Summary
재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)는 임상 및 전임상 유전자 전달에 널리 사용됩니다. rAAV의 과소평가된 용도는 정제 없이 배양된 세포의 강력한 transduction입니다. rAAV를 처음 접하는 연구자를 위해 transgene cassette 클로닝, 미정제 벡터 생산 및 세포 배양 transduction을 위한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
재조합 아데노 관련 바이러스 벡터(rAAV)는 광범위한 조직 유형에서 통합 없이 강력하고 지속적인 전이유전자 발현을 달성할 수 있으므로 동물 모델 및 임상 환경에서 유전자 전달에 널리 사용됩니다. 치료용 응용 분야 외에도 rAAV는 배양된 세포에서 연구자의 실험적 요구와 과학적 목표에 맞는 전이유전자를 전달하는 데 유용한 실험실 도구입니다. 몇 가지 예로는 외인성 리포터 유전자, 과발현 카세트, RNA 간섭 및 게놈 전체 스크리닝을 포함한 CRISPR 기반 도구가 있습니다. rAAV 형질주입은 전기천공법 또는 화학적 형질주입보다 세포에 덜 해로우며 생산을 위해 특별한 장비나 고가의 시약이 필요하지 않습니다. rAAV를 함유한 미처리 용해물 또는 컨디셔닝된 배지는 추가 정제 없이 배양된 세포에 직접 첨가하여 많은 세포 유형을 transduction할 수 있으며, 이는 rAAV의 과소평가된 특징입니다. 여기서는 기본 전이유전자 카세트 클로닝을 위한 프로토콜을 제공하고 미정제 rAAV 제제를 생산하여 배양된 세포에 적용하는 방법을 시연합니다. 원리의 증거로, 우리는 rAAV 응용 분야에서 아직 보고되지 않은 세 가지 세포 유형, 즉 태반 세포, 근아세포 및 소장 오가노이드의 transduction을 입증합니다. 미정제 rAAV 제제의 적절한 용도, 유전자 전달을 위한 rAAV의 한계 및 캡시드 선택에 대한 고려 사항에 대해 논의합니다. 이 프로토콜은 연구자가 번거로운 적정 및 정제 단계 없이 rAAV를 사용하여 세포 배양에서 생산적인 DNA 전달을 달성할 수 있는 간단하고 저렴하며 효과적인 방법을 설명합니다.
Introduction
세포 기능의 분자 염기를 규명하기 위해서는 세포 배양에서 형질전환 DNA의 발현이 필요한 경우가 많습니다. 발현되기 위해서는 전이유전자가 세포의 선택적 막을 뚫고 들어가 핵 1,2에 도달해야 합니다. 따라서 세포의 물리적 장벽을 효과적으로 우회하고 중심 과정을 조작하는 능력은 새로운 생물학적 현상을 밝히기 위해 형질전환을 적용하는 데 필수적입니다. 한 가지 접근법은 바이러스가 외래 DNA를 전달하고 발현하는 고유한 능력을 이용하는 것이다 3,4.
아데노 관련 바이러스(AAV)는 가장 작은 포유류 바이러스 중 하나로, 4.7킬로베이스(kb)의 단일 가닥 DNA 게놈에는 25nm 크기의 60mer 이십면체 캡시드 안에 포장된 rep(복제용)와 cap(캡시드용)이라는 두 개의 유전자가 포함되어 있습니다. rep/cap 유전자는 바이러스 복제, 생산 및 패키징에 필요한 최소 9개의 고유한 단백질을 암호화하는 다중 프로모터, 판독 프레임 및 스플라이스 산물을 가지고 있습니다 5,6. 또한 게놈의 양쪽 말단에는 형질도입 중 DNA 복제, 게놈 패키징 및 다운스트림 처리에 필요한 ITR(Inverted Terminal Repeat)이라는 2차 구조가 포함되어 있습니다 7,8,9,10. ITR은 게놈을 캡시드로 패키징하는 데 필요한 유일한 DNA 요소이므로, AAV는 바이러스 rep/cap 유전자를 연구자가 선택한 조절 요소 및/또는 관심 유전자로 대체하여 전이유전자 전달 목적으로 클로닝할 수 있다6. 그 결과 조작된 벡터 게놈(VG)을 가진 재조합 AAV(rAAV)는 인간 유전자 치료를 위한 클리닉에서 널리 사용되며 성공을 거두었습니다11. 벡터의 과소 평가 된 사용은 실험실에 있습니다. rAAV는 배양된 세포에서 전이유전자 발현을 효율적으로 달성하여 연구자의 실험적 요구를 충족시킬 수 있다12.
rAAV를 생산하는 가장 일반적인 방법은 HEK293 또는 293T 세포에 삼중 플라스미드 transfection을 하는 것입니다(그림 1). 일반적으로 시스 플라스미드(cis plasmid)라고 불리는 첫 번째 플라스미드는 ITR(pAAV)이 측면에 있는 원하는 전이유전자(transgene)를 포함합니다. 용도에 따라 strong promoter 또는 CRISPR 기반 도구와 같은 공통 요소를 가진 cis plasmid를 구입할 수 있습니다. 두 번째는 trans 내에서 제공되는 야생형 AAV rep 및 cap 유전자를 포함하는 pRep/Cap 플라스미드로, cis 플라스미드와 상호 작용하는 조절 및 구조 요소를 발현하는 별도의 non-ITR 함유 플라스미드에 포함되어 있으므로 trans 플라스미드라고 합니다. VG를 물리적으로 둘러싸는 것 외에도 캡시드는 세포 영양성12,13에 영향을 미칩니다. 혈청형 특이적 캡 유전자를 trans 내에서 제공함으로써 연구자들은 주어진 표적 세포에 최적화된 캡시드 혈청형을 선택하여 형질도입 효율을 쉽게 극대화할 수 있습니다. 마지막으로, Dependoparvovirus로서, AAV는 pAdΔF614,15와 같은 제3의 플라스미드에 제공된 아데노바이러스 도우미 유전자에 의해 달성되는 바이러스 프로모터의 rep/cap 발현을 활성화하기 위해 도우미 바이러스를 필요로 합니다. 72시간의 triple-plasmid transfection 후, 벡터는 반복적인 동결/해동 주기를 통해 생산자 세포에서 배양 배지로 방출될 수 있습니다. 그런 다음 전체 플레이트 내용물을 수집하고 원심 분리로 큰 세포 파편을 제거합니다. 생성된 배지 상층액은 다운스트림 형질도입을 위해 준비된 미처리 rAAV 제제입니다.
그림 1: 미처리 rAAV 벡터 생산 개요. 원유 rAAV 생산 및 형질도입은 5일 이내에 완료될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
rAAV는 전기천공법 또는 화학적/지질-기반 형질주입과 같이 세포 독성, 낮은 효율, 고가의 시약 및 장비와 일반적으로 연관되는 다른 형질주입 방법에 비해 전이유전자 전달에 더 유리할 수 있다16,17. rAAV는 이러한 장애물을 우회하여 독성을 최소화하고 실습 시간을 최소화하면서 강력한 전이유전자 발현을 제공하는 경우가 많습니다. 중요한 것은 rAAV를 생산하고 세포 배양에 적용하는 것이 간단하며 배양 배지에서 벡터를 정제할 필요가 거의 없다는 것입니다(그림 1). 또한, rAAV는 렌티바이러스 전이유전자 전달(Lentiviral transgene delivery)과 달리 VG를 숙주 게놈에 통합하지 않으며, 따라서 삽입 돌연변이 유발(insertional mutagenesis)의 위험을 낮춘다18. 전이유전자 전달을 위해 rAAV를 사용하는 것의 잠재적인 이점에도 불구하고, 한계점을 고려해야 한다. 중요한 것은 ITR을 포함한 전이유전자의 크기가 캡시드의 물리적 제약으로 인해 4.9kb를 초과해서는 안 되며, 이로 인해 연구자가 큰 조절 요소와 전이유전자를 효과적으로 전달할 수 있는 능력이 제한되어서는 안 된다는 것입니다. 또한, rAAV는 비통합 바이러스이기 때문에, 형질도입은 분열하는 세포에서 일시적인 전이유전자 발현을 초래하며, 안정적인 발현을 위해 실용적이지 않을 수 있다. 그러나, 연구자가 원하는 경우 이중 rAAV-전달 Cas9 및 상동성 지향 복구(homology-directed repair, HDR) 템플릿을 사용하는 방법을 사용하여 특정 게놈 유전자좌(genomic loci)에 서열을 안정적으로 삽입할 수 있다19.
Protocol
1. 플라스미드 획득
참고: 이 프로토콜은 거대세포바이러스(CMV) 프로모터와 SV40 폴리-아데닐화 서열(pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40)이 있는 ITR 함유 플라스미드에 관심 유전자(GOI)를 클로닝합니다. 그러나 이 플라스미드는 rAAV를 생산하기 위해 추가 클로닝 없이 사용할 수 있으며, 편리한 이중 EGFP 및 Luciferase 리포터를 패키징할 수 있습니다. CRISPR 기반 실험과 같이 다양한 조절 요소 또는 다양한 응용 분야를 위한 플라스미드는 온라인에서 사용할 수 있으며 아래와 유사한 클로닝 단계를 따릅니다(추가 클로닝 단계는 토론 참조). 또한, 다양한 혈청형에 대한 rep/cap 또는 trans 플라스미드를 사용할 수 있으며, 이 프로토콜은 AAV 혈청형 2에 대해 rep/cap을 사용합니다.
- ITR 함유 시스 플라스미드, 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드, rep/cap 플라스미드 및 GOI를 함유한 플라스미드를 포함하는 박테리아 찌르기를 구입합니다. 각 플라스미드의 내성에 특이적인 항생제를 함유한 개별 한천 플레이트에 박테리아를 줄무늬로 만듭니다. 박테리아를 30°C에서 하룻밤 동안 배양하여 성장시킵니다.
참고: GOI가 있는 플라스미드를 쉽게 구입할 수 없는 경우, 합성 DNA 단편( 재료 표 참조)을 온라인으로 구입할 수 있습니다. 게다가, 합성 DNA 파편은 전체 PCR 과정을 원하는 경우에 건너뛰기 위하여 이용될 수 있습니다. - 각 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 해당 항생제가 보충된 Luria Bertani(LB) 완충액 3mL에서 30°C에서 밤새 180rpm으로 흔들면서 성장시킵니다. 박테리아 1mL를 해당 항생제가 보충된 50mL의 LB 완충액이 들어 있는 멸균 250mL 삼각 플라스크에 옮깁니다. 30°C, 180rpm에서 하룻밤 동안 흔듭니다.
- 박테리아를 50mL 원뿔형 튜브에 옮기고 실온에서 3,000 x g에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리십시오. 제조업체의 지침에 따라 endotoxin-low 또는 -free midiprep kit를 사용하여 플라스미드를 분리합니다.
참고: ITR은 불안정한 구조입니다. ITR 결실 또는 돌연변이를 방지하기 위해 박테리아 세포는 30°C에서 성장하여 세포 분열을 늦추고 복제 오류를 완화해야 합니다. 플라스미드 수율과 순도를 높이려면 midiprep 또는 maxiprep 키트가 이상적입니다. 세포의 다운스트림 내독소 오염을 줄이기 위해 내독소가 적거나 없는 키트를 사용하는 것이 좋습니다. 플라스미드 분리는 층류 후드 내에서 수행할 필요가 없는데, 이는 표준 벤치에서 수행할 경우 플라스미드 전처리의 오염 가능성이 낮기 때문입니다.
2. 관심 유전자를 AAV ITR 함유 플라스미드로 클로닝
- DNA 관찰 소프트웨어에서 GOI가 포함된 플라스미드 맵을 엽니다.
참고: ITR을 포함한 전체 카세트는 캡시드의 물리적 패키징 제한으로 인해 4.9kb를 초과해서는 안 됩니다. 또한 PCR 증폭은 2차 구조로 인해 ITR을 통해 달성할 수 없습니다. 따라서 Gibson 어셈블리는 rAAV 전이유전자 클로닝에 권장되지 않습니다.- Sequence 탭을 클릭하여 plasmid의 전체 염기서열을 표시합니다. GOI 염기서열의 5' 가장 가까운 영역으로 스크롤하고 첫 번째 뉴클레오티드를 클릭하면서 유전자 본체 쪽으로 안쪽으로 드래그하여 전방 프라이머를 생성합니다. ~55°C의 용융 온도(Tm)에 도달하면 방출합니다.
- Forward Primer(프라이머 전달)를 클릭합니다. 프라이머 염기서열의 5' 말단에 EcoRI 제한 부위(5' GAATTC 3')에 대한 염기서열을 수동으로 포함합니다. 게다가, 효소가 DNA와 능률적으로 상호 작용하는 것을 허용하기 위하여 이 제한 부위의 5' 끝에 6개의 여분 무작위 기초를 추가하십시오. Add Primer(프라이머 추가)를 클릭합니다. 대표적인 예는 그림 2를 참조하십시오.
- 프라이머가 헤어핀이나 프라이머 이량체를 형성할 수 없는지 확인하십시오(회문인 제한 부위 제외). 헤어핀이 형성되면 6개의 추가 밑변의 무작위 시퀀스를 변경합니다. 또한 프라이머가 플라스미드의 다른 곳과 결합하지 않도록 합니다.
- 단계를 반복하여 유전자 본체 안쪽으로 GOI의 3' 가장 높은 영역에 역 프라이머를 만듭니다. Reverse Primer 를 클릭하고 NotI 제한 사이트(5' GCGGCCGC 3')를 포함합니다.
참고: GOI는 EcoRI 또는 NotI 제한 부위를 포함할 수 없습니다 – 그렇다면 다른 제한 효소를 사용해야 합니다.
- 50 μL PCR 반응에서 GOI를 증폭합니다. 표 1의 필수 개별 구성 요소를 사용합니다.
- 반응을 열순환기에 넣고 프로그래밍을 위해 표 2 의 사이클 매개변수를 따릅니다. 프라이머의 Tm이 다른 경우프로그램에 더 낮은 Tm을 사용하십시오.
- PCR 반응 5μL에 1μL의 겔 로딩 염료(6x)를 추가하여 올바른 PCR 단편의 증폭을 확인합니다. 브롬화 에티듐을 함유한 0.8% 아가로스 겔에 DNA 사다리와 PCR 혼합물을 실행하고 UV 광으로 시각화합니다.
주의: 에티듐 브로마이드는 알려진 돌연변이 유발 물질입니다. - 겔에 특정 띠 하나가 나타나면 제조업체의 지침에 따라 컬럼 기반 PCR 클린업 키트를 사용하여 PCR 스트립 튜브에 남아 있는 PCR 산물을 정제합니다. 여러 밴드가 나타나는 경우(비특이적 증폭으로 인해) 원하는 밴드를 절제하고 제조업체의 지침에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 DNA를 정제합니다.
- 정제된 PCR 산물과 pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 backbone plasmid를 표 3 의 필수 개별 성분과 50μL 반응으로 37°C에서 1시간 동안 분해합니다. 겔 추출 후 비효율적인 회수가 예상되기 때문에 더 많은 양의 pAAV 플라스미드 DNA가 필요합니다.
참고: 사용된 제한 효소는 고충실도(HF) 버전입니다. 일반 NotCutSmart 버퍼와 함께 사용할 수 없습니다. 다른 효소를 사용하는 경우 다른 배양 온도와 완충액이 필요할 수 있습니다.- 제조업체의 지침에 따라 컬럼 기반 PCR 세척 키트로 분해된 PCR 산물을 정제합니다.
- 분해 반응 50μL에 10μL의 겔 로딩 염료(6x)를 첨가하여 겔 전기영동을 위해 분해된 pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 백본 플라스미드를 준비합니다. 넓은 이빨 웰이 있는 에티듐 브로마이드가 함유된 0.8% 아가로스 겔에 DNA 래더, 소화 반응 및 250ng의 소화되지 않은 플라스미드(음성 대조군)를 로드합니다. UV 광선으로 시각화하고, 원하는 단편(~4.5kb)을 절제하고, 제조업체의 지침에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 DNA를 정제합니다.
- 20μL ligation 반응에서 절단된 PCR 산물과 분해된 pAAV 골격 플라스미드를 표 4의 필수 개별 성분과 결찰합니다. 필요한 PCR 산물의 양을 계산하려면 화학식 1을 사용하십시오. 일반적으로 PCR 산물(삽입물)과 백본(pAAV)의 3:1 몰비를 사용하며 질량은 50ng 백본입니다.
화학식 1 - PCR 산물을 물로 대체하여 음성 대조를 수행합니다. 16°C에서 밤새 또는 실온에서 2시간 동안 결찰 반응을 배양합니다.
- 유능한 재조합 결핍 박테리아 세포(예: Stbl3 세포)의 바이알을 얼음 위에서 해동하고 50μL를 1.5mL 튜브에 넣습니다. 3μL의 결찰 반응을 세포에 직접 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
참고: ITR은 불안정한 구조이므로 ITR 결실 및 재조합 이벤트를 제한하기 위해 재조합 결핍 박테리아 균주가 필요합니다. DH5α 세포는 증식을 위해 간헐적으로(1회 또는 2회) 사용할 수 있지만 장기간 사용에는 권장되지 않습니다. ITR 무결성은 미디프렙 정제 후 정기적으로 점검해야 합니다.- 42°C 수조에서 박테리아를 30초 동안 열충격한 다음 즉시 얼음으로 2분 동안 옮깁니다. 200μL의 LB 버퍼를 추가하고 30°C, 180rpm에서 1시간 동안 흔들어 줍니다.
- 혼합물 125μL를 해당 항생제와 함께 한천 플레이트에 펴 바르고 30°C에서 밤새(~18시간) 배양합니다. 여러 클론을 선택하고 해당 항생제가 들어 있는 3mL의 LB가 있는 멸균 플라스틱 배양 튜브에 각각 넣습니다. 30°C, 180rpm에서 밤새 진탕하여 배양합니다.
참고: ITR 결실 또는 돌연변이를 방지하려면 박테리아 세포를 30°C에서 성장시켜 세포 분열을 늦추고 복제 오류를 완화해야 합니다. 또한 ITR이 없는 식민지가 다른 식민지보다 성장 이점이 있을 수 있으므로 더 작은 식민지를 선택해야 합니다. - 각 배양액 1.8mL를 2mL 튜브에 피펫팅하고 실온에서 3분 동안 6,000 x g 으로 원심분리합니다. 미니프렙 키트를 사용하여 DNA를 분리합니다. 나머지 배양액 1.2mL를 4°C에서 보관합니다. DNA 염기서열분석 또는 진단 제한 효소 분해를 통해 올바른 클론을 검증합니다.
참고: 인서트의 Sanger 염기서열분석이 권장되지만 ITR을 통한 진행도는 표준 방법으로는 달성할 수 없습니다. ITR은 아래에 설명된 대로 제한 다이제스트를 통해 확인해야 합니다. - 해당 항생제가 들어 있는 LB 완충액 50mL를 멸균된 250mL 삼각 플라스크에 추가합니다. 남은 배양액 500μL를 플라스크에 넣고 30°C, 180rpm에서 0.2-0.5의 OD600 에 도달할 때까지(~18시간) 흔듭니다. 박테리아를 50mL 원뿔형 튜브에 옮기고 3,000 x g, 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다. 내독소가 적거나 없는 midiprep 키트를 사용하여 DNA를 분리합니다.
- XmaI(또는 SmaI)를 사용하여 20μL의 진단 제한 효소 분해물로 ITR 무결성을 확인합니다. 500ng 플라스미드, 0.5μL의 효소 및 1x 완충액을 포함하는 반응을 준비합니다. 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 0.8% 아가로스 겔에 대한 반응을 실행합니다. ITR이 손상되지 않은 경우 분해는 ~2.9kb의 밴드와 카세트 크기의 다른 밴드를 제공합니다. 이 뚜렷한 밴드가 관찰되지 않으면 ITR이 손상되지 않을 수 있으며 복제를 다시 수행해야 합니다.
참고: XmaI(또는 SmaI) 제한 부위(ITR에 있는 것 외에)를 포함하는 플라스미드는 겔에 추가 밴드가 나타납니다.
화학식 1
그림 2: 프라이머 설계의 대표적인 예. mScarlet 전이유전자에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 설계(대표 예). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 분량 | 구성 요소 |
| X μL | 템플릿 DNA(25ng) |
| 1 μL | F 프라이머(10μM) |
| 1 μL | R 프라이머(10μM) |
| 1 μL | dNTP(10mM) |
| 10 μL | Phusion 완충액 (5x) |
| 1 μL | Phusion 중합효소 |
| X μL | 물 |
| 50 μL | 최종 볼륨 |
표 1: PCR 증폭 시약. 성공적인 PCR 반응에 필요한 구성 요소.
| 걸음 | 온도 | 시간 |
| 초기 변성 | 98 캜 | 1 민 |
| 30 사이클 | 98 캜 | 10들 |
| 뇌관의 Tm | 30들 | |
| 72 캜 | kb당 30초 | |
| 최종 확장 | 72 캜 | 10분 |
| 들다 | 4 캜 | 막연히 |
표 2: PCR 증폭 프로그래밍. 성공적인 PCR 반응을 위해 필요한 사이클링 파라미터.
| 분량 | 구성 요소 |
| X μL | PCR 산물(1μg) 또는 pAAV 플라스미드(3μg) |
| 5 μL | 버퍼(10x) |
| 1 μL | 에코리-HF |
| 1 μL | NotI-HF (영어) |
| X μL | 물 |
| 50 μL | 최종 볼륨 |
표 3: 분해 시약. 성공적인 분해 반응에 필요한 성분.
| 분량 | 구성 요소 |
| X μL | 인서트(X ng) |
| X μL | 백본(50ng) |
| 2 μL | T4 DNA 리가아제 완충액 (10x) |
| 1 μL | T4 DNA 리가아제 |
| X μL | 물 |
| 20 μL | 최종 볼륨 |
표 4: 결찰 시약. 성공적인 결찰 반응에 필요한 구성 요소.
3. triple-plasmid transfection을 이용한 벡터 생산
참고: 다음 값은 2mL의 최종 조제 부피를 산출하는 6웰 플레이트의 단일 웰에 최적화되어 있습니다. 최종 부피가 20mL인 15cm 플레이트의 경우 모든 값을 10배 확대하거나 최종 부피가 500μL인 24웰 플레이트의 경우 4배 축소할 수 있습니다.
- PEI MAX 100mL를 증류수 100mL에 녹여 폴리에틸렌늄 염산염(PEI) MAX 1μg/μL를 만듭니다. NaOH로 pH를 7.1로 조정합니다. 0.22μm 필터로 혼합물을 여과하고 장기 보관을 위해 -20°C에서 1mL 부분 표본을 동결합니다. 해동되면 시약을 4°C에서 1개월 동안 보관합니다.
- 3 x 105 HEK293 또는 HEK293T 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 미리 예열된 Dulbecco's modified eagle 배지(DMEM, 4.5g/L 포도당, 110mg/L 피루브산 나트륨)와 함께 6웰 플레이트에 파종합니다. 37 ° C 및 5 % CO2 로 설정된 인큐베이터에서 ~ 75 % -90 % 밀도로 성장합니다 (그림 3).
참고: 페니실린/스트렙토마이신(P/S)으로 배양한 세포는 벡터 생산 수율을 감소시키는 것으로 관찰되었습니다. 적절한 멸균 기술을 사용하면 P/S를 사용할 필요가 없으므로 항생제20으로 HEK293 세포를 배양하지 않는 것이 좋습니다. 다운스트림 트랜스덕션에서 P/S가 필요한 경우, 수확 후 원유 준비에 P/S를 추가하는 것이 좋습니다. - 2mL 튜브에 1.3μg pAAV2/2(Rep/Cap, 혈청형 2), 1.3μg pAAV.GOI, 2.6μg pAdΔF6 및 무혈청(SF) DMEM(4.5g/L 포도당, 110mg/L 피루브산 나트륨)을 함유한 혼합물을 총 부피 100μL로 준비합니다(편리한 계산을 위해 보충 표 1 참조).
- pRep/Cap을 관련 없는 플라스미드로 대체하여 별도의 튜브에 negative control을 준비합니다. 음성 대조군은 드물기는 하지만 형질도입 중에 세포를 transfection할 수 있는 미처리 제제에 존재하는 포장되지 않은 pAAV.GOI 플라스미드를 설명합니다.
참고: 내독소가 적거나 없는 maxiprep 또는 midiprep plasmid는 triple-transfection에 이상적이며, miniprep DNA는 빠르고 더러운 예비 검사에 사용할 수 있지만, 일반적으로 miniprep DNA에 비해 더 높은 titer 벡터를 생성합니다. - 5.2 μL의 PEI MAX를 플라스미드 혼합물에 첨가합니다. 이것은 1:1 비율의 플라스미드:PEI 혼합물입니다. 10으로 설정된 와류 믹서에서 15-7회 펄스하여 잘 섞습니다. 여러 벡터 제제가 생성되는 경우, 1분의 시차를 두고 각 플라스미드 혼합물에 PEI를 첨가하여(즉, t = 0분에서 제제 1, t = 1분에서 제제 2 등) 웰을 흡인하고 다음 단계에서 반응을 희석할 수 있는 충분한 타이밍을 확보합니다.
참고: plasmid:PEI의 1:1 비율이 최적인 것으로 관찰되었습니다. 그러나 개별 사용자는 최대 효율성을 위해 이 비율을 최적화할 수 있습니다. PEI 최적화를 수행하는 방법에 대한 설명을 참조하십시오( 보충 표 2 참조). - 각 튜브를 정확히 15분 동안 배양한 다음 1.9mL의 SF DMEM(4.5g/L 포도당, 110mg/L 피루브산 나트륨)으로 반응을 희석하여 최종 부피 2mL로 만듭니다. 부드럽게 피펫팅하여 2번 섞습니다. 과혼합은 Plasmid/PEI 복합체를 파괴하고 transfection 효율을 낮춥니다.
- 웰에서 배지를 흡인하고 세포 분리를 방지하기 위해 웰 측면에 플라스미드:PEI 혼합물을 부드럽게 첨가합니다. 37 °C 및 5 % CO 2 에서 72 시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 중 세포 용해 및 분리는 rAAV 생산의 정상적인 과정입니다(그림 4).
그림 3: transfection을 위한 HEK293 세포. 삼중 플라스미드 transfection에 필요한 HEK293 세포의 이상적인 밀도(75%-90%). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: transfection 후의 HEK293 세포. transfection 후 1, 2 또는 3일 전후의 HEK293 세포의 pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 및 플라스미드의 1:1 비율:PEI 스케일 바: 400 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 조잡한 벡터 제제 수확
- 형질주입된 세포의 전체 플레이트를 -80°C에서 30분 동안 동결한 후 37°C에서 30분 동안 해동합니다. 총 3번의 동결/해동 주기 동안 반복합니다. 뚜껑을 제거하지 마십시오 - 플레이트 내부는 멸균 상태여야 합니다. 플레이트는 다음 단계로 진행할 준비가 될 때까지 -80°C를 유지할 수 있습니다.
알림: 가습되지 않은 인큐베이터는 해동에 가장 적합하며, 우발적인 오염으로 이어질 수 있는 플레이트 외부의 응결을 최소화합니다. - 무균 기술을 사용하여 층류 후드에서 다음 두 단계를 수행합니다. 세포의 최대 파괴를 보장하기 위해 피펫팅으로 각각을 잘 혼합합니다. 용해물을 2mL 튜브로 옮기고 실온에서 15,000 x g에서 15분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.
- 상층액을 새 2mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 이 조제는 적정 또는 정제 없이 즉시 사용할 수 있습니다. 벡터는 4°C에서 수개월 또는 -20°C에서 수년간 보관할 수 있습니다.
참고: 필요한 경우 DNase 내성 입자 내부의 벡터 게놈(VG) 수를 정량화하여 정량적 PCR(qPCR)로 역가를 계산할 수 있습니다. 따라서 역가는 VG/mL 단위로 제공됩니다. 4°C에서 수개월 동안 보관된 벡터는 튜브 벽을 응집 및/또는 결합하여 전처리의 역가를 감소시킬 수 있으므로 사용하기 전에 다시 적정해야 합니다.
5. 형질도입
- 형질도입 기간에 따라 50%-75%의 표적 밀도로 96웰 플레이트에서 원하는 세포 유형(예: Huh7)을 플레이트합니다. 밀도가 높을수록 AAV 형질도입 효율이 감소할 수 있습니다.
- 새로운 세포 유형에서 transduction을 위한 캡시드 패널 테스트와 같이 투여량이 관련이 없는 응용 분야를 위해 미처리 제제의 역가를 모른 채 세포에 벡터(예: CMV.mScarlet)를 추가합니다. 무혈청(SF) 배지에서 조제 제제를 1:3 희석하여 응용에 필요한 최적의 벡터 양을 얻습니다. 96웰 플레이트에서 배지를 흡입하고 50-100μL의 희석된 원유 제제를 웰에 추가합니다. 37 °C 및 5 % CO 2 에서 세포를 배양합니다.
참고: 혈청에는 AAV 벡터를 중화하고 transduction 효율을 감소시킬 수 있는 항체가 포함될 수 있습니다. 그러나 민감한 세포 유형에 대해 형질도입 중에 혈청을 사용할 수 있습니다. - 형질도입 후 48시간(hpt) 후 벡터를 제거하고 미리 예열된 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 한 번 세척합니다. 벡터는 또한 민감한 세포 유형에 대해 2 hpt의 경우 혈청 함유 배지로 제거하고 대체할 수 있습니다. 많은 응용 분야에서 하룻밤 배양을 수행하여 세포를 transduction하고 아침에 웰을 신선한 혈청 함유 배지로 교체합니다. Huh7 및 U2-OS와 같은 강력한 셀 유형은 배지 교체가 필요하지 않습니다.
- 세포를 4% 파라포름알데히드(PFA)에 10분 동안 고정하여 형질도입을 종료합니다. 또한 용도에 따라 다양한 종결 방법(예: lysis)을 사용할 수 있습니다. 대부분의 세포 유형에서 피크 발현은 48 hpt에 의해 발생하므로 일반적인 실험 종점입니다.
6. 세포 유형에 따른 형질도입 방법의 변화
참고: 세포 유형에 따라 다른 배양 조건이 필요합니다. 따라서 transduction을 위한 벡터의 추가는 cell type의 필요에 따라 최적화되어야 합니다. 아래는 대표 결과에 포함된 세포 유형에 대한 매우 구체적인 형질도입 프로토콜로, 연구자가 자신의 필요에 따라 시도할 수 있는 형질도입 프로토콜의 몇 가지 변형을 보여줍니다.
- 마우스 소장 오가노이드
- C57BL/6J 마우스의 소장 크립트 준비에서 마우스 소장 오가노이드(mSIO)를 도출합니다. 오가노이드 성장 배지(항생제 없음) 또는 사전 형질주입 배지(50% Wnt3a 컨디셔닝 배지[오가노이드 성장 배지에서 L Wnt-3A 세포를 사용하여 자체 생산], 10mM 니코틴아미드, 10μM ROCK 억제제 및 2.5μM CHIR99021)를 포함하는 24웰 플레이트에 90% 기저막 매트릭스에 오가노이드를 매립하고 37°C 및 5%CO2에서 형질주입 전 1회 통과(5-7일)에 대해 배양합니다.
- 형질도입 전에 오가노이드를 D-PBS로 헹구고, 피펫팅을 통해 기저막 매트릭스 돔을 파괴하고, 37°C에서 10분 동안 해리 배지에서 배양한 후 추가 피펫팅하여 오가노이드를 작은 세포 클러스터로 해리합니다.
- 15mM HEPES로 DMEM/F-12에 5% FBS를 추가하여 세포 해리 과정을 중지하고, 세포 클러스터를 원심분리 튜브로 옮기고, 실온에서 1000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 클러스터를 수집합니다.
- 형질주입 배지(10μg/mL 폴리브렌을 함유한 형질도입 전 배지 또는 10μg/mL 폴리브렌을 함유한 오가노이드 성장 배지)에 세포 클러스터를 재현탁시키고 48웰 플레이트로 옮긴 다음 형질주입을 위해 CMV.mScarlet을 포장하는 AAV 원유 제제를 첨가합니다.
- 600 x g 및 37°C에서 1시간 동안 플레이트를 원심분리하여 오가노이드의 transduction을 수행한 다음 37°C에서 추가로 6시간 동안 배양합니다. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 transduction된 오가노이드를 수집하고 실온에서 1000 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 얼음 위에 올립니다.
- 상층액을 제거한 후, 사전 형질도입 배지 또는 오가노이드 성장 배지의 90% 기저막 매트릭스에 형질도입된 오가노이드를 재현탁시키고 20μL의 종자 방울을 예열된 챔버 커버 유리의 웰 1웰에 재현탁시킵니다.
- 인큐베이터에서 10분 동안 배양한 후 350μL의 사전 transduction 배지 또는 오가노이드 성장 배지에 방울을 담그고 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다. 컨포칼 현미경에서 형질도입된 오가노이드를 이미징하여 형질도입 후 2-5일 후에 형질도입 효율을 측정하고 오가노이드당 적색 형광 세포의 비율을 추정합니다.
- BeWo 세포
- 형질도입 전 24시간에 인간 태반 융모암 BeWo 세포를 96웰 플레이트의 웰당 10,000개 세포로 플레이트합니다. 무혈청 F12-K BeWo 배지에서 CMV.mScarlet을 웰당 최대 50μL의 총 부피까지 1:1로 희석하여 조잡한 AAV 제제 포장 CMV.mScarlet을 희석합니다. 웰에서 배지를 흡입하고 웰당 50μL의 희석된 AAV로 교체합니다.
- 37°C에서 하룻밤 동안(~18시간) 세포를 배양한 다음 10% FBS가 포함된 F12-K BeWo 배지 100μL를 추가하여 총 부피를 150μL로 올립니다. 형질도입 후 총 24시간 동안 추가로 6시간 동안 세포를 배양합니다(hpt).
- 이미징을 위해 F12-K 배지에서 30분 동안 Hoechst 염료로 살아있는 세포를 염색한 다음 이미징을 위해 10% FBS, 1x 글루타맥스 보충제 및 1x 피루브산 나트륨 보충제가 포함된 페놀 프리 DMEM으로 배지를 교환합니다. 37°C 및 5%CO2의 DAPI(Hoechst 이미징용) 및 mCherry(mScarlet 이미징용) 필터 세트를 사용하여 컨포칼 현미경에서 라이브 셀 이미징을 수행합니다.
- Hepa1-6 및 Huh7 세포
- 형질도입 24시간 전에 96웰 플레이트의 웰당 5,000개 세포에서 DMEM(4.5g/L 포도당, 110mg/L 피루브산나트륨, 10% FBS)의 플레이트 뮤린 Hepa1-6 간 세포 및 인간 Huh7 간 세포.
- CMV.mScarlet을 포장하는 희석되지 않은 원유 AAV 제제 50μL를 세포에 직접 첨가하고 37°C에서 48시간 동안 배양합니다. PBS에서 세포를 한 번 세척하고 4% PFA로 고정한 다음 Hoechst 염료로 10분 동안 염색합니다. DAPI(Hoechst 이미징용) 및 mCherry(mScarlet 이미징용) 필터 세트를 사용하여 컨포칼 현미경에서 이미징을 수행합니다.
- C2C12 및 HSkMC 세포
- 형질도입 72시간 전에 96웰 플레이트의 웰당 5,000개 세포에서 미분화 쥐 C2C12 근아세포와 미분화 인간 일차 골격근 세포(HSkMC) 근아세포를 플레이트화합니다.
- C2C12 근아세포의 경우 또는 HSkMC 근아세포의 경우 골격근 성장 배지의 경우 CMV.mScarlet을 DMEM(4.5g/L 포도당, Penn/Strep, 20% FBS)에서 1:1로 희석하여 조잡한 AAV 제제 포장 CMV.mScarlet을 합니다. 배지를 분화 배지로 변경하여 HSkMC 근아세포를 근관으로 분화합니다.
- 37°C에서 24시간 동안 희석된 AAV 제제에 근아세포와 근튜브를 배양합니다. 살아있는 세포를 Hoechst 염료로 10분 동안 염색하고 DAPI(Hoechst 이미징용) 및 mCherry(mScarlet 이미징용) 필터 세트를 사용하여 컨포칼 현미경으로 이미지를 만듭니다.
Representative Results
관심 배양 세포를 transduction하기 위한 최적의 캡시드 찾기
다양한 캡시드 혈청형의 영양성을 측정하기 위해 다양한 세포 유형을 transduction했습니다(그림 5). 천연 혈청형 AAV214, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24 및 조작된 캡시드 변이체 Anc80 25, DJ 26, LK0327 및KP1 28은 CMV 프로모터 하에서 mScarlet을 발현하는 벡터 게놈으로 패키징하고, 이 프로토콜에 제공된 방법을 사용하여 클로닝하였다. 적정되지 않은 미처리 벡터 제제를 적절한 배양 배지에 희석하고 세포를 24+ 시간 동안 형질도입하고 이미지화했습니다(그림 5B). 형질도입 효율은 mScarlet+인 전체 세포의 비율 또는 단일 z-평면에서 mScarlet+인 세포의 비율(마우스 소장 오가노이드의 경우; 그림 5C). 형질도입 효율(mScarlet+ 세포)은 분화된 C2C12 및 HSkMC 근관에 대해 제공되는 것이 아니라 미분화된 C2C12 및 HSkMC 근아세포에 대해 제공됩니다(그림 5A).
AAV2 및 KP1은 테스트된 세포주에서 가장 강력한 혈청형이었습니다(그림 5A). 또한 상이한 종에서 유래한 유사한 세포 유형이 다양한 효율로 형질도입되는 것이 관찰되었습니다. 예를 들어, AAV2를 사용할 때 Hepa1-6(쥐 유래 간 세포주)은 Huh7(인간 유래 간 세포주)에 비해 형질도입이 현저히 감소합니다(그림 5B). 더욱이, 다양한 배지 조건은 형질도입 중에 중요한 역할을 합니다. 형질도입 전 배지에서 배양된 마우스 소장 오가노이드(mSIO)는 오가노이드 성장 배지에서 배양된 오가노이드에 비해 형질도입 효과가 떨어집니다(그림 5C). 또한 AAV2는 미분화 HSkMC 근아세포와 분화된 HSkMC 근관을 효율적으로 transduction하지만(그림 5B), 근관의 정량 분석은 어렵기 때문에 제공되지 않습니다.
그림 5에서 다양한 세포 유형에 대해 관찰된 높은 transduction 효율은 미처리 벡터 제제를 사용하여 정제 및 적정과 같은 추가 단계 없이 다양한 세포 유형을 transduction하는 데 효과적으로 사용할 수 있음을 보여줍니다. 그러나 전이유전자 전달을 극대화하기 위해 캡시드를 선택할 때 신중하게 고려해야 합니다. 다른 많은 세포주와 캡시드는 이전에 시험되어 발표되었지만, 정제된 벡터 제제를 사용하였다12.
배지 조건의 벡터 입자 독립적 효과는 형질도입의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, tropism(즉, 벡터의 세포 유형 특이적 흡수 및 발현)은 캡시드 특이적특성(capsid specific)인 특성이라는 것이 일반적으로 받아들여지고 있다(29). 용량에 맞는 미정제 제제와 정제된 제제 간의 비교는 아직 세포 영양성에 영향을 미치는 것으로 관찰되지 않았습니다. 그러므로, 미처리 벡터 제제는 세포 배양에서 정제된 벡터와 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
그림 5: 다양한 세포 유형의 조잡한 벡터 transduction . (A) mScarlet 전이유전자를 포함하는 다양한 AAV 벡터를 추가한 후 mScarlet +의 백분율. (B) AAV 혈청형 2에서 전달된 mScarlet 을 발현하는 세포. 척도 막대: 100μm(Hepa1-6, Huh7, C2C12 및 HSkMC), 200μm(BeWo), 20μm(mSIO). 약어: hpt = transduction 후 시간. (C) 마우스 소장 오가노이드(mSIO)는 형질도입 전 배지 또는 오가노이드 성장 배지에서 rAAV를 처리했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: Triple plasmid transfection worksheet. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: PEI 최적화 워크시트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
클로닝
클로닝 프로토콜은 위에서 사용한 pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 플라스미드에 국한되지 않으며 연구자의 실험적 필요에 따라 쉽게 변경할 수 있습니다. 많은 ITR 함유 플라스미드는 온라인에서 쉽게 구입할 수 있습니다. 예를 들어, Cas9 및 sgRNA 클로닝 부위를 모두 포함하는 플라스미드를 사용할 수 있지만 올리고뉴클레오티드 어닐링 및 PNK 처리와 같은 몇 가지 추가 단계가 필요합니다30. 또한, ITR만 있고 내부 조절 요소가 없는 다중 클로닝 사이트(MCS)를 함유하는 플라스미드가 발견될 수 있다31. 다른 플라스미드를 사용하는 경우, 분해에 사용되는 제한 효소(RE)는 일반적으로 이 프로토콜에서 변경해야 할 수 있는 유일한 요소입니다. 그러나 rAAV의 한계는 제한된 화물 용량입니다. 캡시드의 물리적 한계로 인해 벡터 게놈은 ITR을 포함하여 4.9kb를 초과해서는 안 됩니다.
박테리아에서 플라스미드를 분리할 때, 삼중 플라스미드 transfection 또는 transduction 중 세포에 대한 손상을 완화하기 위해 endotoxin-low 또는 -free midiprep 또는 maxiprep kit를 사용하는 것이 중요합니다. miniprep 키트의 플라스미드는 종종 더 높은 불순물, 감소된 농도 및 더 적은 supercoiled DNA를 포함하며, 이 모든 것이 rAAV의 다운스트림 생산에 영향을 미칠 수 있으므로 권장되지 않습니다.
복제 중에 ITR의 구조와 특성을 이해하는 것이 중요합니다. 첫째, ITR을 통해 PCR을 사용하는 것은 매우 어렵습니다. ITR을 통한 PCR 증폭이 필요한 클로닝 설계는 피해야 하며, Gibson 어셈블리 클로닝 기술의 사용을 추가로 제한해야 합니다. 따라서, 제한효소 클로닝은 ITR-함유 플라스미드로의 클로닝에 선호되는 방법이다. 또한, Sanger 염기서열분석을 위한 특정 프라이머는 염기서열분석된 영역에 ITR이 포함된 경우 호환되지 않을 수 있습니다. 대신, 보다 정확한 염기서열 분석 결과를 얻기 위해 ITR에서 벡터 게놈 본체로 염기서열을 분석하는 프라이머를 사용하는 것이 좋습니다. 둘째, ITR은 플라스미드 증폭을 위해 박테리아로 형질전환될 때 결실, 재배열 및 돌연변이가 발생하기 쉽습니다32,33. 이러한 현상을 완화하려면 Stbl3와 같은 재조합 결핍 유능한 박테리아 균주를 사용하고 세포 분열을 늦추기 위해 30°C에서 배양하는 것이 좋습니다. 마지막으로, ITR이 없는 콜로니가 성장 이점을 제공하고 더 클 수 있기 때문에 더 작은 콜로니는 재배열이나 삭제 없이 클론과 일치할 수 있다는 것이 관찰되었습니다. 따라서 작은 식민지를 선택하는 것이 좋습니다.
벡터 제작
rAAV 벡터의 성공적인 생성은 여러 요소의 영향을 받을 수 있습니다. 한 가지 중요한 요소는 transfection에 사용되는 HEK293 또는 293T 세포의 상태입니다. 일반적으로 낮은 통로 수가 이상적인데, 이는 높은 통로 세포가 rAAV 역가를 감소시킬 수 있는 유전형 및 표현형 변이를 나타낼 수 있기 때문입니다. 또한 효과적인 생산을 위해 파종된 세포의 밀도는 75%-90% 밀도여야 합니다. 희소 세포는 벡터를 생성하는 데 사용할 수 있는 세포가 적기 때문에 벡터 수율이 낮고, 과도하게 자란 세포는 효율적으로 transfection되지 않습니다.
시약 로트, 세포 스톡 및 일반적인 실험실 간 변동성 간의 차이는 transfection 효율 및 생산 titer의 차이에 기여합니다. 역가 개선으로 이어질 수 있는 최적화 가능한 인자 중 하나는 transfection 반응에서 plasmid:PEI 비율입니다. 신선한(<1개월) PEI MAX를 사용하는 것이 중요합니다. 1:1의 plasmid:PEI 비율을 시작점으로 사용하는 것이 좋으며, transfection 또는 transduction 효율이 좋지 않은 경우 여러 가지 다른 비율을 테스트합니다. 역가 최적화는 클로닝을 위한 출발 물질로서 본원에 사용된 CMV.Luc.IRES.EGFP 리포터 trangene과 같은 시각적 판독을 갖는 전이유전자를 사용하는 경우에 가장 쉽다. 최적화를 수행하려면 12웰 플레이트를 사용하고 플라스미드 질량과 시약 부피를 2씩 축소하는 프로토콜 단계 3을 따르십시오(최종 플라스미드 질량은 2.6μg). 1:0.75에서 1:3 범위의 비율에 맞게 PEI 부피를 0.25씩 증가시킵니다(그림 6). 각 반응을 15분 후 950μL의 SF 배지로 희석합니다. 편의를 위해, 3중 플라스미드를 포함하는 마스터 믹스를 만들어 PEI를 추가하기 전에 1.5 mL 튜브에 개별적으로 피펫팅할 수 있습니다( 보충 파일 2 참조). 벡터를 채취하고, 관심 세포를 transduction하고, 이미지를 생성합니다. 형질도입 효율(GFP+ 세포의 비율)이 가장 높은 웰은 PEI:DNA의 가장 높은 역가와 최적 비율에 해당합니다.
그림 6: PEI 최적화 워크플로우. PEI 최적화에 필요한 단계 개략도. 플라스미드의 여러 비율: 최적의 비율을 결정하기 위해 PEI를 테스트합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
수확 및 역가 고려 사항
rAAV 벡터를 채취하는 데 사용되는 동결/해동 기술은 정제된 용해물을 직접 사용하여 배양된 세포를 transduction하는 것과 호환되는 방식으로 HEK293 세포를 효과적으로 용해합니다. AAV1, AAV8 및 AAV9와 같은 특정 rAAV 혈청형은 벡터 생산 동안 세포로부터 방출되고, 동결/해동 주기 없이 배양된 세포 배지로부터 수거할 수 있다34. 여기에 설명된 분석법은 일반적으로 AAV2 캡시드를 사용할 때 1 x 10 10 VG/mL 정도, AAV8 사용 시 1 x10 11 VG/mL 정도의 역가를 산출합니다. 세제 또는 기타 화학 기반 용해를 통해 더 높은 역가를 얻을 수 있지만, 이는 다운스트림 사용 시 세포에 유해하며 용해물에서 rAAV를 추가로 정제해야 합니다. 낮은 역가는 연구자가 미정제 제제가 연구 요구에 적합한지 여부를 결정할 때 고려해야 하는 한 가지 절충안이지만, 여기에 설명된 방법으로 생성된 약간 낮은 역가는 많은 세포 유형을 매우 잘 transduction할 수 있습니다(대표적인 결과 참조). transfection 효율 및 세포 건강 외에도 벡터 역가는 rAAV 생산 중에 사용되는 캡시드와 VG35 내 전이유전자의 크기 및 서열에 따라 달라집니다.
미정제 벡터 제제를 수확할 때 triple-plasmid transfection 중에 사용된 plasmid DNA가 존재할 수 있으며, 드물지만 transduction 중 downstream transfection을 초래합니다. 더욱이, 포장되지 않은 VG는 캡시드의 외부에 결합할 수 있고, 벌거벗은 및 외래 단일가닥 DNA에 대한 선천성 면역 반응을 불러일으킬 수 있다36,37. 따라서 민감한 세포 유형에서는 DNase를 분해하고 정제하여 포장되지 않은 VG와 플라스미드를 제거해야 할 수 있습니다.
조잡한 제제의 역가를 계산하고자 하는 경우, qPCR을 수행하여 DNase 내성 입자(DRP) 내에 포장된 VG의 수를 정량화할 수 있습니다. 간단히 말해서, 소량의 미정제 제제를 DNase 분해하여 플라스미드 DNA, 오염 핵산 또는 부분적으로 포장된 VG를 제거합니다. 그런 다음 샘플을 qPCR에 적용하고 DRP 내부의 보호된 VG를 정량화하여 미처리 제제(38)의 mL당 벡터 게놈 단위를 갖는 역가를 생성합니다. 캡시드 역가를 정량화하는 ELISA 기반 분석을 사용하여 벡터 적정을 수행하는 것은 권장되지 않습니다. 야생형 AAV 바이러스와 비교했을 때, rAAV는 비어 있거나 부분적으로 포장된 캡시드의 비율이 높다39. ELISA는 게놈 함량에 관계없이 모든 캡시드를 정량화하고 포장된 VG가 필요한 제제에 존재하는 형질도입 가능한 단위를 과대평가합니다.
Transduction 고려 사항
많은 요인이 rAAV transduction에 영향을 미치며 새로운 실험에 대해 적절한 고려가 이루어져야 합니다. 전이유전자 발현을 유도하는 프로모터에 따라, 발현 개시는 transduction 후 4시간(hpt)에 발생할 수 있으며, 피크 발현은 일반적으로 48 hpt에 의해 달성됩니다. 세포의 초기 파종부터 실험 종점까지의 기간을 염두에 두는 것이 중요합니다. 이것은 세포의 시작 밀도를 추정하고 실험이 끝날 때까지 과도하게 자라지 않도록 하기 위한 것입니다. 세포가 과밀화되면 스트레스 반응으로 인해 세포 행동이 변경되어 실험 결과를 혼란스럽게 할 수 있습니다. U2-OS와 같은 일부 세포 유형은 과증식/접촉 억제를 잘 견딜 수 있습니다. 또한 이 생산 프로토콜의 산물인 무혈청 컨디셔닝 배지에서 장기간(48h+)을 견딜 수 있습니다. 그러나, 민감한 세포 유형은 형질도입 중 건강을 유지하기 위해 특수 성장 배지로 미처리 제제의 혈청 추가 또는 희석이 필요할 수 있습니다. 혈청 함유 배지 사용으로 인한 형질도입 효율이 약간 감소하는 것은 세포 건강에 대한 잠재적인 절충안이며 연구자는 이를 고려해야 합니다.
일반적으로 빠르게 분열하는 세포의 경우 약 50%의 시작 밀도가 48hpt로 종료되는 응용 분야에 최적입니다. 그러나 밀도는 실험의 필요에 따라 적절하게 조정할 수 있습니다. transduction 효율 감소로 인해 75% 이상의 밀도를 초과하는 단층 유형의 불멸화된 세포주를 transduction하는 것은 권장되지 않습니다. 대부분의 배양된 세포 유형은 조잡한 rAAV 제제로 하룻밤 동안 배양한 후 아침에 신선한 혈청 함유 배지로 교체한 후 성공적으로 transduction되고 건강합니다.
캡시드 혈청형은 표적 세포를 transduction하기 위해 rAAV를 생산할 때 고려해야 할 중요한 요소인데, 이는 capsid가 세포 tropism 및 후속 transgene 발현의 주요 결정 인자이기 때문이다13. AAV2는 많은 유형의 배양 세포를 효과적으로 transduction할 수 있는 능력으로 인해 널리 사용되는 혈청형이다12. AAV2의 이러한 특성은 AAV2에 대한 1차 부착 인자 역할을 하는 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(HSPG) 및 배양된 세포에서 적응에서 성장에 이르기까지 높은 수준의 HSPG에 기인할 수 있다(40). AAV9와 같은 다른 캡시드는 광범위한 세포 유형을 형질도입하는데 덜 효과적이며, 이러한 설정에서 발현되지 않는 의존 부착 인자에 의해 설명될 수 있다(41). 따라서 원하는 표적 세포가 이전에 문헌에서 rAAV로 테스트되지 않은 경우 배양된 세포에서 AAV2를 1순위 캡시드로 권장합니다.
미처리 벡터 제제의 주요 한계는 동물 모델을 형질도입하는 데 부적절하다는 점에 유의하십시오. 생체 내 연구에서는 정제 및 품질 평가를 위한 준비가 필요합니다.
전이유전자 발현 및 잠재적 통합 고려사항
rAAV는 전이유전자의 영구적인 발현을 확실하게 초래하지 않습니다. 시간이 지남에 따라, VG는 침묵될 수 있고, 형질전환 발현은 몇몇 구절42에 따라 중단될 수 있다. 또한, VG의 대다수는 일시성체로 남아 있으며, rAAV는 야생형 바이러스 용원 감염에서와 같이 숙주 게놈으로의 빈번한 통합을 매개하거나 VG의 복제를 촉진하는 바이러스 Rep 단백질을 포함하지 않는다43. 결과적으로, 형질도입된 세포의 에피솜은 결국 분열을 통해 딸 세포 사이에서 희석됩니다.
기초 수준 통합은 전달된 모든 형질전환 DNA 물질에 대한 가능성입니다. 그러나, ITR-함유 VG들은 더 높은 주파수(44)에서 통합되는 경향이 있다. 그러므로, 전이유전자의 영구적인 발현은 세포의 작은 부분집합에서 관찰될 수 있다. 사용자는 특히 Cas9과 같은 DNA 절단 효소를 전달하기 위해 rAAV를 사용할 때 이중 가닥 절단이 통합 및 영구 발현의 훨씬 더 큰 빈도를 초래할 수 있기 때문에 이러한 가능성을 고려해야 합니다(45). 이로 인해 rAAV는 내인성 태깅 또는 유전자 추가를 위한 상동성 지향 복구 템플릿을 전달하기 위한 좋은 후보이지만 Cas9 삽입 가능성은19,46으로 간주되어야 합니다.
Disclosures
A.C.M.은 Janssen Pharmaceuticals의 컨설턴트이며 NewBiologix의 SAB에서 근무하고 있습니다. 다른 모든 저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
Robert Tjian과 Xavier Darzacq의 실험실 장비 지원과 사용에 감사드립니다. KP1 및 LK03 rep/cap 플라스미드를 선물해 주신 Mark Kay와 AAV4 rep/cap plasmid를 선물해 주신 Luk Vandenberghe에게 감사드립니다. 자금은 Howard Hughes Medical Institute(34430, R. T.)와 California Institute for Regenerative Medicine Training Program EDUC4-12790에서 제공했습니다. NW는 Siebel 박사후 연구원을 통해 Berkeley Stem Cell Center와 Walter Benjamin 펠로우십을 통해 독일 연구 재단(DFG)의 자금 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Snapgene DNA viewing sofrware | Snapgene | ||
| pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 | AddGene | 105533 | |
| pAAV2/2 (Rep/Cap) | AddGene | 104963 | |
| pAdΔF6 | AddGene | 112867 | |
| LB Agar Carbenicillin | Sigma-Aldrich | L0418 | |
| Boekel Scientific Economy Digital Incubator | Boekel Scientific | 133000 | |
| LB medium, powder | MP Biomedicals | 113002042 | |
| Carbencillin (Disodium) | GoldBio | C-103-5 | |
| New Brunswick I26 Shaker | Eppendorf | M1324-0000 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22627040 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit | Qiagen | 12945 | |
| PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS | USA Scientific | 1402-3900 | |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6333000022 | |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| 5x Phusion Buffer | NEB | B0518S | Provided with purchase of Phusion Polymerase |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Gel Loading Dye, Orange (6X) | NEB | B7022S | |
| DNA Clean & Concentrator-100 | Zymo | D4029 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo | D4001 | |
| NotI-HF | NEB | R3189S | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| CutSmart Buffer (10x) | NEB | B6004S | Provided with purchase of restriction enzyme |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500100 | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with purchase of T4 Ligase |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Precision Microprocessor Water Bath | Thermo Scientific | 51221046 | |
| Sterile Plastic Culture Tubes | Fisher Scientific | 149566B | |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tube | Thomas Scientific | 1149Y01 | |
| ZR Plasmid Miniprep - Classic | Zymo | D4015 | |
| Xma1 | NEB | R0180S | |
| Sma1 | NEB | R0141S | |
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Falcon 6-well | Corning | 353046 | |
| Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo-Fisher | 11995065 | |
| Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 Incubator | Marshall Scientific | MCO-18AIC | |
| PEI MAX (Polyethylenimine Hydrochloride) | Polysciences | 24765-100 | |
| Mixer Vortex Genie 2 | Electron Microscopy Sciences | 102091-234 | |
| Sanyo Ultra Low Freezer | Sanyo | 14656-15267-16219 | |
| INCU-Line IL 10 with transparent window | VWR | 390-0384 | |
| Eppendorf Microcentrifuges | Eppendorf | 05-400-005 | |
| Falcon 96-well | Corning | 353072 | |
| C57BL/6J mice | JAX | strain #000664 | |
| organoid growth medium | STEMCELL Technologies | 6005 | |
| L Wnt-3A cells | ATCC | CRL-2647 | |
| nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72052 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane | Fisher | 356231 | |
| 24-well plate | Fisher | 08-772-1 | |
| D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| TrypLE Express | Fisher | 12604013 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| polybrene | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-3D | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Fisher | 12-565-470 | |
| BeWo cells | ATCC | CCL-98 | |
| F-12K Medium | ATCC | 30-2004 | |
| Hepa1-6 | ATCC | CRL-1830 | |
| Huh7 | UC Berkeley BSD Cell Culture Facility | HUH-7 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| HSkMC | ATCC | PCS-950-010 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth Medium | Sigma | C-23060 | |
| Skeletal Muscle Differentiation Medium | Sigma | C-23061 | |
| Invitrogen EVOS Digital Color Fluorescence Microscope | Fisher Scientific | 12-563-340 | |
| Perkin Elmer Opera Phenix | Perkin Elmer | HH14001000 | |
| PhenoPlate 96-well | Perkin Elmer | 6055302 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Thermo-Fisher | 31053028 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo-Fisher | 35050079 | |
| Sodium Pyruvate | Thermo-Fisher | 11360070 | |
| pAAV2/5 (Rep/Cap) | Addgene | 104964 | |
| pAAV2/8 (Rep/Cap) | Addgene | 112864 | |
| pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap) | Addgene | 130878 | |
| pAAV2/9n (Rep/Cap) | Addgene | 112865 | |
| pAnc80L65AAP | Addgene | 92307 | |
| KP1 (rep/cap) | gifted by Professor Mark Kay (Stanford University) | ||
| LK03 (rep/cap) | gifted by Professor Mark Kay (Stanford University) | ||
| pAAV4 (rep/cap) | gifted by Professor Luk Vandenberghe (Harvard Medical School) | ||
| pAAV.Cas9.sgRNA | Addgene | 61591 | |
| pAAV.MCS | Addgene | 46954 | |
| gBlock (synthetic DNA fragement) | IDT |
References
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