение 1 ч при 37 °C. Требуется большее количество плазмидной ДНК pAAV из-за ожидаемого неэффективного восстановления после экстракции геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые ферменты рестрикции являются высокоточными (HF) версиями. Обычный NotI нельзя использовать с буфером CutSmart. Если используются разные ферменты, может потребоваться другая температура инкубации и буфер.- Очистите переваренный продукт ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР на основе колонки в соответствии с инструкциями производителя.
- Готовят переваренную основную плазмиду pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 для гель-электрофореза, добавляя 10 мкл красителя с загрузкой геля (6x) к 50 мкл реакции пищеварения. Нагружают лестницу ДНК, реакцию пищеварения и 250 нг непереваренной плазмиды (отрицательный контроль) на 0,8% агарозный гель, содержащий бромид этидия, с широкими зубьями. Визуализируйте с помощью ультрафиолетового света, вырежьте нужный фрагмент (~4,5 kb) и очистите ДНК с помощью набора для гелевой экстракции в соответствии с инструкциями производителя.
- Лигируют переваренный продукт ПЦР и расщепленную основную плазмиду pAAV в реакции лигирования 20 мкл с требуемыми отдельными компонентами из таблицы 4. Чтобы рассчитать необходимое количество ПЦР-продуктов, воспользуйтесь формулой 1. Как правило, используют молярное соотношение продукта ПЦР (вкладыша) к основному (pAAV) с массой 50 нг основы.
Формула 1 - Выполните отрицательный контроль, заменив ПЦР-продукт водой. Инкубируют реакции лигирования при 16 °C в течение ночи или при комнатной температуре в течение 2 ч.
- Разморозьте флакон с компетентными бактериальными клетками с дефицитом рекомбинации (например, клетками Stbl3) на льду и поместите 50 мкл в пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 3 мкл реакции лигирования непосредственно на клетки и инкубируйте на льду в течение 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: РМЭ являются нестабильными структурами и поэтому требуют бактериальных штаммов с дефицитом рекомбинации для ограничения событий делеции и рекомбинации РМЭ. Клетки DH5α можно использовать с перерывами для размножения (один или два раза), но не рекомендуется для длительного использования. Целостность ИТР следует регулярно проверять после очистки мидипрепа.- Подвергнуть бактерии тепловому шоку на водяной бане с температурой 42 °C в течение 30 с, затем немедленно перенести на лед на 2 мин. Добавьте 200 мкл буфера LB и встряхивайте в течение 1 ч при 30 °C, 180 об/мин.
- Распределите 125 мкл смеси на агаровую пластину с соответствующим антибиотиком и инкубируйте в течение ночи (~18 ч) при 30 °C. Выберите несколько клонов и поместите каждый в стерильную пластиковую культуральную пробирку с 3 мл LB, содержащей соответствующий антибиотик. Инкубировать в течение ночи при встряхивании при 30 °C, 180 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить делеции или мутации ITR, бактериальные клетки следует выращивать при 30 °C, чтобы замедлить деление клеток и смягчить ошибки в репликации. Кроме того, следует выбирать более мелкие колонии, так как колонии, не имеющие РМЭ, могут иметь преимущество в росте по сравнению с другими. - Пипетку по 1,8 мл каждой культуры в пробирку объемом 2 мл и центрифугу при 6 000 x g в течение 3 мин при комнатной температуре. Изолируйте ДНК с помощью набора miniprep. Оставшиеся 1,2 мл культуры хранят при температуре 4 °C. Проверяйте правильность клонов с помощью секвенирования ДНК или диагностического переваривания ферментов рестрикции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать последовательность вставки по Сэнгеру, но процессивность с помощью РМЭ не может быть достигнута стандартными методами. РМЭ должны быть проверены с помощью дайджеста ограничений, как описано ниже. - Добавьте 50 мл буфера LB, содержащего соответствующий антибиотик, в стерильную колбу Эрленмейера объемом 250 мл. Добавьте 500 мкл оставшейся культуры в колбу и встряхивайте при 30 °C, 180 об/мин до достижения наружного диаметра600 0,2-0,5 (~18 ч). Переложите бактерии в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугу на 20 мин при температуре 3 000 x g, 4 °C. Изолируйте ДНК с помощью набора мидипрепов с низким или свободным содержанием эндотоксинов.
- Проверьте целостность ITR с помощью 20 мкл диагностического фермента рестрикции с помощью XmaI (или SmaI). Приготовьте реакцию, содержащую 500 нг плазмиды, 0,5 мкл фермента и 1x буфер; инкубируют в течение 1 ч при 37 °С. Запустите реакцию на 0,8% агарозном геле. Если РМЭ не повреждены, то при расщеплении будет получена полоса размером ~2,9 кб и другая полоса размером с кассету. Если эта четкая полоса не наблюдается, ITR может быть не поврежден, и клонирование придется делать заново.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмиды, содержащие сайты рестрикции XmaI (или SmaI) (в дополнение к тем, которые содержатся в ITR), будут иметь дополнительные полосы, появляющиеся на геле.
Формула 1
Рисунок 2: Репрезентативный пример дизайна грунтовки. Прямая и обратная конструкция праймера для трансгена mScarlet (репрезентативный пример). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Количество | Компонент |
| Х мкл | Матричная ДНК (25 нг) |
| 1 мкл | Праймер F (10 мкМ) |
| 1 мкл | Праймер R (10 мкМ) |
| 1 мкл | dNTP (10 мМ) |
| 10 мкл | Буфер Phusion (5x) |
| 1 мкл | Фузион-полимераза |
| Х мкл | Вода |
| 50 мкл | Окончательный том |
Таблица 1: Реагенты для амплификации ПЦР. Необходимые компоненты для успешной ПЦР-реакции.
| Шаг | Температура | Время |
| Начальная денатурация | 98 °С | 1 мин. |
| 30 циклов | 98 °С | 10 с |
| Тм грунтовки | 30 с | |
| 72 °С | 30 с на КБ | |
| Окончательное продление | 72 °С | 10 мин |
| Держать | 4 °С | неопределённо |
Таблица 2: Программирование амплификации ПЦР. Необходимые параметры цикла для успешного проведения ПЦР-реакции.
| Количество | Компонент |
| Х мкл | Продукт ПЦР (1 мкг) или плазмида pAAV (3 мкг) |
| 5 мкл | Буфер (10x) |
| 1 мкл | ЭкоРИ-ХФ |
| 1 мкл | NotI-HF |
| Х мкл | Вода |
| 50 мкл | Окончательный том |
Таблица 3: Реагенты для сбраживания. Необходимые компоненты для успешной реакции пищеварения.
| Количество | Компонент |
| Х мкл | Вставка (X ng) |
| Х мкл | Магистраль (50 нг) |
| 2 мкл | Буфер ДНК-лигазы T4 (10x) |
| 1 мкл | ДНК-лигаза Т4 |
| Х мкл | Вода |
| 20 мкл | Окончательный том |
Таблица 4: Лигирующие реактивы. Необходимые компоненты для успешной реакции лигирования.
3. Получение векторов с помощью трансфекции тройной плазмиды
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие значения оптимизированы для одной лунки из 6-луночной пластины, которая дает окончательный объем подготовки сырой нефти 2 мл. Все значения могут быть увеличены в 10 раз для планшета диаметром 15 см с конечным объемом 20 мл или уменьшены в 4 раза для 24-луночного планшета с конечным объемом 500 мкл.
- Приготовьте 1 мкг/мкл полиэтиленимина гидрохлорида (PEI) MAX, растворив 100 мг PEI MAX в 100 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте pH до 7,1 с помощью NaOH. Процеживают смесь фильтром 0,22 мкм и замораживают 1 мл аликвоты при -20 °C для длительного хранения. После размораживания храните реагент в течение 1 месяца при температуре 4 °C.
- Высевают 3 x 10 5 HEK293 или HEK293T клеток в 6-луночную планшет с предварительно подогретой модифицированной орлиной средой Dulbecco (DMEM,4,5 г/л глюкозы, 110 мг/л пирувата натрия) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Доведите до ~75%-90% слияния в инкубаторе, установленном при температуре 37 °C и 5%CO2 (рис. 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Было замечено, что клетки, культивируемые с помощью пенициллина/стрептомицина (P/S), снижают выход вектора. Использование надлежащей стерильной техники позволяет избежать необходимости использования P/S, и поэтому не рекомендуется культивировать клетки HEK293 с антибиотиком20. Если P/S требуется в последующих трансдукциях, рекомендуется добавлять P/S в сырую подготовку после сбора урожая. - В пробирке объемом 2 мл готовят смесь, содержащую 1,3 мкг pAAV2/2 (Rep/Cap, серотип 2), 1,3 мкг pAAV.GOI, 2,6 мкг pAdΔF6 и безсывороточный (SF) DMEM (4,5 г/л глюкозы, 110 мг/л пирувата натрия) в общем объеме 100 мкл (см. Дополнительную таблицу 1 для удобных расчетов).
- Подготовьте отрицательный контроль в отдельной пробирке, заменив pRep/Cap любой неродственной плазмидой. Отрицательный контроль учитывает наличие в сыром препарате неупакованной плазмиды pAAV.GOI, которая, возможно, трансфицирует клетки во время трансдукции, хотя и редко.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида maxiprep или midiprep с низким или свободным от эндотоксинов идеально подходит для тройной трансфекции и, как правило, дает более высокий титр вектора по сравнению с ДНК miniprep, хотя ДНК miniprep может быть использована для быстрого предварительного тестирования. - Добавьте 5,2 мкл PEI MAX в плазмидную смесь; это смесь плазмиды:ПЭИ с соотношением 1:1. Хорошо перемешайте, пульсируя 10-15 раз на вихревом миксере, установленном на 7. Если производится несколько векторных препаратов, добавляйте PEI в каждую смесь плазмид с интервалом времени в 1 мин (т.е. препарат 1 при t = 0 мин, препарат 2 при t = 1 мин и т. д.), чтобы обеспечить достаточное время для аспирации лунок и разбавления реакции на следующих стадиях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение плазмида и ПЭИ 1:1 считается оптимальным. Тем не менее, отдельные пользователи могут оптимизировать это соотношение для максимальной эффективности. О том, как выполнить оптимизацию PEI, см. обсуждение (см. также Дополнительную таблицу 2). - Инкубируйте каждую пробирку ровно 15 минут, а затем разбавьте реакцию 1,9 мл SF DMEM (4,5 г/л глюкозы, 110 мг/л пирувата натрия) до окончательного объема 2 мл. Аккуратно пипеткой 2 раза перемешать. Чрезмерное смешивание разрушает комплексы Plasmid/PEI и приводит к снижению эффективности трансфекции.
- Отсасывайте среду из лунки и осторожно добавляйте смесь плазмид и PEI по бокам лунки, чтобы предотвратить отслоение клеток. Инкубируют клетки в течение 72 ч при 37 °C и 5%CO2. Лизис и отслоение клеток во время инкубации является нормальным процессом производства rAAV (рис. 4).
Рисунок 3: Клетки HEK293, готовые к трансфекции. Идеальное слияние (75%-90%) клеток HEK293, необходимых для трансфекции тройной плазмиды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Клетки HEK293 после трансфекции. Появление клеток HEK293 до и через 1, 2 или 3 дня после трансфекции с pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 и соотношением плазмида:PEI 1:1. Масштабные линейки: 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Заготовка сырых векторных препаратов
- Замораживают всю пластину трансфицированных клеток в течение 30 мин при -80 °С, затем размораживают в течение 30 мин при 37 °С. Повторите в общей сложности три цикла замораживания/оттаивания. Не снимайте крышку — тарелка должна оставаться стерильной внутри. Пластины могут оставаться при температуре -80 °C до тех пор, пока они не будут готовы к следующим этапам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для размораживания лучше всего подходит неувлажненный инкубатор, который сводит к минимуму образование конденсата на внешней стороне планшетов, что может привести к случайному загрязнению. - Выполните следующие два шага в ламинарном колпаке с использованием асептических методов. Перемешайте каждую лунку с помощью пипетирования, чтобы обеспечить максимальное разрушение клеток. Переложите лизат в пробирку объемом 2 мл и центрифугу на 15 минут при 15 000 x g, комнатной температуре для удаления клеточного мусора.
- Осторожно переложите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 2 мл. Этот сырой препарат может быть использован немедленно, без титрования или очистки. Vector может храниться при температуре 4 °C в течение нескольких месяцев или -20 °C в течение многих лет.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости титры могут быть рассчитаны методом количественной ПЦР (кПЦР) путем количественного определения количества векторных геномов (VG) внутри ДНКаз-резистентных частиц. Таким образом, титры указываются в единицах VG/мл. Вектор, хранящийся в течение нескольких месяцев при 4 °C, следует повторно титровать перед использованием, так как вектор может агрегировать и/или связывать стенки пробирки, снижая титр препарата.
5. Трансдукция
- Поместите нужный тип ячейки (например, Huh7) в 96-луночный планшет при целевом слиянии 50%-75%, в зависимости от продолжительности трансдукции. Большее слияние может привести к снижению эффективности трансдукции AAV.
- Добавляйте вектор (например, CMV.mScarlet) в клетки, не зная титра сырого препарата, для применений, где доза не имеет значения, например, для тестирования панели капсидов на трансдукцию в новом типе клеток. Выполните серию разбавлений сырой заготовки в соотношении 1:3 в безсывороточной среде (SF) для получения оптимального количества вектора, необходимого для применения. Отсасывайте среду из 96-луночного планшета и добавляйте в скважины 50-100 мкл разбавленной подготовки сырой нефти. Инкубируют клетки при температуре 37 °C и 5%CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка может содержать антитела, которые могут нейтрализовать вектор AAV и снижать эффективность трансдукции. Тем не менее, сыворотка может быть использована во время трансдукции для чувствительных типов клеток. - Удалить вектор через 48 ч после трансдукции (hpt) и промыть клетки один раз предварительно подогретым фосфатно-солевым буфером (PBS). Векторы также могут быть удалены и заменены средами, содержащими сыворотку, уже через 2 hpt для чувствительных типов клеток. Во многих случаях проводят ночную инкубацию для трансдукции клеток, а утром заменяют лунки свежими средами, содержащими сыворотку. Надежные типы ячеек, такие как Huh7 и U2-OS, не требуют замены среды.
- Прервать трансдукцию путем фиксации клеток в 4% параформальдегиде (PFA) на 10 мин. В зависимости от области применения также могут использоваться различные методы прерывания (например, лизис). Для большинства типов клеток пик экспрессии приходится на 48 hpt и, таким образом, является общей экспериментальной конечной точкой.
6. Вариации метода трансдукции в зависимости от типа клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Для разных типов клеток требуются разные условия культивирования. Поэтому добавление вектора для трансдукции должно быть оптимизировано исходя из потребностей типа клетки. Ниже приведены очень специфические протоколы трансдукции для типов клеток, включенных в репрезентативные результаты, иллюстрирующие некоторые варианты протоколов трансдукции, которые исследователь может захотеть попробовать для своих собственных нужд.
- Органоиды тонкого кишечника мыши
- Получение органоидов тонкого кишечника (mSIO) мышей из тонкокишечной крипты мышей C57BL/6J. Встраивают органоиды в 90% матрицу базальной мембраны и культивируют в 24-луночные планшеты, содержащие либо органоидную питательную среду (без антибиотиков), либо претрансдукционную среду (50% Wnt3a-кондиционированную среду [произведенную на собственном производстве с использованием клеток L Wnt-3A в органоидной питательной среде], 10 мМ никотинамида, 10 мкМ ингибитора ROCK и 2,5 мкМ CHIR99021) в течение одного пассажа (5-7 дней) перед трансдукцией при 37 °C и 5% CO2.
- Перед трансдукцией органоиды промывают D-PBS, разрушают матричные купола базальной мембраны путем пипетирования и диссоциируют органоиды на небольшие клеточные кластеры, инкубируя их в диссоциационной среде в течение 10 мин при 37 °C и далее пипетируя.
- Остановите процесс диссоциации клеток, добавив 5% FBS в DMEM/F-12 с 15 мМ HEPES, перенесите кластеры клеток в центрифужные пробирки и собирайте клеточные кластеры центрифугированием в течение 5 минут при 1000 x g, комнатной температуре.
- Ресуспендировать клеточные кластеры в трансдукционной среде (претрансдукционная среда, содержащая 10 мкг/мл полибрена, или органоидная питательная среда, содержащая 10 мкг/мл полибрена) и перенос в 48-луночные планшеты с последующим добавлением сырых препаратов AAV, упакованных в CMV.mScarlet для трансдукции.
- Проводят трансдукцию органоидов, центрифугируя планшет в течение 1 ч при 600 x g и 37 °C, а затем инкубируют при 37 °C еще 6 ч. Трансдуцированные органоиды собрать в пробирки для микроцентрифуг объемом 1,5 мл, центрифугировать в течение 5 мин при 1000 x g, комнатной температуре и положить на лед.
- После удаления надосадочной жидкости ресуспендировать трансдуцированные органоиды в 90% матрице базальной мембраны в претрансдукционной среде или органоидной питательной среде и капли семян по 20 мкл в одну лунку предварительно подогретого камерного покровного стекла.
- После инкубации в течение 10 мин в инкубаторе поместить каплю в 350 мкл среды для претрансдукции или органоидной питательной среды и инкубировать при 37 °C в инкубаторе. Определяют эффективность трансдукции через 2-5 дней после трансдукции, визуализируя трансдуцированные органоиды на конфокальном микроскопе и оценивая процентное соотношение красных флуоресцентных клеток на органоид.
- Ячейки BeWo
- За 24 ч до трансдукции пластинчатые клетки плацентарной хориокарциномы человека BeWo по 10 000 клеток на лунку 96-луночного планшета. Развести сырые препараты AAV в упаковке CMV.mScarlet до 1:1 в безсывороточной среде F12-K BeWo до общего объема 50 мкл на лунку. Отсасывайте среду из скважины и заменяйте разбавленным AAV на 50 мкл на лунку.
- Инкубируют клетки при 37 °C в течение ночи (~18 ч), а затем добавляют 100 мкл среды F12-K BeWo, содержащей 10% FBS, чтобы довести общий объем до 150 мкл. Инкубируйте клетки еще 6 ч, в общей сложности 24 ч после трансдукции (hpt).
- Для визуализации окрасьте живые клетки красителем Hoechst в течение 30 минут в среде F12-K, затем замените среду на безфеноловый DMEM, содержащий 10% FBS, 1x добавку глутамакса и 1x добавку пирувата натрия для визуализации. Проводите визуализацию живых клеток на конфокальном микроскопе с использованием наборов фильтров DAPI (для визуализации Хёхста) и mCherry (для визуализации mScarlet) с температурой 37 °C и 5% CO2.
- Клетки Hepa1-6 и Huh7
- Пластинчатые клетки печени мышей Hepa1-6 и клетки печени человека Huh7 в DMEM (4,5 г/л глюкозы, 110 мг/л пирувата натрия, 10% FBS) при 5000 клеток на лунку 96-луночного планшета за 24 ч до трансдукции.
- Добавляют 50 мкл неразбавленных сырых препаратов AAV, упаковывающих CMV.mScarlet, непосредственно в клетки и инкубируют при 37 °C в течение 48 ч. Промойте клетки один раз в PBS, закрепите в 4% PFA и покрасьте красителем Hoechst в течение 10 минут. Проводите визуализацию на конфокальном микроскопе с помощью наборов фильтров DAPI (для визуализации Hoechst) и mCherry (для визуализации mScarlet).
- Ячейки C2C12 и HSkMC
- Пластинчатые недифференцированные миобласты мышей C2C12 и недифференцированные миобласты первичных скелетных мышечных клеток человека (HSkMC) при 5000 клетках на лунку 96-луночной пластины, за 72 ч до трансдукции.
- Разбавляют сырые препараты AAV в упаковке CMV.mScarlet до 1:1 в DMEM (4,5 г/л глюкозы, Penn/Streps, 20% FBS) для миобластов C2C12 или среды для роста скелетных мышц для миобластов HSkMC. Дифференциация миобластов HSkMC в миотрубки путем замены среды на дифференцировочную среду.
- Инкубируют миобласты и миотрубки в разбавленных препаратах AAV в течение 24 ч при 37 °C. Окрасьте живые клетки красителем Hoechst в течение 10 минут и получите изображение на конфокальном микроскопе с помощью наборов фильтров DAPI (для визуализации по методу Хёхста) и mCherry (для визуализации mScarlet).
Representative Results
Поиск оптимального капсида для трансдуцирования культивируемых клеток, представляющих интерес
Для определения тропизма различных серотипов капсида были трансдуцированы различные типы клеток (рис. 5). Природные серотипы AAV214, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24 и сконструированные варианты капсида Anc80 25, DJ 26, LK0327 иKP1 28 были упакованы с векторным геномом, экспрессирующим mScarlet, под промотором ЦМВ, клонированным с использованием методов, предусмотренных в этом протоколе. Нетитрированные сырые векторные препараты разводили в соответствующих питательных средах, а клетки трансдуцировали в течение 24+ ч и визуализировали (рис. 5B). Эффективность трансдукции рассчитывали по доле всех клеток, которые были mScarlet+, или доле клеток в одной z-плоскости, которые были mScarlet+ (для органоидов тонкой кишки мышей; Рисунок 5В). Эффективность трансдукции (клетки mScarlet+) не обеспечивается для дифференцированных миотрубок C2C12 и HSkMC, а для недифференцированных миобластов C2C12 и HSkMC (рис. 5A).
AAV2 и KP1 были наиболее мощными серотипами по всем исследуемым клеточным линиям (рис. 5A). Также было замечено, что сходные типы клеток, происходящие от разных видов, трансдуцируются с разной эффективностью. Например, Hepa1-6 (линия клеток печени мышиного происхождения) демонстрирует заметное снижение трансдукции по сравнению с Huh7 (линия клеток печени человека) при использовании AAV2 (рис. 5B). Кроме того, во время трансдукции важную роль играют различные условия среды. Мышиные органоиды тонкой кишки (mSIO), культивируемые в претрансдукционных средах, менее эффективно трансдуцируются по сравнению с теми, которые культивируются в органоидных питательных средах (рис. 5C). Кроме того, AAV2 эффективно трансдуцирует недифференцированные миобласты HSkMC и дифференцированные миотрубки HSkMC (рис. 5B), хотя количественный анализ миотрубок затруднен и поэтому не проводится.
Высокая эффективность трансдукции, наблюдаемая для различных типов клеток на рисунке 5 , показывает, что сырые векторные препараты могут быть эффективно использованы для трансдукции различных типов клеток без дополнительных этапов, таких как очистка и титрование. Тем не менее, при выборе капсида следует уделять особое внимание, чтобы максимизировать доставку трансгена. Многие другие клеточные линии и капсиды были ранее протестированы и опубликованы, хотя и с очищенными векторными препаратами12.
Независимый от векторных частиц эффект условий среды может влиять на эффективность трансдукции. Тем не менее, принято считать, что тропизм (т.е. специфическое поглощение и экспрессия вектора в зависимости от типа клетки) является свойством, специфичным для капсида29. Сравнения между подобранными по дозе сырыми и очищенными препаратами пока не наблюдалось влияния на клеточный тропизм. Таким образом, сырые векторные препараты можно использовать так же, как и очищенные векторы в клеточной культуре.
Рисунок 5: Грубая векторная трансдукция различных типов клеток . (A) Процентное содержание mScarlet+ после добавления различных векторов AAV, содержащих трансген mScarlet . (B) Клетки, экспрессирующие mScarlet , полученные из AAV серотипа 2. Масштабные линейки: 100 мкм (Hepa1-6, Huh7, C2C12 и HSkMC), 200 мкм (BeWo), 20 мкм (mSIO). Сокращения: hpt = часы после трансдукции. (C) Органоиды тонкой кишки мышей (mSIO) обрабатывались либо rAAV в среде до трансдукции, либо в среде для выращивания органоидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительная таблица 1: Рабочий лист по трансфекции тройной плазмиды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 2: Рабочий лист оптимизации PEI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Клонирование
Протокол клонирования не ограничивается плазмидой pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, использованной выше, и может быть легко изменен в зависимости от экспериментальных потребностей исследователя. Многие плазмиды, содержащие ITR, легко доступны для покупки в Интернете. Например, плазмиды, содержащие как Cas9, так и сайт клонирования sgRNA, доступны, но требуют нескольких дополнительных этапов, таких как олигонуклеотидный отжиг и обработка PNK30. Кроме того, могут быть обнаружены плазмиды, содержащие множественный сайт клонирования (MCS) только с РМЭ и без внутренних регуляторных элементов31. Если необходимо использовать различные плазмиды, рестриктазы (РЭ), используемые для пищеварения, как правило, являются единственными элементами, которые могут потребоваться изменить в этом протоколе. Однако ограничением rAAV является его ограниченная грузоподъемность. Из-за физических ограничений капсида векторный геном не должен превышать 4,9 кб, включая РМЭ.
При выделении плазмиды из бактерий крайне важно использовать набор мидипрепов или макситрепов с низким или свободным содержанием эндотоксинов, чтобы уменьшить вред клеткам во время трансфекции или трансдукции тройной плазмиды. Плазмиды из наборов miniprep часто содержат более высокие примеси, пониженные концентрации и меньшее количество суперспиральной ДНК, что может повлиять на последующее производство rAAV и поэтому не рекомендуется.
Очень важно понимать структуру и свойства РМЭ при клонировании. Во-первых, крайне сложно использовать ПЦР через ИТР. Следует избегать клонирования, требующего ПЦР-амплификации с помощью РМЭ, а также дополнительно ограничить использование метода клонирования сборки Гибсона. Таким образом, клонирование ферментом рестрикции является предпочтительным методом клонирования в плазмиды, содержащие ITR. Кроме того, некоторые праймеры для секвенирования по Сэнгеру могут быть несовместимы, если секвенированная область содержит ITR. Вместо этого рекомендуется использовать праймеры, которые секвенируются от РМЭ в тело векторного генома, чтобы получить более точные результаты секвенирования. Во-вторых, РМЭ склонны к делециям, перестройкам и мутациям при трансформации в бактерии для амплификации плазмид32,33. Чтобы смягчить эти явления, рекомендуется использовать компетентные бактериальные штаммы с дефицитом рекомбинации, такие как Stbl3, и инкубировать их при 30 °C, чтобы замедлить клеточное деление. Наконец, было замечено, что меньшие колонии могут соответствовать клонам без перегруппировок или делеций, так как колонии без РМЭ могут давать преимущество в росте и быть крупнее. Поэтому рекомендуется подбирать небольшие колонии.
Векторное производство
На успешное производство вектора rAAV могут влиять несколько элементов. Одним из важнейших факторов является здоровье клеток HEK293 или 293T, используемых для трансфекции. Как правило, низкое число пассажей является идеальным, так как клетки с высоким пассажем могут демонстрировать генотипические и фенотипические дисперсии, которые могут снижать титры rAAV. Кроме того, плотность засеянных клеток должна составлять 75%-90% слияния для эффективного производства. Разреженные клетки дают низкий выход векторов, потому что для производства векторов доступно меньше клеток, в то время как разросшиеся клетки не будут эффективно трансфицироваться.
Различия между партиями реагентов, запасами клеток и общая вариабельность от лаборатории к лаборатории вносят свой вклад в различия в эффективности трансфекции и титре производства. Одним из оптимизируемых факторов, который может привести к улучшению титра, является соотношение плазмиды и PEI в реакциях трансфекции. Очень важно использовать свежий (<1 месяц) PEI MAX. В качестве отправной точки рекомендуется использовать соотношение плазмид и PEI 1:1, и если трансфекция или эффективность трансдукции кажутся плохими, протестируйте несколько различных соотношений. Оптимизация титра проще всего, если использовать трансген с визуальным считыванием, такой как репортерный транген CMV.Luc.IRES.EGFP, используемый здесь в качестве исходного материала для клонирования. Чтобы выполнить оптимизацию, выполните шаг протокола 3 с использованием 12-луночного планшета и уменьшите массы плазмид и объемы реагента на два (конечная масса плазмиды составляет 2,6 мкг). Отрегулируйте объем PEI в соответствии с соотношением в диапазоне от 1:0,75 до 1:3 с увеличением на 0,25 (рис. 6). Разбавляйте каждую реакцию 950 мкл СФ-среды через 15 мин. Для удобства можно приготовить мастер-смесь, содержащую тройные плазмиды, и индивидуально дозировать ее в пробирки по 1,5 мл перед добавлением PEI (см. Дополнительный файл 2). Соберите вектор, преобразуйте интересующие вас ячейки и изображение. Лунка с наибольшей трансдукционной эффективностью (доля клеток GFP+) соответствует наибольшему титру и наиболее оптимальному соотношению PEI:DNA.
Рисунок 6: Рабочий процесс оптимизации PEI. Схема шагов, необходимых для оптимизации PEI. Множественные соотношения плазмид: PEI тестируются для определения оптимального соотношения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рекомендации по сбору урожая и титру
Метод замораживания/размораживания, используемый для получения вектора rAAV, эффективно лизирует клетки HEK293 способом, совместимым с прямым использованием осветленного лизата для трансдукции культивируемых клеток. Некоторые серотипы rAAV, такие как AAV1, AAV8 и AAV9, высвобождаются из клеток во время производства векторов и могут быть извлечены из культивируемой клеточной среды без циклов замораживания/оттаивания34. Описанный здесь метод обычно дает титры порядка 1 x 10 10 VG/мл при использовании капсидов AAV2 и 1 x10 11 VG/мл для AAV8. В то время как более высокие титры могут быть достигнуты с помощью лизиса детергента или другого химического вещества, они вредны для клеток при последующем использовании и требуют дополнительной очистки rAAV от лизата. Более низкий титр является одним из компромиссов, который исследователь должен учитывать при определении того, подходят ли сырые препараты для их исследовательских нужд, однако незначительно более низкие титры, полученные описанными здесь методами, могут очень хорошо трансдуцировать многие типы клеток (см. репрезентативные результаты). В дополнение к эффективности трансфекции и здоровью клеток, титры векторов варьируются в зависимости от капсида, используемого во время производства rAAV, а также от размера и последовательности трансгена в VG35.
При сборе сырых векторных препаратов может присутствовать плазмидная ДНК, которая использовалась во время трансфекции тройной плазмиды, и, хотя и редко, она приводит к последующей трансфекции во время трансдукции. Кроме того, неупакованные VG могут связываться с внешней стороной капсидов и вызывать врожденный иммунный ответ на голую и чужеродную одноцепочечную ДНК36,37. Таким образом, чувствительным типам клеток может потребоваться расщепление и очистка векторных препаратов с помощью ДНКазы для удаления неупакованных VG и плазмид.
Если кто-то хочет рассчитать титр сырого препарата, можно выполнить количественную ПЦР для количественного определения количества упакованных VG внутри ДНКаза-резистентных частиц (DRP). Вкратце, небольшое количество сырого препарата расщепляется ДНКазой для удаления плазмидной ДНК, загрязняющей нуклеиновые кислоты, или частично упакованного VG. Затем образец подвергают кПЦР и количественно определяют защищенный VG внутри DRP, в результате чего получают титр с единицами векторного генома на мл сырого препарата38. Не рекомендуется проводить векторное титрование с использованием ИФА-анализов, которые количественно определяют титры капсида. По сравнению с вирусом AAV дикого типа, rAAV страдает от доли пустых и частично упакованных капсидов39. ИФА количественно определяет все капсиды независимо от содержания их генома и переоценивает трансмиссивируемые единицы, присутствующие в препарате, для чего требуется упакованный VG.
Рекомендации по трансдукции
Многие факторы влияют на трансдукцию rAAV, и для любого нового эксперимента необходимо учитывать все необходимое. В зависимости от промотора, управляющего экспрессией трансгена, начало экспрессии может произойти уже через 4 ч после трансдукции (hpt), а пик экспрессии обычно достигается через 48 hpt. Важно помнить о продолжительности времени от первоначального посева клеток до экспериментальной конечной точки. Это необходимо для того, чтобы оценить начальное слияние клеток и убедиться, что они не разрастаются к концу эксперимента. Если клетки становятся чрезмерно сливающимися, клеточное поведение может быть изменено из-за стрессовой реакции и может исказить результаты экспериментов. Некоторые типы клеток, такие как U2-OS, могут довольно хорошо переносить чрезмерный рост/ингибирование контакта. Кроме того, они могут выдерживать длительные периоды времени (48 ч+) в кондиционированной среде без сыворотки, что является продуктом этого производственного протокола. Тем не менее, чувствительные типы клеток могут потребовать добавления сыворотки или разбавления сырого препарата специальной питательной средой для поддержания здоровья во время трансдукции. Незначительное снижение эффективности трансдукции при использовании сывороточных сред является потенциальным компромиссом для здоровья клеток и должно быть рассмотрено исследователем.
Как правило, для быстро делящихся ячеек начальное слияние около 50% является оптимальным для приложений, которые будут завершаться на 48 hpt. Тем не менее, слияние может быть скорректировано соответствующим образом в зависимости от потребностей эксперимента. Не рекомендуется трансдуцировать монослойные иммортализированные клеточные линии более 75% слияния из-за снижения эффективности трансдукции. Большинство типов культивируемых клеток успешно трансдуцируются и становятся здоровыми после ночной инкубации сырыми препаратами rAAV с последующей сменой на свежие сывороточные среды утром.
Серотип капсида является важным фактором, который следует учитывать при продуцировании rAAV для трансдукции клетки-мишени, поскольку капсид является основным детерминантом клеточного тропизма и последующей экспрессии трансгена13. AAV2 является широко используемым серотипом из-за его способности эффективно трансдуцировать многие типы культивируемых клеток12. Это свойство AAV2 может быть связано с протеогликанами гепаринсульфата (HSPG), служащими первичным фактором присоединения к AAV2, и высокими уровнями HSPG на культивируемых клетках от адаптации до выращивания в чашке40. Другие капсиды, такие как AAV9, менее эффективны при трансдуцировании широких типов клеток и могут быть объяснены факторами привязанности, которые не выражены в этой настройке41. Таким образом, мы рекомендуем AAV2 в качестве капсида первого выбора в культивируемых клетках, если желаемая клетка-мишень ранее не была протестирована с rAAV в литературе.
Обратите внимание, что основным ограничением сырых векторных препаратов является то, что они не подходят для трансдукции животных моделей. Исследования in vivo требуют, чтобы препараты были очищены и прошли оценку качества.
Экспрессия трансгенов и вопросы потенциальной интеграции
rAAV не приводят к постоянной экспрессии трансгена. Со временем ВГ могут замолчать, и трансгенная экспрессия может быть прекращена после нескольких пассажей42. Кроме того, большинство VG остаются эпизодическими, а rAAV не содержат вирусных белков Rep, которые опосредуют частую интеграцию в геном хозяина, как при вирусной лизогенной инфекции дикого типа, или способствуют репликации VG43. В результате эписомы в трансдуцированных клетках в конечном итоге будут разбавлены дочерними клетками посредством деления.
Интеграция на базальном уровне возможна для всего поставляемого трансгенного материала ДНК. Однако ВГ, содержащие ИТР, склонны к интеграции на более высокой частоте44. Таким образом, перманентная экспрессия трансгена может наблюдаться в небольшом подмножестве клеток. Пользователи должны учитывать эту возможность, особенно при использовании rAAV для доставки ферментов, режущих ДНК, таких как Cas9, поскольку двухцепочечные разрывы могут привести к еще большей частоте интеграции ипостоянной экспрессии. Несмотря на то, что это делает rAAV хорошим кандидатом для доставки шаблонов репарации, направленных на гомологию, для эндогенного мечения или добавления генов, следует рассмотреть возможность вставки Cas919,46.
Disclosures
A.C.M. является консультантом компании Janssen Pharmaceuticals и входит в состав SAB компании NewBiologix. Все остальные авторы не имеют конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Acknowledgments
Мы благодарим Роберта Тьяна и Ксавье Дарзака за их поддержку и использование лабораторного оборудования. Мы благодарим Марка Кея (Mark Kay) за его подарок в виде плазмид KP1 и LK03 rep/cap, а также Люка Ванденберга (Luk Vandenberghe) за плазмиду AAV4 rep/cap. Финансирование было предоставлено Медицинским институтом Говарда Хьюза (34430, R. T.) и Калифорнийским институтом регенеративной медицины (California Institute for Regenerative Medicine Training Program) EDUC4-12790. Н.В. выражает признательность за финансирование со стороны Центра стволовых клеток Беркли в рамках постдокторской стипендии Siebel и Немецкого научно-исследовательского общества (DFG) в рамках стипендии Вальтера Бенджамина.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Snapgene DNA viewing sofrware | Snapgene | ||
| pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 | AddGene | 105533 | |
| pAAV2/2 (Rep/Cap) | AddGene | 104963 | |
| pAdΔF6 | AddGene | 112867 | |
| LB Agar Carbenicillin | Sigma-Aldrich | L0418 | |
| Boekel Scientific Economy Digital Incubator | Boekel Scientific | 133000 | |
| LB medium, powder | MP Biomedicals | 113002042 | |
| Carbencillin (Disodium) | GoldBio | C-103-5 | |
| New Brunswick I26 Shaker | Eppendorf | M1324-0000 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22627040 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit | Qiagen | 12945 | |
| PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS | USA Scientific | 1402-3900 | |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6333000022 | |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| 5x Phusion Buffer | NEB | B0518S | Provided with purchase of Phusion Polymerase |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Gel Loading Dye, Orange (6X) | NEB | B7022S | |
| DNA Clean & Concentrator-100 | Zymo | D4029 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo | D4001 | |
| NotI-HF | NEB | R3189S | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| CutSmart Buffer (10x) | NEB | B6004S | Provided with purchase of restriction enzyme |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500100 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with purchase of T4 Ligase |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Precision Microprocessor Water Bath | Thermo Scientific | 51221046 | |
| Sterile Plastic Culture Tubes | Fisher Scientific | 149566B | |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tube | Thomas Scientific | 1149Y01 | |
| ZR Plasmid Miniprep - Classic | Zymo | D4015 | |
| Xma1 | NEB | R0180S | |
| Sma1 | NEB | R0141S | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Falcon 6-well | Corning | 353046 | |
| Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo-Fisher | 11995065 | |
| Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 Incubator | Marshall Scientific | MCO-18AIC | |
| PEI MAX (Polyethylenimine Hydrochloride) | Polysciences | 24765-100 | |
| Mixer Vortex Genie 2 | Electron Microscopy Sciences | 102091-234 | |
| Sanyo Ultra Low Freezer | Sanyo | 14656-15267-16219 | |
| INCU-Line IL 10 with transparent window | VWR | 390-0384 | |
| Eppendorf Microcentrifuges | Eppendorf | 05-400-005 | |
| Falcon 96-well | Corning | 353072 | |
| C57BL/6J mice | JAX | strain #000664 | |
| organoid growth medium | STEMCELL Technologies | 6005 | |
| L Wnt-3A cells | ATCC | CRL-2647 | |
| nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72052 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane | Fisher | 356231 | |
| 24-well plate | Fisher | 08-772-1 | |
| D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| TrypLE Express | Fisher | 12604013 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| polybrene | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-3D | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Fisher | 12-565-470 | |
| BeWo cells | ATCC | CCL-98 | |
| F-12K Medium | ATCC | 30-2004 | |
| Hepa1-6 | ATCC | CRL-1830 | |
| Huh7 | UC Berkeley BSD Cell Culture Facility | HUH-7 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| HSkMC | ATCC | PCS-950-010 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium | Sigma | C-23060 | |
| Skeletal Muscle Differentiation Medium | Sigma | C-23061 | |
| Invitrogen EVOS Digital Color Fluorescence Microscope | Fisher Scientific | 12-563-340 | |
| Perkin Elmer Opera Phenix | Perkin Elmer | HH14001000 | |
| PhenoPlate 96-well | Perkin Elmer | 6055302 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Thermo-Fisher | 31053028 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo-Fisher | 35050079 | |
| Sodium Pyruvate | Thermo-Fisher | 11360070 | |
| pAAV2/5 (Rep/Cap) | Addgene | 104964 | |
| pAAV2/8 (Rep/Cap) | Addgene | 112864 | |
| pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap) | Addgene | 130878 | |
| pAAV2/9n (Rep/Cap) | Addgene | 112865 | |
| pAnc80L65AAP | Addgene | 92307 | |
| KP1 (rep/cap) | gifted by Professor Mark Kay (Stanford University) | ||
| LK03 (rep/cap) | gifted by Professor Mark Kay (Stanford University) | ||
| pAAV4 (rep/cap) | gifted by Professor Luk Vandenberghe (Harvard Medical School) | ||
| pAAV.Cas9.sgRNA | Addgene | 61591 | |
| pAAV.MCS | Addgene | 46954 | |
| gBlock (synthetic DNA fragement) | IDT |
References
- Pillay, S., et al. Corrigendum: An essential receptor for adeno-associated virus infection. Nature. 539 (7629), 456 (2016).
- Nicolson, S. C., Samulski, R. J. Recombinant adeno-associated virus utilizes host cell nuclear import machinery to enter the nucleus. Journal of Virology. 88 (8), 4132-4144 (2014).
- Lundstrom, K.
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).
- Ling, C., et al. The Adeno-Associated Virus Genome Packaging Puzzle. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 9 (3), 175 (2015).
- Maurer, A. C., Weitzman, M. D. Adeno-Associated Virus Genome Interactions Important for Vector Production and Transduction. Human Gene Therapy. 31 (9-10), 499-511 (2020).
- Srivastava, A. Replication of the adeno-associated virus DNA termini in vitro. Intervirology. 27 (3), 138-147 (1987).
- Wang, X. S., Ponnazhagan, S., Srivastava, A. Rescue and replication of adeno-associated virus type 2 as well as vector DNA sequences from recombinant plasmids containing deletions in the viral inverted terminal repeats: selective encapsidation of viral genomes in progeny virions. Journal of Virology. 70 (3), 1668-1677 (1996).
- Earley, L. F., et al. Adeno-Associated Virus Serotype-Specific Inverted Terminal Repeat Sequence Role in Vector Transgene Expression. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 151-162 (2020).
- Yang, J., et al. Concatamerization of adeno-associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination. Journal of Virology. 73 (11), 9468-9477 (1999).
- Au, H. K. E., Isalan, M., Mielcarek, M. Gene Therapy Advances: A Meta-Analysis of AAV Usage in Clinical Settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2021).
- Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M.
- Meier, A. F., Fraefel, C., Seyffert, M. The Interplay between Adeno-Associated Virus and its Helper Viruses. Viruses. 12 (6), 662 (2020).
- Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes. Molecular Biotechnology. 28 (1), 21-32 (2004).
- Batista Napotnik, T., Polajzer, T., Miklavcic, D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochemistry. 141, 107871 (2021).
- McCarty, D. M., Young, S. M. Jr, Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
- Yang, Y., et al. A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice. Nature Biotechnology. 34 (3), 334-338 (2016).
- Stacey, G. N.
- Parks, W. P., Melnick, J. L., Rongey, R., Mayor, H. D. Physical assay and growth cycle studies of a defective adeno-satellite virus. Journal of Virology. 1 (1), 171-180 (1967).
- Bantel-Schaal, U., zur Hausen, H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site. Virology. 134 (1), 52-63 (1984).
- Gao, G. P., et al. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 99 (18), 11854-11859 (2002).
- Gao, G., et al. Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. Journal of Virology. 78 (12), 6381-6388 (2004).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Reports. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. Journal of Virology. 82 (12), 5887-5911 (2008).
- Lisowski, L., et al. Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model. Nature. 506 (7488), 382-386 (2014).
- Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610 (2019).
- Colon-Thillet, R., Jerome, K. R., Stone, D. Optimization of AAV vectors to target persistent viral reservoirs. Virology Journal. 18 (1), 85 (2021).
- Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
- Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. The Journal of Cell Biology. 202 (3), 579-595 (2013).
- Bi, X., Liu, L. F. DNA rearrangement mediated by inverted repeats. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 93 (2), 819-823 (1996).
- Samulski, R. J., Berns, K. I., Tan, M., Muzyczka, N. Cloning of adeno-associated virus into pBR322: rescue of intact virus from the recombinant plasmid in human cells. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 79 (6), 2077-2081 (1982).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Molecular Therapy. 7 (1), 122-128 (2003).
- Zhu, J., Huang, X., Yang, Y. The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice. The Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2388-2398 (2009).
- Wagner, H., Bauer, S. All is not Toll: new pathways in DNA recognition. The Journal of Experimental Medicine. 203 (2), 265-268 (2006).
- Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. Quantitative and Digital Droplet-Based AAV Genome Titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
- Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Therapy. 6 (7), 1322-1330 (1999).
- Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. Journal of Virology. 72 (2), 1438-1445 (1998).
- Bell, C. L., et al. The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2427-2435 (2011).
- McCown, T. J., Xiao, X., Li, J., Breese, G. R., Samulski, R. J. Differential and persistent expression patterns of CNS gene transfer by an adeno-associated virus (AAV) vector. Brain Research. 713 (1-2), 99-107 (1996).
- Weitzman, M. D., Kyostio, S. R., Kotin, R. M., Owens, R. A. Adeno-associated virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA and its integration site in human DNA. Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 91 (13), 5808-5812 (1994).
- Miller, D. G., Petek, L. M., Russell, D. W. Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites. Nature Genetics. 36 (7), 767-773 (2004).
- Hanlon, K. S., et al. High levels of AAV vector integration into CRISPR-induced DNA breaks. Nature Communications. 10 (1), 4439 (2019).
- Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 23 (10), 3558-3565 (2003).
