Summary
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)は、臨床および前臨床の遺伝子導入に広く使用されています。rAAVの用途としてはあまり評価されていませんが、精製を必要とせずに培養細胞を強力に形質導入できることです。rAAVに不慣れな研究者向けに、導入遺伝子カセットクローニング、粗ベクター産生、細胞培養形質導入のプロトコルを提供しています。
Abstract
組換えアデノ随伴ウイルスベクター(rAAV)は、幅広い組織タイプに組み込むことなく、強力で耐久性のある導入遺伝子発現を達成できるため、動物モデルや臨床現場での遺伝子導入によく使用されています。rAAVは、治療への応用に加えて、培養細胞における研究者の実験ニーズや科学的目標に合わせた導入遺伝子を送達するための有用な実験ツールです。例としては、外因性レポーター遺伝子、過剰発現カセット、RNA干渉、ゲノムワイドスクリーニング用のツールを含むCRISPRベースのツールなどがあります。rAAV形質導入は、エレクトロポレーションやケミカルトランスフェクションよりも細胞への害が少なく、製造に特別な装置や高価な試薬を必要としません。rAAVを含む粗溶解物または馴化培地は、rAAVの過小評価されている特徴である多くの細胞タイプを形質導入するために、さらに精製することなく培養細胞に直接添加することができます。ここでは、基本的な導入遺伝子カセットクローニングのプロトコルを提供し、粗rAAV製剤を作製して培養細胞に適用する方法を示します。原理の証明として、rAAVアプリケーションでまだ報告されていない3種類の細胞(胎盤細胞、筋芽細胞、小腸オルガノイド)の形質導入を実証しています。粗rAAV調製の適切な使用法、遺伝子導入におけるrAAVの限界、およびカプシドの選択に関する考慮事項について説明します。このプロトコルは、研究者が面倒な滴定および精製ステップを必要とせずに、rAAVを使用して細胞培養で生産的なDNA送達を達成するためのシンプルで低コストで効果的な方法を概説しています。
Introduction
細胞機能の分子基盤を解明するには、細胞培養におけるトランスジェニックDNAの発現がしばしば必要になります。導入遺伝子が発現されるためには、細胞の選択膜を貫通し、核に到達する必要があります1,2。したがって、細胞の物理的障壁を効果的に迂回し、その中枢プロセスを操作する能力は、新しい生命現象を明らかにするためにトランスジェネシスを適用するために必要です。1つのアプローチは、外来DNAを送達して発現するウイルスの本質的な能力を利用するものです3,4。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、哺乳類ウイルスの中では最小のウイルスの1つで、4.7キロベース(kb)の一本鎖DNAゲノムには、rep(レプリカーゼ用)とcap(カプシド用)の2つの遺伝子が、25 nmの60mer正二十面体カプシド内にパッケージされています。rep/cap遺伝子には、ウイルスの複製、産生、およびパッケージングに必要な少なくとも9つの固有のタンパク質をコードする複数のプロモーター、リーディングフレーム、およびスプライス産物があります5,6。さらに、ゲノムの両端には、DNA複製、ゲノムパッケージング、および形質導入中のダウンストリームプロセシングに必要な逆末端反復配列(ITR)と呼ばれる二次構造が含まれています7,8,9,10。ITRは、ゲノムをカプシドにパッケージングするために必要な唯一のDNA要素であるため、ウイルスのrep/cap遺伝子を研究者が選択した調節要素および/または目的の遺伝子に置き換えることで、導入遺伝子導入の目的でAAVをクローニングすることができます6。得られた組換えAAV(rAAV)は、改変されたベクターゲノム(VG)とともに、ヒト遺伝子治療の臨床で広く使用されており、成功を収めています11。ベクターの過小評価されている使用は実験室にあります。rAAVは、培養細胞における導入遺伝子発現を効率的に達成し、研究者の実験ニーズを満たすことができます12。
rAAVを産生する最も一般的な方法は、HEK293または293T細胞へのトリプルプラスミドトランスフェクションです(図1)。一般にシスプラスミドと呼ばれる最初のプラスミドには、ITR(pAAV)に挟まれた目的の導入遺伝子が含まれています。用途に応じて、強力なプロモーターやCRISPRベースのツールなど、一般的な要素を持つシスプラスミドを購入することができます。2つ目は、野生型AAVのrep遺伝子とcap遺伝子をトランス内(すなわち、シスプラスミドと相互作用する調節要素と構造要素を発現する別の非ITR含有プラスミド上)を含むpRep/Capプラスミドで、トランスプラスミドと呼ばれます。 VGを物理的に囲むことに加えて、カプシドは細胞の屈性に影響を与えます12,13。血清型特異的なキャップ遺伝子をトランスで提供することにより、研究者は特定の標的細胞に最適化されたカプシド血清型を選択することで、形質導入効率を容易に最大化することができます。最後に、Dependoparvovirusとして、AAVは、pAdΔF614,15などの第3のプラスミド上に提供されるアデノウイルスヘルパー遺伝子によって達成される、ウイルスプロモーターからのrep/cap発現を活性化するためにヘルパーウイルスを必要とします。トリプルプラスミドトランスフェクションを72時間行った後、凍結/融解サイクルを繰り返すことで、ベクターを産生細胞から培地に放出することができます。その後、プレートの内容物全体を回収し、遠心分離によって大きな細胞破片を除去します。得られた培地上清は、下流の形質導入に備えた粗なrAAV調製物です。
図1:粗rAAVベクター作製の概要。 粗rAAVの産生と形質導入は5日以内に完了します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
rAAVは、エレクトロポレーションや化学/脂質ベースのトランスフェクションなど、細胞毒性、低効率、高価な試薬や機器に一般的に関連している他のトランスフェクション法と比較して、導入遺伝子の送達に有利である可能性があります16,17。rAAVはこれらの障害を回避し、多くの場合、最小限の毒性と最小限のハンズオン時間で強力な導入遺伝子発現を提供します。重要なことは、rAAVの作製と細胞培養への適用は簡単で、培地からのベクターの精製はほとんど必要ありません(図1)。さらに、rAAVはレンチウイルス導入遺伝子導入とは異なり、そのVGを宿主ゲノムに組み込まないため、挿入突然変異誘発のリスクを低下させる18。導入遺伝子導入にrAAVを使用することの潜在的な利点にもかかわらず、限界を考慮する必要があります。重要なことは、キャプシドの物理的制約により、ITRを含む導入遺伝子のサイズが4.9 kbを超えてはならないことであり、それによって、大きな調節要素と導入遺伝子を効果的に送達する研究者の能力が制限されます。さらに、rAAVは非統合ウイルスであるため、形質導入は分裂細胞で一過性の導入遺伝子発現をもたらし、安定した発現には実用的ではない可能性があります。しかし、研究者が望む場合、二重のrAAV送達Cas9および相同性指向性修復(HDR)テンプレートを使用する方法を使用して、特定のゲノム遺伝子座に配列を安定的に挿入することができます19。
Protocol
1. プラスミドの取得
注:このプロトコルは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターとSV40ポリアデニル化シーケンス(pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40)を備えたITR含有プラスミッドに関心のある遺伝子(GOI)をクローニングします。ただし、このプラスミドは、さらにクローニングすることなく、便利なデュアルEGFPおよびルシフェラーゼレポーターをパッケージングしてrAAVを産生するために使用できます。調節要素が異なるプラスミドや、CRISPRベースの実験など、さまざまなアプリケーション用のプラスミドはオンラインで入手でき、以下と同様のクローニング手順に従います(追加のクローニング手順については、説明を参照してください)。さらに、異なる血清型用のrep/capまたは trans プラスミドを使用することができ、このプロトコルではAAV血清型2にrep/capを使用します。
- ITR含有 シス プラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミド、レップ/キャッププラスミド、およびGOIを含むプラスミドを含む細菌スタブを購入します。各プラスミドの耐性に特異的な抗生物質を含む個々の寒天プレートに細菌をストリークします。バクテリアを30°Cで一晩インキュベートして増殖させます。
注:GOIを含むプラスミドがすぐに購入できない場合は、合成DNA断片( 材料表を参照)をオンラインで購入できます。さらに、合成DNA断片を使用して、必要に応じてPCRプロセス全体をスキップできます。 - 各プレートからコロニーを1つ選び、対応する抗生物質を添加した3 mLのLuria Bertani(LB)バッファー中で、30°Cで180rpmで一晩振とうしながら増殖させます。1 mLの細菌を、対応する抗生物質を添加した50 mLのLB緩衝液を含む滅菌250 mL三角フラスコに移します。30°C、180rpmで一晩振とうします。
- バクテリアを50 mLのコニカルチューブに移し、室温で3,000 x gで20分間遠心分離します。上澄みを捨てます。メーカーの指示に従って、エンドトキシン低またはフリーのミディプレップキットを使用してプラスミドを単離します。
注: ITR は不安定な構造です。ITRの欠失や突然変異を防ぐには、細菌細胞を30°Cで増殖させて細胞分裂を遅らせ、複製のエラーを軽減する必要があります。プラスミドの収量と純度を高めるには、midiprepまたはmaxiprepキットが理想的です。エンドトキシン低またはエンドトキシンフリーキットを使用して、下流の細胞のエンドトキシン汚染を減らすことをお勧めします。プラスミド単離は、標準的なベンチで行えばプラスミド調製の汚染が起こりにくいため、層流フード内で行う必要はありません。
2. AAV ITR含有プラスミドへの目的遺伝子のクローニング
- GOIを含むプラスミドマップをDNA表示ソフトウェアで開きます。
注:キャプシドの物理的なパッケージングの制限により、ITRを含むフルカセットは4.9 kbを超えてはなりません。さらに、PCR増幅は二次構造のためITRでは達成できません。そのため、ギブソンアセンブリーはrAAV導入遺伝子クローニングには推奨されません。- [ Sequence ] タブをクリックすると、プラスミドの完全な配列が表示されます。GOI配列の5'最も領域までスクロールし、 第1ヌクレオチド をクリックしながら遺伝子本体に向かって内側にドラッグして、フォワードプライマーを作成します。融解温度(Tm)が~55°Cに達したら放出します。
- [ Forward Primer] をクリックします。EcoRI制限部位(5' GAATTC 3')の配列をプライマー配列の最末端5'に手動で含めます。さらに、この制限部位の5'末端に6つのランダム塩基を追加して、酵素がDNAと効率的に相互作用できるようにします。「 プライマーを追加」をクリックします。代表的な例として、 図 2 を参照してください。
- プライマーをチェックして、ヘアピンまたはプライマー二量体を形成しないことを確認します(回文性の制限部位を除く)。ヘアピンが形成された場合は、6つの余分なベースのランダムなシーケンスを変更します。さらに、プライマーがプラスミドの他の場所に結合していないことを確認してください。
- これらの手順を繰り返して、GOIの遺伝子本体の内側の3'最先端領域にリバースプライマーを作製します。 Reverse Primer をクリックし、NotI制限部位(5' GCGGCCGC 3')を含めます。
注:GOIにはEcoRIまたはNotIの制限部位を含めることはできません - もしそうなら、異なる制限酵素を使用する必要があります。
- 50 μL の PCR 反応で GOI を増幅します。 表 1 の必要な個々のコンポーネントを使用します。
- 反応液をサーモサイクラーに入れ、 表2 のサイクルパラメータに従ってプログラミングします。プライマーのTmが異なる場合は、プログラムに低いTm を使用します。
- 5 μLのPCR反応液に1 μLのゲルローディング色素(6x)を添加して、正しいPCRフラグメントの増幅を確認します。臭化エチジウムを含む0.8%アガロースゲル上でDNAラダーとPCR混合物を泳動し、UV光で可視化します。
注意:エチジウムブロマイドは既知の変異原です。 - ゲル上に単一の特定のバンドが現れた場合は、メーカーの指示に従って、カラムベースのPCRクリーンアップキットを使用して、PCRストリップチューブ内の残りのPCR産物を精製します。(非特異的増幅により)複数のバンドが現れた場合は、目的のバンドを切除し、メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用してDNAを精製します。
- 精製したPCR産物とpAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40バックボーンプラスミドを、 表3 の必要な個別成分と50 μLの反応液で37°Cで1時間消化します。 ゲル抽出後の回収効率が悪いと予想されるため、大量のpAAVプラスミドDNAが必要です。
注:使用される制限酵素はハイフィデリティ(HF)バージョンです。通常のNotIは、CutSmartバッファでは使用できません。異なる酵素を使用する場合は、異なるインキュベーション温度とバッファーが必要になることがあります。- 消化されたPCR産物を、メーカーの指示に従ってカラムベースのPCRクリーンアップキットで精製します。
- ゲル電気泳動用の消化pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40バックボーンプラスミドを、10 μLのゲルローディング色素(6x)を50 μLの消化反応液に添加して調製します。DNAラダー、消化反応、および250 ngの未消化プラスミド(ネガティブコントロール)を、エチジウムブロマイドを含む0.8%アガロースゲルにロードし、歯の幅が広いウェルがあります。UV光で可視化し、目的のフラグメント(~4.5 kb)を切除し、メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用してDNAを精製します。
- 消化したPCR産物と消化したpAAVバックボーンプラスミドを、 表4の必要な個々の成分を用いて20 μLのライゲーション反応でライゲーションします。必要なPCR産物の量を計算するには、式1を使用します。通常、PCR産物(インサート)とバックボーン(pAAV)のモル比は3:1で、質量は50 ngのバックボーンを使用します。
フォーミュラ1 - PCR産物を水に置き換えてネガティブコントロールを行います。ライゲーション反応液を16°Cで一晩、または室温で2時間インキュベートします。
- コンピテントで組換え欠損の細菌細胞(Stbl3細胞など)のバイアルを氷上で解凍し、50 μLを1.5 mLチューブに入れます。ライゲーション反応液3 μLを細胞に直接添加し、氷上で30分間インキュベートします。
注:ITRは不安定な構造であるため、ITRの欠失と組換えイベントを制限するには、組換え欠損細菌株が必要です。DH5α細胞は、増殖のために断続的に(1回または2回)使用できますが、長期使用には推奨されません。ITRの完全性は、ミディプレップ精製後に定期的にチェックする必要があります。- バクテリアを42°Cのウォーターバスで30秒間ヒートショックした後、すぐに氷に移して2分間加熱します。200 μL の LB バッファーを添加し、30 °C、180 rpm で 1 時間振とうします。
- 125 μLの混合物を対応する抗生物質を含む寒天プレートに広げ、30°Cで一晩(~18時間)インキュベートします。 複数のクローンをピックし、それぞれに対応する抗生物質を含む 3 mL の LB が入った滅菌プラスチック培養チューブに入れます。30°C、180rpmで一晩振とうしてインキュベートします。
注:ITRの欠失や突然変異を防ぐには、細菌細胞を30°Cで増殖させて細胞分裂を遅らせ、複製のエラーを軽減する必要があります。さらに、ITRのないコロニーは他のコロニーよりも成長に有利である可能性があるため、より小さなコロニーを選択する必要があります。 - 各培養液1.8 mLを2 mLのチューブにピペットで移し、6,000 x g で室温で3分間遠心分離します。miniprepキットを使用してDNAを単離します。残りの1.2 mLの培養液を4°Cで保存します。 DNAシーケンシングまたは診断制限酵素消化物により、正しいクローンを検証します。
注:インサートのサンガーシーケンシングが推奨されますが、ITR による処理能力は標準的な方法では達成できません。ITR は、以下で説明するように制限酵素ダイジェストで検証する必要があります。 - 対応する抗生物質を含む50 mLのLBバッファーを滅菌250 mL三角フラスコに加えます。残りの培養液500 μLをフラスコに加え、OD600 が0.2〜0.5に達するまで30°C、180rpmで振とうします(~18時間)。バクテリアを50 mLのコニカルチューブに移し、3,000 x g、4°Cで20分間遠心分離します。 エンドトキシン低またはフリーのmidiprepキットを使用してDNAを単離します。
- XmaI(またはSmaI)を用いて20 μLの診断制限酵素消化物でITRの完全性を確認します。500 ng プラスミド、0.5 μL の酵素、および 1 x バッファーを含む反応液を調製します。37°Cで1時間インキュベートします。 0.8%アガロースゲル上で反応を実行します。ITR が損なわれていない場合、消化により ~2.9 kb のバンドとカセットのサイズの別のバンドが得られます。この明瞭なバンドが観察されない場合は、ITR が損なわれていない可能性があり、クローニングをやり直す必要があります。
注:XmaI(またはSmaI)制限部位を含むプラスミド(ITRのプラスミドに加えて)は、ゲル上に追加のバンドが現れます。
フォーミュラ1
図2:プライマー設計の代表例。 mScarlet導入遺伝子の順方向および逆方向プライマー設計(代表例)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 量 | コンポーネント |
| XのμL | テンプレートDNA(25 ng) |
| 1 μL | Fプライマー(10μM) |
| 1 μL | Rプライマー(10μM) |
| 1 μL | dNTP(10 mM) |
| 10 μL | Phusionバッファー(5x) |
| 1 μL | Phusionポリメラーゼ |
| XのμL | 水 |
| 50 μL | 最終巻 |
表1:PCR増幅試薬。 PCR反応を成功させるために必要な成分です。
| 歩 | 温度 | 時間 |
| 初期変性 | 98 °C | 1 分 |
| 30サイクル | 98 °C | 10秒 |
| プライマーのTm | 30秒 | |
| 72 °C | 30秒/KB | |
| 最終延長 | 72 °C | 10分 |
| 持つ | 4 °C | 無期限 |
表2:PCR増幅プログラミング。 PCR反応を成功させるために必要なサイクリングパラメータ。
| 量 | コンポーネント |
| XのμL | PCR産物(1μg)またはpAAVプラスミド(3μg) |
| 5 μL | バッファ(10x) |
| 1 μL | EcoRI-HFの |
| 1 μL | NotI-HFの |
| XのμL | 水 |
| 50 μL | 最終巻 |
表3:消化試薬。 消化反応を成功させるために必要な成分。
| 量 | コンポーネント |
| XのμL | 挿入 (X ng) |
| XのμL | バックボーン(50 ng) |
| 2 μL | T4 DNAリガーゼバッファー(10個入り) |
| 1 μL | T4 DNAリガーゼ |
| XのμL | 水 |
| 20 μL | 最終巻 |
表4:ライゲーション試薬。 ライゲーション反応を成功させるために必要な成分。
3. トリプルプラスミドトランスフェクションによるベクター作製
注:以下の値は、最終粗前処理量が 2 mL の 6 ウェルプレートの 1 ウェルに対して最適化されています。すべての値は、最終容量が 20 mL の 15 cm プレートの場合は 10 倍にスケールアップでき、最終容量が 500 μL の 24 ウェルプレートの場合は 4 倍にスケールダウンできます。
- 100 mgのPEI MAXを100 mLの蒸留水に溶解して、塩酸ポリエチレンイミン(PEI)MAXのストックを1 μg/μL作成します。NaOHでpHを7.1に調整します。0.22 μmフィルターで混合物をフィルター滅菌し、1 mLのアリコートを-20°Cで凍結して長期保存します。解凍後、試薬を4°Cで1ヶ月間保存します。
- 10%ウシ胎児血清(FBS)を添加した、予熱したダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM、4.5 g/Lグルコース、110 mg/Lピルビン酸ナトリウム)を入れた6ウェルプレートに、3 x 105 HEK293またはHEK293T細胞を播種します。37°C、5%CO2 に設定したインキュベーターで~75%-90%のコンフルエントに成長させます(図3)。
注:ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)で培養した細胞は、ベクター産生収量を低下させることが観察されています。適切な滅菌技術を使用すると、P/Sを使用する必要がなくなるため、HEK293細胞を抗生物質20で培養しないことをお勧めします。下流の形質導入でP/Sが必要な場合は、収穫後の粗調製にP/Sを添加することをお勧めします。 - 2 mL チューブに、1.3 μg の pAAV2/2 (Rep/Cap、血清型 2)、1.3 μg の pAAV.GOI、2.6 μg の pAdΔF6、および無血清 (SF) DMEM (4.5 g/L グルコース、110 mg/L ピルビン酸ナトリウム) を含む混合物を合計容量 100 μL に調製します(簡便な計算については 、補足表 1 を参照)。
- 別のチューブにネガティブコントロールを調製し、pRep/Capを無関係なプラスミドに置き換えます。ネガティブコントロールは、まれではあるが、形質導入中に細胞をトランスフェクションできる可能性のある未包装のpAAV.GOIプラスミドを粗製剤に含んでいる。
注:エンドトキシン低またはフリーのマキシプレップまたはミディプレッププラスミドは、トリプルトランスフェクションに最適であり、一般的にミニプレップDNAと比較して高い力価ベクターを生成しますが、ミニプレップDNAは手っ取り早く汚れた予備試験に使用できます。 - プラスミド混合物に5.2 μLのPEI MAXを加えます。これは、1:1の比率のプラスミド:PEI混合物です。10に設定されたボルテックスミキサーで15〜7回パルスしてよく混ぜます。複数のベクター調製物が産生される場合は、ウェルを吸引するのに十分なタイミングを確保し、次のステップで反応を希釈するのに十分なタイミングを確保するために、1分間の時間間隔をずらして(すなわち、t=0分の調製1、t=0分の調製2、t=1分などのように)各プラスミド混合物にPEIを添加します。
注:プラスミド:PEIの比率は1:1が最適であることが確認されています。ただし、個々のユーザーは、この比率を最適化して効率を最大化できます。PEI最適化の実行方法については、説明を参照してください( 補足表2も参照)。 - 各チューブを15分間正確にインキュベートし、1.9 mLのSF DMEM(4.5 g/Lグルコース、110 mg/Lピルビン酸ナトリウム)で反応を希釈し、最終容量を2 mLにします。2回静かにピペットで混ぜます。過剰混合はプラスミド/PEI複合体を破壊し、トランスフェクション効率を低下させます。
- ウェルから培地を吸引し、プラスミド:PEI混合物をウェル側に穏やかに添加して、細胞の剥離を防ぎます。細胞を37°C、5%CO2で72時間インキュベートします。インキュベーション中の細胞の溶解と剥離は、rAAV産生の正常なプロセスです(図4)。
図3:トランスフェクションの準備ができているHEK293細胞。 トリプルプラスミドトランスフェクションに必要なHEK293細胞の理想的なコンフルエント(75%-90%)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:トランスフェクション後のHEK293細胞。 pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40、pAAV2/2、pAdΔF6、およびプラスミド:PEIの比率が1:1のトランスフェクションの前後1、2、または3日後のHEK293細胞の出現。スケールバー:400 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
4. 粗ベクター製剤の収穫
- トランスフェクションした細胞のプレート全体を-80°Cで30分間凍結した後、37°Cで30分間解凍します。 合計3回の凍結/解凍サイクルを繰り返します。蓋を取り外さないでください—プレートは内部を無菌状態に保つ必要があります。プレートは、次のステップに進む準備ができるまで-80°Cのままにしておくことができます。
注:加湿されていないインキュベーターは解凍に最適で、偶発的な汚染につながる可能性のあるプレートの外側の結露を最小限に抑えます。 - 層流フード内で、無菌技術を使用して次の2つのステップを実行します。ピペッティングで各ウェルを混合し、細胞の破壊を最大にします。ライセートを2 mLチューブに移し、室温で15,000 x gで15分間遠心分離し、細胞破片を除去します。
- 上清を新しい2 mLチューブに慎重に移します。この粗製剤は、滴定または精製なしですぐに使用できます。ベクターは、4°Cで数ヶ月間、または-20°Cで数年間保存できます。
注:必要に応じて、DNase耐性粒子内のベクターゲノム(VG)の数を定量することにより、定量PCR(qPCR)によって力価を計算できます。そのため、力価はVG / mLの単位で与えられます。4°Cで数ヶ月間保存されたベクターは、ベクターがチューブ壁を凝集および/または結合し、調製物の力価を低下させる可能性があるため、使用前に再滴定する必要があります。
5. 形質導入
- 形質導入の期間に応じて、目的の細胞タイプ(例:Huh7)を96ウェルプレートに50%〜75%のターゲットコンフルエントでプレーティングします。コンフルエント度が高くなると、AAV形質導入効率が低下する可能性があります。
- 新しい細胞タイプでの形質導入のためにカプシドのパネルをテストするなど、用量が関係しないアプリケーションのために、粗調製物の力価を知らなくてもベクター(CMV.mScarletなど)を細胞に添加します。無血清(SF)培地中で粗調製を1:3に希釈して、アプリケーションに必要な最適な量のベクターを得ます。96ウェルプレートから培地を吸引し、50〜100μLの希釈粗製剤をウェルに加えます。細胞を37°C、5%CO2でインキュベートします。
注:血清には、AAVベクターを中和し、形質導入効率を低下させる可能性のある抗体が含まれている場合があります。ただし、血清は、感受性細胞タイプの形質導入中に使用できます。 - 形質導入後48時間後にベクター(hpt)を除去し、予め温めたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を一度洗浄します。また、ベクターは、感受性の高い細胞タイプに対しては、2 hptという速さで除去し、血清含有培地と交換することができます。多くのアプリケーションでは、一晩インキュベーションを行って細胞を形質導入し、朝にウェルを新鮮な血清含有培地と交換します。Huh7やU2-OSなどの頑健な細胞タイプは、培地交換を必要としません。
- 細胞を4%パラホルムアルデヒド(PFA)に10分間固定して形質導入を終了します。また、用途に応じて種々の終結方法(例えば、溶解)を用いることができる。ほとんどの細胞タイプでは、ピーク発現は48 hptで発生するため、一般的な実験エンドポイントです。
6. 細胞種による形質導入法のばらつき
注:細胞の種類が異なれば、必要な培養条件も異なります。したがって、形質導入のためのベクターの添加は、細胞の種類のニーズに基づいて最適化する必要があります。以下は、代表的な結果に含まれる細胞タイプの非常に特異的な形質導入プロトコルであり、研究者が自分のニーズに合わせて試したい形質導入プロトコルのいくつかのバリエーションを示しています。
- マウス小腸オルガノイド
- C57BL/6Jマウスの小腸陰窩調製からマウス小腸オルガノイド(mSIO)を誘導します。オルガノイドを90%基底膜マトリックスに包埋し、オルガノイド増殖培地(抗生物質なし)または形質導入前培地(50%Wnt3a馴化培地[オルガノイド増殖培地中のL Wnt-3A細胞を使用して社内で製造]、10 mMニコチン酸アミド、10 μM ROCK阻害剤、および2.5 μM CHIR99021)を含む24ウェルプレートで培養し、37°Cおよび5%CO2で形質導入する前に1継代(5〜7日)します。
- 形質導入前に、オルガノイドをD-PBSで洗浄し、ピペッティングで基底膜マトリックスドームを破壊し、オルガノイドを解離培地中で37°Cで10分間インキュベートし、さらにピペッティングすることで、オルガノイドを小細胞クラスターに解離します。
- 15 mM HEPESを含むDMEM/F-12に5%FBSを添加し、細胞クラスターを遠心分離チューブに移し、室温1000 x gで5分間遠心分離して細胞クラスターを回収して細胞解離プロセスを停止させます。
- 細胞クラスターを形質導入培地(10 μg/mLのポリブレンを含む形質導入前培地または10 μg/mLのポリブレンを含むオルガノイド増殖培地)に再懸濁し、48ウェルプレートに移し、続いて形質導入のためにCMV.mScarletを包装したAAV粗製剤を添加します。
- プレートを600 x g 、37°Cで1時間遠心分離し、その後さらに37°Cで6時間インキュベートすることにより、オルガノイドの形質導入を行います。形質導入したオルガノイドを1.5 mLの微量遠心チューブに集め、室温で1000 x gで5分間遠心分離し、氷上に置いた。
- 上清を除去した後、形質導入したオルガノイドを90%基底膜マトリックス中の形質導入前培地またはオルガノイド増殖培地および20 μLの種子液滴を、予め温めたチャンバーカバーガラスの1つのウェルに再懸濁します。
- インキュベーターで10分間インキュベートした後、液滴を350 μLの形質導入前培地またはオルガノイド増殖培地に包埋し、インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。形質導入後2〜5日で形質導入されたオルガノイドを共焦点顕微鏡でイメージングすることにより、形質導入効率を決定し、オルガノイドあたりの赤色蛍光細胞の割合を推定します。
- BeWo細胞
- 形質導入の24時間前に、ヒト胎盤絨毛癌BeWo細胞を96ウェルプレートのウェルあたり10,000細胞で播種します。CMV.mScarletを包装した粗AAV調製物を無血清F12-K BeWo培地中で1:1に希釈し、ウェルあたり総容量が50 μLになるまで希釈します。ウェルから培地を吸引し、ウェルあたり50 μLの希釈AAVと交換します。
- 細胞を37°Cで一晩(~18時間)インキュベートし、10%FBSを含むF12-K BeWo培地100 μLを添加して、総容量を150 μLにします。 細胞をさらに6時間インキュベートし、形質導入後合計24時間(hpt)します。
- イメージングでは、生細胞をF12-K培地でHoechst色素で30分間染色した後、培地を10%FBS、1xグルタマックスサプリメント、および1xピルビン酸ナトリウムサプリメントを含むフェノールフリーDMEMと交換してイメージングします。37°C、5%CO2のDAPI(Hoechstイメージング用)およびmCherry(mScarletイメージング用)フィルターセットを使用して、共焦点顕微鏡で生細胞イメージングを実施します。
- Hepa1-6およびHuh7細胞
- 形質導入の24時間前に、マウスのHepa1-6肝細胞とヒトHuh7肝細胞をDMEM(4.5 g / Lグルコース、110 mg / Lピルビン酸ナトリウム、10%FBS)で96ウェルプレートのウェルあたり5,000細胞でプレートします。
- CMV.mScarletを包装した原液AAV調製物50 μLを細胞に直接添加し、37°Cで48時間インキュベートします。細胞をPBSで一度洗浄し、4% PFAで固定し、Hoechst色素で10分間染色します。DAPI(ヘキストイメージング用)およびmCherry(mScarletイメージング用)フィルターセットを使用して、共焦点顕微鏡でイメージングを行います。
- C2C12およびHSkMC細胞
- 形質導入の72時間前に、未分化マウスC2C12筋芽細胞および未分化ヒト初代骨格筋細胞(HSkMC)筋芽細胞を96ウェルプレートのウェルあたり5,000細胞でプレートします。
- C2C12筋芽細胞の場合はCMV.mScarletをDMEM(4.5 g/Lグルコース、Penn/Strep、20% FBS)で1:1に、HSkMC筋芽細胞の場合は骨格筋成長培地で、粗AAV製剤を希釈します。培地を分化培地に変更することにより、HSkMC筋芽細胞を筋管に分化させます。
- 筋芽細胞および筋チューブを希釈したAAV製剤中で37°Cで24時間インキュベートします。 生細胞をHoechst色素で10分間染色し、DAPI(Hoechstイメージング用)およびmCherry(mScarletイメージング用)フィルターセットを使用して共焦点顕微鏡でイメージングします。
Representative Results
目的培養細胞の形質導入に最適なカプシドの発見
さまざまな細胞タイプを形質導入して、さまざまなカプシド血清型の向性を決定しました(図5)。天然血清型AAV2 14、AAV4 21、AAV5 22、AAV8 23、AAV9 24、および改変されたカプシド変異体Anc80 25、DJ 26、LK03 27、およびKP1 28は、CMVプロモーター下でmScarletを発現するベクターゲノムでパッケージ化され、このプロトコルで提供される方法を使用してクローニングされました。滴定していない粗ベクター調製物を適切な培地で希釈し、細胞を24+時間形質導入してイメージングしました(図5B)。形質導入効率は、mScarlet+である全細胞の割合、またはmScarlet+である単一z平面内の細胞の割合によって計算されました(マウス小腸オルガノイドの場合;図5C)。形質導入効率(mScarlet+細胞)は、分化したC2C12およびHSkMC筋チューブではなく、未分化のC2C12およびHSkMC筋芽細胞に対して提供されます(図5A)。
AAV2およびKP1は、試験した細胞株の中で最も強力な血清型でした(図5A)。また、異なる種に由来する類似の細胞型は、さまざまな効率で形質導入されることも観察されました。例えば、Hepa1-6(マウス由来肝細胞株)は、AAV2を用いた場合、Huh7(ヒト由来肝細胞株)と比較して形質導入が著しく減少します(図5B)。さらに、形質導入にはさまざまな培地条件が重要な役割を果たします。形質導入前培地で培養したマウス小腸オルガノイド(mSIO)は、オルガノイド増殖培地で培養したマウスオルガノイド(mSIO)に比べて、形質導入の効率が低くなります(図5C)。さらに、AAV2は未分化のHSkMC筋芽細胞と分化したHSkMC筋チューブを効率的に形質導入します(図5B)が、筋チューブの定量分析は困難であるため、提供されていません。
図5に示したさまざまな細胞タイプで高い形質導入効率は、粗ベクター調製物を効果的に使用して、精製や滴定などのさらなるステップを踏むことなく、さまざまなタイプの細胞を形質導入できることを示しています。ただし、導入遺伝子の送達を最大化するためにカプシドを選択する際には、慎重に検討する必要があります。他の多くの細胞株やカプシドは以前に試験され、発表されていますが、精製されたベクター調製物が用いられています12。
培地条件のベクター粒子に依存しない効果は、形質導入の効率に影響を与える可能性があります。しかし、屈性(すなわち、細胞型特異的な取り込みおよびベクターの発現)は、カプシド特異的な特性であると一般に認められている29。用量一致した粗製剤と精製製剤の比較は、細胞の向性に影響を与えることはまだ観察されていません。.したがって、粗ベクター調製物は、細胞培養における精製ベクターと同様の方法で用いることができる。
図5:さまざまな細胞タイプの粗ベクター形質導入 。 (A) mScarlet 導入遺伝子を含むさまざまなAAVベクターを添加した後のmScarlet+の割合。(B)AAV血清型2から送達された mScarlet を発現する細胞。スケールバー:100 μm(Hepa1-6、Huh7、C2C12、HSkMC)、200 μm(BeWo)、20 μm(mSIO)。略語:hpt = 形質導入後数時間。(C)マウス小腸オルガノイド(mSIO)を、形質導入前培地またはオルガノイド増殖培地でrAAV処理しました。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足表1:トリプルプラスミドトランスフェクションワークシート。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2:PEI最適化ワークシート。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
クローニング
クローニングプロトコルは、上記で使用したpAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40プラスミドに限定されず、研究者の実験ニーズに基づいて簡単に変更することができます。多くのITR含有プラスミドは、オンラインで容易に購入できます。例えば、Cas9とsgRNAクローニング部位の両方を含むプラスミドは入手可能であるが、オリゴヌクレオチドアニーリングやPNK処理などの追加ステップはほとんど必要としない30。さらに、ITRのみを持ち、内部調節因子を持たないマルチクローニングサイト(MCS)を含むプラスミドは見つかりません31。異なるプラスミドを使用する場合、消化に使用される制限酵素(RE)は、通常、このプロトコルで変更する必要がある唯一の要素です。ただし、rAAVの限界は、貨物容量が限られていることです。カプシドの物理的限界により、ベクターゲノムはITRを含めて4.9 kbを超えてはなりません。
細菌からプラスミドを単離する場合、トリプルプラスミドトランスフェクションまたは形質導入中の細胞への害を軽減するために、エンドトキシン低またはフリーのミディプレップまたはマキシプレップキットを使用することが重要です。miniprepキットのプラスミドには、不純物が多く、濃度が低く、スーパーコイル状のDNAが少ないことが多く、これらはすべてrAAVの下流産生に影響を与える可能性があるため、推奨されません。
クローニング中にITRの構造と特性を理解することは非常に重要です。まず、ITRによるPCRの利用は極めて困難です。ITRによるPCR増幅を必要とするクローニングデザインは避けるべきであり、さらにGibsonアセンブリクローニング技術の使用を制限する必要があります。そのため、制限酵素クローニングは、ITR含有プラスミドへのクローニングに好ましい方法です。さらに、サンガーシーケンシング用の特定のプライマーは、シーケンシングされた領域にITRが含まれている場合、適合しない可能性があります。代わりに、より正確なシーケンシング結果を得るために、ITRからベクターゲノム本体に配列決定するプライマーを使用することが推奨されます。第二に、ITRは、プラスミド増幅のために細菌に形質転換されると、欠失、再構成、および突然変異を起こしやすい32,33。これらの事象を軽減するには、Stbl3などの組換え欠損コンピテント細菌株を使用し、30°Cでインキュベートして細胞分裂を遅らせることが推奨されます。最後に、より小さなコロニーは、ITRのないコロニーは成長に有利で大きくなる可能性があるため、再構成や欠失のないクローンと一致する可能性があることが観察されています。したがって、小さなコロニーを選ぶことをお勧めします。
ベクター制作
rAAVベクターの作製の成功は、複数の要素によって影響を受ける可能性があります。重要な要素の1つは、トランスフェクションに使用されるHEK293または293T細胞の健康状態です。一般に、継代数が高い細胞は遺伝子型および表現型の分散を示し、rAAV力価を低下させる可能性があるため、継代数が少ないことが理想的です。さらに、効果的な生産のために、播種された細胞の密度は75%〜90%のコンフルエントである必要があります。まばらな細胞は、ベクターを産生できる細胞が少ないため、ベクター収量が少なくなり、増殖しすぎた細胞は効率的にトランスフェクションされません。
試薬ロット、細胞ストック、および一般的なラボ間のばらつきは、トランスフェクション効率と生産力価の違いに寄与します。力価の改善につながる最適化可能な要因の1つは、トランスフェクション反応におけるプラスミド:PEI比です。新鮮な(<1ヶ月経過した)PEI MAXを使用することが重要です。プラスミドとPEIの比率を1:1から開始し、トランスフェクションまたは形質導入の効率が悪いと思われる場合は、いくつかの異なる比率をテストすることをお勧めします。力価の最適化は、クローニングの出発物質として本明細書で用いるCMV.Luc.IRES.EGFPレポータートランジーンのような、視覚的読み出しを有する導入遺伝子を用いる場合に最も容易である。最適化を実行するには、12 ウェルプレートを使用し、プラスミド質量と試薬容量を 2 つスケールダウンします(最終プラスミド質量は 2.6 μg)。それに応じて、1:0.75 から 1:3 の範囲の比率に対応するように PEI ボリュームを調整し、0.25 ずつ増やします(図 6)。15分後に各反応液を950 μLのSF培地で希釈します。便宜上、トリプルプラスミドを含むマスターミックスを作製し、PEIを添加する前に1.5 mLチューブに個別にピペットで移すことができます( 補足ファイル2を参照)。ベクターを回収し、目的の細胞を形質導入し、画像化します。形質導入効率が最も高いウェル(GFP+細胞の割合)は、PEI:DNAの力価が最も高い、最適な比率に相当します。
図6:PEI最適化ワークフロー PEIの最適化に必要な手順の概略図。プラスミドの複数の比率:PEIは、最適な比率を決定するためにテストされます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
収穫と力価に関する考慮事項
rAAVベクターの回収に用いる凍結融解法は、培養細胞を形質導入するための清澄ライセートの直接使用と互換性のある方法で、HEK293細胞を効果的に溶解します。AAV1、AAV8、およびAAV9などの特定のrAAV血清型は、ベクター産生中に細胞から放出され、凍結/融解サイクルなしで培養細胞培地から回収することができる34。ここで説明する方法では、通常、AAV2 キャプシドを使用する場合は 1 x 10 10 VG/mL、AAV8 の場合は 1 x10 11 VG/mL のオーダーの力価が得られます。界面活性剤やその他の化学ベースの溶解によってより高い力価を達成できますが、これらは下流で使用する細胞に有害であり、ライセートからさらに精製するにはrAAVが必要です。低力価は、粗調製物が研究ニーズに適しているかどうかを判断する際に研究者が考慮すべきトレードオフの1つですが、ここで説明する方法によって生成されるわずかに低い力価は、多くの細胞タイプを非常にうまく形質導入することができます(代表的な結果を参照)。トランスフェクション効率と細胞の健康状態に加えて、ベクター力価は、rAAV産生中に使用するカプシド、およびVG35内の導入遺伝子のサイズと配列によって異なります。
粗ベクター調製物を回収する際には、トリプルプラスミドトランスフェクション中に使用されたプラスミドDNAが存在する可能性があり、まれではありますが、形質導入中にダウンストリームトランスフェクションが行われます。さらに、パッケージ化されていないVGは、カプシドの外側に結合し、裸のDNAや外来の一本鎖DNAに対する自然免疫応答を誘発する可能性がある36,37。したがって、感受性の高い細胞タイプでは、ベクター調製物をDNase消化および精製して、パッケージされていないVGおよびプラスミドを除去する必要があります。
粗製剤の力価を計算したい場合は、qPCRを実行して、DNase耐性粒子(DRP)内のパッケージ化されたVGの数を定量化できます。簡単に説明すると、少量の粗調製物をDNase消化して、プラスミドDNA、汚染核酸、または部分的にパッケージ化されたVGを除去します。その後、サンプルをqPCRにかけ、DRP内の保護VGを定量し、粗調製物1mLあたりのベクターゲノムの単位を持つ力価を得る38。カプシド力価を定量するELISAベースのアッセイを用いたベクター滴定の実施は推奨されません。野生型AAVウイルスと比較して、rAAVは空で部分的に包装されたカプシドの割合に悩まされている39。ELISAは、ゲノムの内容に関係なくすべてのカプシドを定量し、パッケージ化されたVGを必要とする調製物中に存在する形質導入単位を過大評価します。
形質導入に関する考慮事項
多くの要因がrAAV形質導入に影響を与えるため、新しい実験には適切な検討が必要です。導入遺伝子の発現を促進するプロモーターに応じて、発現開始は形質導入後4時間(hpt)という早い時期に起こり、ピーク発現は通常48hptまでに達成されます。細胞の最初の播種から実験のエンドポイントまでの期間を念頭に置いておくことが重要です。これは、細胞の開始コンフルエント度を推定し、実験の終わりまでに細胞が過剰に増殖しないようにするためです。細胞が過剰にコンフルエントになると、ストレス応答によって細胞の挙動が変化し、実験結果が混乱する可能性があります。U2-OSのような一部の細胞タイプは、過剰増殖/接触阻害に非常によく耐えることができます。さらに、この生産プロトコルの産物である無血清馴化培地中で長期間(48 h+)に耐えることができます。ただし、感受性の高い細胞タイプでは、形質導入中の健康を維持するために、粗製剤を特殊な増殖培地で血清を添加または希釈する必要がある場合があります。血清含有培地の使用による形質導入効率のわずかな低下は、細胞の健康に対する潜在的なトレードオフであり、研究者は考慮する必要があります。
通常、細胞の分裂が速い場合、48 hpt で終端するアプリケーションには、約 50% の開始コンフルエントが最適です。ただし、コンフルエンシーは実験のニーズに応じて調整できます。単層型不死化細胞株のコンフルエント度が75%を超えると、形質導入効率が低下するため、形質導入は推奨されません。ほとんどの培養細胞タイプは、粗rAAV調製物で一晩インキュベートした後、形質導入に成功し、正常であり、その後、朝に新鮮な血清含有培地に交換します。
カプシド血清型は、細胞の屈性およびそれに続く導入遺伝子発現の主要な決定因子であるため、標的細胞を形質導入するためにrAAVを産生する際に考慮すべき重要な要素である13。AAV2は、多くの種類の培養細胞を効果的に形質導入する能力があるため、広く使用されている血清型です12。AAV2のこの特性は、AAV2の主要な接着因子として機能するヘパリン硫酸プロテオグリカン(HSPG)と、ディッシュ40での適応から成長までの培養細胞上の高レベルのHSPGに起因している可能性があります。AAV9のような他のカプシドは、幅広い細胞型を形質導入する効果が低く、この設定では発現しない依存接着因子によって説明できるかもしれない41。したがって、目的の標的細胞が以前に文献でrAAVで試験されていない場合は、培養細胞の第一選択のキャプシドとしてAAV2を推奨します。
粗ベクター調製物の主な制限は、動物モデルの形質導入に適さないことです。 in vivo 試験では、製剤を精製し、品質評価を受ける必要があります。
導入遺伝子の発現と統合の可能性に関する考慮事項
rAAVは、導入遺伝子の永久的な発現を確実にもたらさない。時間が経つにつれて、VGは沈黙し、トランスジェニック発現は、いくつかの継代に続いて停止され得る42。さらに、VGの大部分は一時的なままであり、rAAVには、野生型ウイルス溶解原性感染症のように宿主ゲノムへの頻繁な統合を媒介したり、VGの複製を促進したりするウイルスRepタンパク質が含まれていません43。その結果、形質導入細胞のエピソームは、最終的に分裂によって娘細胞間で希釈されます。
基礎レベルの統合は、導入されたすべてのトランスジェニックDNA材料に対して可能です。しかし、ITRを含むVGは、より高い周波数で積分される傾向がある44。したがって、導入遺伝子の永久的な発現は、細胞の小さなサブセットで観察され得る。特に、Cas9などのDNA切断酵素を送達するためにrAAVを使用する場合、二本鎖切断により、さらに大きな頻度の積分と永久発現がもたらされる可能性があるため、ユーザーはこの可能性を考慮する必要があります45。このことから、rAAVは内因性標識や遺伝子付加のための相同性指向性修復テンプレートを送達するための有力な候補となるが、Cas9挿入の可能性を考慮する必要がある19,46。
Disclosures
A.C.M.はヤンセン・ファーマシューティカルズのコンサルタントであり、NewBiologixのSABのメンバーでもあります。他のすべての著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
Robert Tjian と Xavier Darzacq の実験装置のサポートと使用に感謝します。KP1 および LK03 rep/cap プラスミドを寄贈してくださった Mark Kay 氏と、AAV4 rep/cap プラスミドを贈ってくださった Luk Vandenberghe 氏に感謝します。資金提供は、ハワード・ヒューズ医学研究所(34430、R.T.)およびカリフォルニア再生医療研究所トレーニングプログラムEDUC4-12790によって提供されました。N.W.は、バークレー幹細胞センターからシーベル博士研究員フェローシップを通じて、ドイツ研究財団(DFG)からウォルター・ベンヤミン・フェローシップを通じて資金提供を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Snapgene DNA viewing sofrware | Snapgene | ||
| pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 | AddGene | 105533 | |
| pAAV2/2 (Rep/Cap) | AddGene | 104963 | |
| pAdΔF6 | AddGene | 112867 | |
| LB Agar Carbenicillin | Sigma-Aldrich | L0418 | |
| Boekel Scientific Economy Digital Incubator | Boekel Scientific | 133000 | |
| LB medium, powder | MP Biomedicals | 113002042 | |
| Carbencillin (Disodium) | GoldBio | C-103-5 | |
| New Brunswick I26 Shaker | Eppendorf | M1324-0000 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22627040 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit | Qiagen | 12945 | |
| PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS | USA Scientific | 1402-3900 | |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6333000022 | |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| 5x Phusion Buffer | NEB | B0518S | Provided with purchase of Phusion Polymerase |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Gel Loading Dye, Orange (6X) | NEB | B7022S | |
| DNA Clean & Concentrator-100 | Zymo | D4029 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo | D4001 | |
| NotI-HF | NEB | R3189S | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| CutSmart Buffer (10x) | NEB | B6004S | Provided with purchase of restriction enzyme |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500100 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with purchase of T4 Ligase |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Precision Microprocessor Water Bath | Thermo Scientific | 51221046 | |
| Sterile Plastic Culture Tubes | Fisher Scientific | 149566B | |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tube | Thomas Scientific | 1149Y01 | |
| ZR Plasmid Miniprep - Classic | Zymo | D4015 | |
| Xma1 | NEB | R0180S | |
| Sma1 | NEB | R0141S | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Falcon 6-well | Corning | 353046 | |
| Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo-Fisher | 11995065 | |
| Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 Incubator | Marshall Scientific | MCO-18AIC | |
| PEI MAX (Polyethylenimine Hydrochloride) | Polysciences | 24765-100 | |
| Mixer Vortex Genie 2 | Electron Microscopy Sciences | 102091-234 | |
| Sanyo Ultra Low Freezer | Sanyo | 14656-15267-16219 | |
| INCU-Line IL 10 with transparent window | VWR | 390-0384 | |
| Eppendorf Microcentrifuges | Eppendorf | 05-400-005 | |
| Falcon 96-well | Corning | 353072 | |
| C57BL/6J mice | JAX | strain #000664 | |
| organoid growth medium | STEMCELL Technologies | 6005 | |
| L Wnt-3A cells | ATCC | CRL-2647 | |
| nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72052 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane | Fisher | 356231 | |
| 24-well plate | Fisher | 08-772-1 | |
| D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| TrypLE Express | Fisher | 12604013 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| polybrene | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-3D | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Fisher | 12-565-470 | |
| BeWo cells | ATCC | CCL-98 | |
| F-12K Medium | ATCC | 30-2004 | |
| Hepa1-6 | ATCC | CRL-1830 | |
| Huh7 | UC Berkeley BSD Cell Culture Facility | HUH-7 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| HSkMC | ATCC | PCS-950-010 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium | Sigma | C-23060 | |
| Skeletal Muscle Differentiation Medium | Sigma | C-23061 | |
| Invitrogen EVOS Digital Color Fluorescence Microscope | Fisher Scientific | 12-563-340 | |
| Perkin Elmer Opera Phenix | Perkin Elmer | HH14001000 | |
| PhenoPlate 96-well | Perkin Elmer | 6055302 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Thermo-Fisher | 31053028 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo-Fisher | 35050079 | |
| Sodium Pyruvate | Thermo-Fisher | 11360070 | |
| pAAV2/5 (Rep/Cap) | Addgene | 104964 | |
| pAAV2/8 (Rep/Cap) | Addgene | 112864 | |
| pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap) | Addgene | 130878 | |
| pAAV2/9n (Rep/Cap) | Addgene | 112865 | |
| pAnc80L65AAP | Addgene | 92307 | |
| KP1 (rep/cap) | gifted by Professor Mark Kay (Stanford University) | ||
| LK03 (rep/cap) | gifted by Professor Mark Kay (Stanford University) | ||
| pAAV4 (rep/cap) | gifted by Professor Luk Vandenberghe (Harvard Medical School) | ||
| pAAV.Cas9.sgRNA | Addgene | 61591 | |
| pAAV.MCS | Addgene | 46954 | |
| gBlock (synthetic DNA fragement) | IDT |
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