पुनः संयोजक एडेनो-संबद्ध वायरस (आरएएवी) का व्यापक रूप से नैदानिक और प्रीक्लिनिकल जीन वितरण के लिए उपयोग किया जाता है। आरएएवी के लिए एक कम सराहना वाला उपयोग शुद्धिकरण की आवश्यकता के बिना सुसंस्कृत कोशिकाओं का मजबूत पारगमन है। आरएएवी के लिए नए शोधकर्ताओं के लिए, हम ट्रांसजीन कैसेट क्लोनिंग, क्रूड वेक्टर उत्पादन और सेल कल्चर ट्रांसडक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
पुनः संयोजक एडेनो से जुड़े वायरल वैक्टर (आरएएवी) ऊतक प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में एकीकरण के बिना शक्तिशाली और टिकाऊ ट्रांसजेन अभिव्यक्ति प्राप्त कर सकते हैं, जिससे उन्हें पशु मॉडल और नैदानिक सेटिंग्स में जीन वितरण के लिए एक लोकप्रिय विकल्प बना दिया जाता है। चिकित्सीय अनुप्रयोगों के अलावा, आरएएवी सुसंस्कृत कोशिकाओं में शोधकर्ता की प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और वैज्ञानिक लक्ष्यों के अनुरूप ट्रांसजेन देने के लिए एक उपयोगी प्रयोगशाला उपकरण हैं। कुछ उदाहरणों में बहिर्जात रिपोर्टर जीन, ओवरएक्प्रेशन कैसेट, आरएनए हस्तक्षेप और सीआरआईएसपीआर-आधारित उपकरण शामिल हैं, जिनमें जीनोम-वाइड स्क्रीन शामिल हैं। आरएएवी ट्रांसडक्शन इलेक्ट्रोपोरेशन या रासायनिक अभिकर्मक की तुलना में कोशिकाओं के लिए कम हानिकारक होते हैं और उत्पादन के लिए किसी विशेष उपकरण या महंगे अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं होती है। कच्चे लाइसेट या आरएएवी युक्त वातानुकूलित मीडिया को कई सेल प्रकारों को ट्रांसड्यूस करने के लिए आगे शुद्धिकरण के बिना सीधे सुसंस्कृत कोशिकाओं में जोड़ा जा सकता है- आरएएवी की एक कम सराहना की गई विशेषता। यहां, हम बुनियादी ट्रांसजेन कैसेट क्लोनिंग के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और प्रदर्शित करते हैं कि सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए क्रूड आरएएवी तैयारी का उत्पादन और लागू कैसे किया जाए। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, हम तीन सेल प्रकारों के पारगमन का प्रदर्शन करते हैं जो अभी तक आरएएवी अनुप्रयोगों में रिपोर्ट नहीं किए गए हैं: प्लेसेंटल कोशिकाएं, मायोब्लास्ट्स और छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स। हम कच्चे आरएएवी तैयारी के लिए उपयुक्त उपयोग, जीन वितरण के लिए आरएएवी की सीमाओं और कैप्सिड पसंद के लिए विचारों पर चर्चा करते हैं। यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं के लिए श्रमसाध्य अनुमापन और शुद्धिकरण चरणों की आवश्यकता के बिना आरएएवी का उपयोग करके सेल संस्कृति में उत्पादक डीएनए वितरण प्राप्त करने के लिए एक सरल, कम लागत वाली और प्रभावी विधि को रेखांकित करता है।
सेलुलर कार्यों के आणविक आधारों को स्पष्ट करने के लिए अक्सर सेल संस्कृति में ट्रांसजेनिक डीएनए की अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। व्यक्त होने के लिए, ट्रांसजेन को एक कोशिका की चयनात्मक झिल्ली के माध्यम से प्रवेश करना चाहिए और नाभिक 1,2 तक पहुंचना चाहिए। इसलिए, सेल की भौतिक बाधाओं को प्रभावी ढंग से बायपास करने और इसकी केंद्रीय प्रक्रियाओं में हेरफेर करने की क्षमता नई जैविक घटनाओं को उजागर करने के लिए ट्रांसजेनेसिस को लागू करने के लिए एक आवश्यकता है। एक दृष्टिकोण विदेशी डीएनए 3,4 को वितरित करने और व्यक्त करने के लिए वायरस की आंतरिक क्षमता को भुनाता है।
एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) सबसे छोटे स्तनधारी वायरस में से एक है: इसके 4.7 किलोबेस (केबी), एकल-फंसे हुए डीएनए जीनोम में दो जीन होते हैं, प्रतिनिधि (प्रतिकृति के लिए) और कैप (कैप्सिड के लिए), 25 एनएम मापने वाले 60-मेर इकोसाहेड्रल कैप्सिड के अंदर पैक किया जाता है। कैप जीन में कई प्रमोटर, रीडिंग फ्रेम और स्प्लिस उत्पाद होते हैं जो वायरल प्रतिकृति, उत्पादन और पैकेजिंग 5,6 के लिए आवश्यक कम से कम नौ अद्वितीय प्रोटीन को एन्कोड करते हैं। इसके अतिरिक्त, जीनोम के दोनों सिरों में द्वितीयक संरचनाएं होती हैं जिन्हें इनवर्टेड टर्मिनल रिपीट (आईटीआर) कहा जाता है जो डीएनए प्रतिकृति, जीनोम पैकेजिंग और ट्रांसडक्शन 7,8,9,10 के दौरान डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग के लिए आवश्यक हैं। आईटीआर एकमात्र डीएनए तत्व हैं जो कैप्सिड में जीनोम की पैकेजिंग के लिए आवश्यक हैं, और इसलिए एएवी को वायरल प्रतिनिधि / कैप जीन को नियामक तत्वों और /या रुचि के जीन की पसंद के साथ बदलकर ट्रांसजेन वितरण उद्देश्यों के लिए क्लोन किया जा सकता है। परिणामी पुनः संयोजक एएवी (आरएएवी), एक इंजीनियर वेक्टर जीनोम (वीजी) के साथ, व्यापक रूप से मानव जीन थेरेपी के लिए क्लिनिक में उपयोग किया जाता है और11 सफलताएं हासिल की हैं। वेक्टर का एक कम सराहनीय उपयोग प्रयोगशाला में है; आरएएवी एक शोधकर्ता कीप्रयोगात्मक जरूरतों को पूरा करने के लिए सुसंस्कृत कोशिकाओं में ट्रांसजेन अभिव्यक्ति को कुशलतापूर्वक प्राप्त कर सकते हैं।
आरएएवी के उत्पादन के लिए सबसे आम तरीका एचईके 293 या 293 टी कोशिकाओं में ट्रिपल-प्लास्मिड अभिकर्मक द्वारा है (चित्रा 1)। पहला प्लास्मिड, जिसे आमतौर पर सीआईएस प्लास्मिड कहा जाता है, में आईटीआर (पीएएवी) के साथ वांछित ट्रांसजीन होता है। आवेदन के आधार पर, सामान्य तत्वों के साथ सीआईएस प्लास्मिड, जैसे कि मजबूत प्रमोटर या सीआरआईएसपीआर-आधारित उपकरण, खरीद के लिए उपलब्ध हैं। कैप प्लास्मिड जिसमें वाइल्ड-टाइप एएवी प्रतिनिधि और कैप जीन शामिल होते हैं जो इन-ट्रांस में प्रदान किए जाते हैं – यानी, एक अलग, गैर-आईटीआर युक्त प्लास्मिड पर जो नियामक और संरचनात्मक तत्वों को व्यक्त करता है जो तब सीआईएस प्लास्मिड के साथ बातचीत करते हैं – और इस प्रकार इसे ट्रांस प्लास्मिड कहा जाता है। वीजी को शारीरिक रूप से संलग्न करने के अलावा, कैप्सिड सेलुलर ट्रोपिज्म12,13 को प्रभावित करता है। सीरोटाइप-विशिष्ट कैप जीन इन-ट्रांस प्रदान करके, शोधकर्ता आसानी से अपने दिए गए लक्ष्य सेल के लिए एक अनुकूलित कैप्सिड सीरोटाइप चुनकर पारगमन दक्षता को अधिकतम करने में सक्षम हैं। अंत में, एक डिपेंडोपार्वोवायरस के रूप में, एएवी को अपने वायरल प्रमोटरों से प्रतिनिधि / कैप अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए एक सहायक वायरस की आवश्यकता होती है, जो एडेनोवायरल हेल्पर जीन द्वारा प्राप्त किया जाता है, जो तीसरे प्लास्मिड जैसे कि पीएडीएक्सएफ 614,15 पर प्रदान किया जाता है। ट्रिपल-प्लास्मिड अभिकर्मक के 72 घंटे के बाद, वेक्टर को निर्माता कोशिकाओं से संस्कृति मीडिया में बार-बार फ्रीज / पिघलने चक्र द्वारा जारी किया जा सकता है। पूरी प्लेट सामग्री तब एकत्र की जाती है, और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा बड़े सेलुलर मलबे को हटा दिया जाता है; परिणामी मीडिया सुपरनैटेंट डाउनस्ट्रीम ट्रांसडक्शन के लिए तैयार एक क्रूड आरएएवी तैयारी है।
चित्रा 1: कच्चे आरएएवी वेक्टर उत्पादन का अवलोकन। क्रूड आरएएवी उत्पादन और पारगमन 5 दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
आरएएवी अन्य अभिकर्मक विधियों की तुलना में ट्रांसजेन डिलीवरी के लिए अधिक अनुकूल हो सकता है, जो आमतौर पर सेलुलर विषाक्तता, कम दक्षता और महंगे अभिकर्मकों और उपकरणों से जुड़े होते हैं, जैसे कि इलेक्ट्रोपोरेशन या रासायनिक / लिपिड-आधारित अभिकर्मक16,17। आरएएवी इन बाधाओं को दरकिनार करता है और अक्सर न्यूनतम विषाक्तता और न्यूनतम हाथों से समय के साथ शक्तिशाली ट्रांसजेन अभिव्यक्ति प्रदान करता है। महत्वपूर्ण रूप से, आरएएवी का उत्पादन करना और इसे सेल संस्कृति में लागू करना सरल है और शायद ही कभी संस्कृति मीडिया (चित्रा 1) से वेक्टर के शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, आरएएवी लेंटिवायरल ट्रांसजेन डिलीवरी के विपरीत, मेजबान जीनोम में अपने वीजी को एकीकृत नहीं करता है, और इस प्रकार सम्मिलन म्यूटेनेसिस18 के जोखिम को कम करता है। ट्रांसजीन डिलीवरी के लिए आरएएवी का उपयोग करने के संभावित लाभों के बावजूद, सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण रूप से, आईटीआर सहित ट्रांसजेन का आकार कैप्सिड की भौतिक बाधाओं के कारण 4.9 केबी से अधिक नहीं होना चाहिए, जिससे बड़े नियामक तत्वों और ट्रांसजेन को प्रभावी ढंग से वितरित करने की शोधकर्ता की क्षमता सीमित हो जाती है। इसके अलावा, चूंकि आरएएवी एक गैर-एकीकृत वायरस है, इसलिए पारगमन के परिणामस्वरूप कोशिकाओं को विभाजित करने में क्षणिक ट्रांसजेन अभिव्यक्ति होती है और स्थिर अभिव्यक्ति के लिए व्यावहारिक नहीं हो सकती है। हालांकि, दोहरे आरएएवी-वितरित कैस 9 और होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) टेम्प्लेट का उपयोग करने वाले तरीकों का उपयोग विशिष्ट जीनोमिक लोकी पर अनुक्रमों को स्थिर रूप से सम्मिलित करने के लिए किया जा सकता है यदि कोई शोधकर्ता19 चाहता है।
क्लोनिंग
क्लोनिंग प्रोटोकॉल ऊपर उपयोग किए गए pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 प्लास्मिड तक सीमित नहीं है और शोधकर्ता की प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर आसानी से बदला जा सकता है। कई आईटीआर युक्त प्लास्मिड खरीद के लिए आसानी से ऑनलाइन उपलब्ध हैं। उदाहरण के लिए, कैस 9 और एक एसजीआरएनए क्लोनिंग साइट दोनों युक्त प्लास्मिड उपलब्ध हैं, लेकिन कुछ अतिरिक्त चरणों की आवश्यकता होती है जैसे कि ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड एनीलिंग और पीएनके उपचार30। इसके अतिरिक्त, प्लास्मिड जिसमें केवल आईटीआर के साथ एक मल्टीपल क्लोनिंग साइट (एमसीएस) होती है और कोई आंतरिक नियामक तत्वनहीं पाया जा सकता है। यदि विभिन्न प्लास्मिड का उपयोग किया जाना है, तो पाचन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रतिबंध एंजाइम (आरई) आमतौर पर एकमात्र तत्व होते हैं जिन्हें इस प्रोटोकॉल में बदलने की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, आरएएवी की एक सीमा इसकी सीमित कार्गो क्षमता है। कैप्सिड की भौतिक सीमाओं के कारण, वेक्टर जीनोम आईटीआर सहित 4.9 केबी से अधिक नहीं होना चाहिए।
बैक्टीरिया से प्लास्मिड को अलग करते समय, ट्रिपल-प्लास्मिड अभिकर्मक या पारगमन के दौरान कोशिकाओं को नुकसान को कम करने के लिए एंडोटॉक्सिन-लो या -फ्री मिडीप्रेप या मैक्सिप्रेप किट का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। मिनीप्रेप किट से प्लास्मिड में अक्सर उच्च अशुद्धियां, कम सांद्रता और कम सुपरकॉइलडीएनए होते हैं, जिनमें से सभी आरएएवी के डाउनस्ट्रीम उत्पादन को प्रभावित कर सकते हैं और इस प्रकार अनुशंसित नहीं हैं।
क्लोनिंग के दौरान आईटीआर की संरचना और गुणों को समझना महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, आईटीआर के माध्यम से पीसीआर का उपयोग करना बेहद मुश्किल है। क्लोनिंग डिजाइन जिन्हें आईटीआर के माध्यम से पीसीआर प्रवर्धन की आवश्यकता होती है, उनसे बचा जाना चाहिए, और इसके अलावा गिब्सन असेंबली क्लोनिंग तकनीक के उपयोग को सीमित करना चाहिए। जैसे, प्रतिबंध एंजाइम क्लोनिंग आईटीआर युक्त प्लास्मिड में क्लोनिंग के लिए पसंदीदा तरीका है। इसके अलावा, सेंगर अनुक्रमण के लिए कुछ प्राइमर संगत नहीं हो सकते हैं यदि अनुक्रमित क्षेत्र में आईटीआर होता है। इसके बजाय, अधिक सटीक अनुक्रमण परिणाम प्राप्त करने के लिए आईटीआर से दूर और वेक्टर जीनोम बॉडी में अनुक्रम ति प्राइमरों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। दूसरा, प्लास्मिड प्रवर्धन32,33 के लिए बैक्टीरिया में परिवर्तित होने पर आईटीआर विलोपन, पुनर्व्यवस्था और उत्परिवर्तन से ग्रस्त हैं। इन घटनाओं को कम करने के लिए, पुनर्संयोजन-कमी वाले सक्षम जीवाणु उपभेदों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जैसे कि एसटीबीएल 3, और सेलुलर डिवीजनों को धीमा करने के लिए उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करना। अंत में, यह देखा गया है कि छोटी कॉलोनियां पुनर्व्यवस्था या विलोपन के बिना क्लोन के अनुरूप हो सकती हैं, क्योंकि आईटीआर के बिना वे विकास लाभ प्रदान कर सकते हैं और बड़े हो सकते हैं। इसलिए, उन कॉलोनियों को चुनने की सिफारिश की जाती है जो छोटी हैं।
वेक्टर उत्पादन
आरएएवी वेक्टर का सफल उत्पादन कई तत्वों से प्रभावित हो सकता है। एक महत्वपूर्ण कारक अभिकर्मक के लिए उपयोग की जाने वाली एचईके 293 या 293 टी कोशिकाओं का स्वास्थ्य है। आम तौर पर, कम मार्ग संख्या आदर्श होती है, क्योंकि अत्यधिक पारित कोशिकाएं जीनोटाइपिक और फेनोटाइपिक विचरण प्रदर्शित कर सकती हैं जो आरएएवी टिटर्स को कम कर सकती हैं। इसके अतिरिक्त, प्रभावी उत्पादन के लिए बीज कोशिकाओं का घनत्व 75% -90% होना चाहिए। विरल कोशिकाएं कम वेक्टर पैदावार उत्पन्न करती हैं क्योंकि वैक्टर का उत्पादन करने के लिए कम कोशिकाएं उपलब्ध होती हैं, जबकि अतिविकसित कोशिकाओं को कुशलता से स्थानांतरित नहीं किया जाएगा।
अभिकर्मक लॉट, सेल स्टॉक और सामान्य लैब-टू-लैब परिवर्तनशीलता के बीच भिन्नताएं अभिकर्मक क्षमता और उत्पादन टिटर में अंतर में योगदान करती हैं। एक इष्टतम कारक जो टिटर सुधार का कारण बन सकता है, वह अभिकर्मक प्रतिक्रियाओं में प्लास्मिड: पीईआई अनुपात है। ताजा (<1 महीने पुराना) पीईआई मैक्स का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। यह अनुशंसा की जाती है कि 1: 1 के प्लास्मिड: पीईआई अनुपात को शुरुआती बिंदु के रूप में उपयोग किया जाए, और यदि अभिकर्मक या पारगमन दक्षता खराब दिखाई देती है, तो कई अलग-अलग अनुपातों का परीक्षण करें। टिटर ऑप्टिमाइज़ेशन सबसे आसान है यदि एक दृश्य रीडआउट के साथ ट्रांसजीन का उपयोग करना आसान है, जैसे कि CMV.Luc.IRES.EGFP रिपोर्टर ट्रांजीन यहां क्लोनिंग के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में उपयोग किया जाता है। अनुकूलन करने के लिए, 12-वेल प्लेट का उपयोग करके प्रोटोकॉल चरण 3 का पालन करें और प्लास्मिड द्रव्यमान और अभिकर्मक मात्रा को दो से कम करें (अंतिम प्लास्मिड द्रव्यमान 2.6 μg है)। 0.25 की बढ़ती वृद्धि के साथ 1: 0.75 से 1: 3 तक के अनुपात के अनुरूप पीईआई वॉल्यूम को तदनुसार समायोजित करें (चित्रा 6)। 15 मिनट के बाद एसएफ मीडिया के 950 μL के साथ प्रत्येक प्रतिक्रिया को पतला करें। सुविधा के लिए, ट्रिपल प्लास्मिड युक्त एक मास्टर मिश्रण बनाया जा सकता है और पीईआई को जोड़ने से पहले व्यक्तिगत रूप से 1.5 एमएल ट्यूबों में पाइप किया जा सकता है-पूरक फ़ाइल 2 देखें। वेक्टर की कटाई करें, रुचि की कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करें, और छवि। उच्चतम पारगमन दक्षता (जीएफपी + कोशिकाओं का अनुपात) वाला कुआं उच्चतम टिटर और पीईआई: डीएनए के सबसे इष्टतम अनुपात से मेल खाता है।
चित्रा 6: पीईआई अनुकूलन वर्कफ़्लो। पीईआई अनुकूलन के लिए आवश्यक चरणों का योजनाबद्ध। प्लास्मिड के कई अनुपात: इष्टतम अनुपात निर्धारित करने के लिए पीईआई का परीक्षण किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
फसल और टिटर विचार।
आरएएवी वेक्टर की कटाई के लिए उपयोग की जाने वाली फ्रीज / पिघलने तकनीक प्रभावी रूप से एचईके 293 कोशिकाओं को सुसंस्कृत कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए स्पष्ट लाइसेट के प्रत्यक्ष उपयोग के साथ संगत तरीके से लाइसेस करती है। कुछ आरएएवी सीरोटाइप, जैसे कि एएवी 1, एएवी 8, और एएवी 9 वेक्टर उत्पादन के दौरान कोशिकाओं से जारी किए जाते हैं और फ्रीज / पिघलने चक्र34 के बिना सुसंस्कृत सेल माध्यम से काटा जा सकता है। यहां वर्णित विधि आम तौर पर एएवी 2 कैप्सिड ्स का उपयोग करते समय 1 x 1010 वीजी / एमएल के क्रम पर टिटर्स उत्पन्न करती है, और एएवी 8 के लिए 1 x 1011 वीजी / एमएल। जबकि उच्च टिटर्स को डिटर्जेंट या अन्य रासायनिक-आधारित लाइसिस द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, ये डाउनस्ट्रीम उपयोग में कोशिकाओं के लिए हानिकारक हैं और आरएएवी को लाइसेट से और शुद्ध करने की आवश्यकता होती है। लोअर टिटर एक व्यापार है जो एक शोधकर्ता को यह निर्धारित करते समय विचार करना चाहिए कि क्या कच्चे तेल की तैयारी उनकी शोध आवश्यकताओं के लिए उपयुक्त है, हालांकि, यहां वर्णित विधियों द्वारा उत्पादित मामूली कम टिटर्स कई सेल प्रकारों को बहुत अच्छी तरह से ट्रांसड्यूस कर सकते हैं (प्रतिनिधि परिणाम देखें)। अभिकर्मक दक्षता और सेल स्वास्थ्य के अलावा, वेक्टर टिटर्स आरएएवी उत्पादन के दौरान उपयोग किए जाने वाले कैप्सिड और वीजी35 के भीतर ट्रांसजेन के आकार और अनुक्रम के आधार पर भिन्न होते हैं।
कच्चे वेक्टर की तैयारी करते समय, प्लास्मिड डीएनए जो ट्रिपल-प्लास्मिड अभिकर्मक के दौरान उपयोग किया जाता था, मौजूद हो सकता है और, हालांकि दुर्लभ, पारगमन के दौरान डाउनस्ट्रीम अभिकर्मक का परिणाम होता है। इसके अलावा, अनपैकेज्ड वीजी कैप्सिड के बाहरी हिस्से से जुड़ सकते हैं और नग्न और विदेशी एकल-फंसे डीएनए36,37 के लिए एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आह्वान कर सकते हैं। इसलिए, संवेदनशील सेल प्रकारों को अनपैकेज्ड वीजी और प्लास्मिड को हटाने के लिए डीनेस को पचाने और शुद्ध करने के लिए वेक्टर तैयारी की आवश्यकता हो सकती है।
यदि कोई कच्चे तेल की तैयारी के टिटर की गणना करना चाहता है, तो क्यूपीसीआर को डीनेस प्रतिरोधी कणों (डीआरपी) के अंदर पैक किए गए वीजी की संख्या निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। संक्षेप में, प्लास्मिड डीएनए को हटाने, न्यूक्लिक एसिड को दूषित करने, या आंशिक रूप से पैक किए गए वीजी को हटाने के लिए कच्चे तेल की तैयारी की एक छोटी मात्रा को डीनेस-डाइजेस्ट किया जाता है। नमूना तब क्यूपीसीआर के अधीन होता है और डीआरपी के अंदर संरक्षित वीजी की मात्रा निर्धारित की जाती है, जिसके परिणामस्वरूप क्रूड तैयारीके प्रति एमएल वेक्टर जीनोम की इकाइयों के साथ एक टिटर होता है। एलिसा-आधारित परख का उपयोग करके वेक्टर अनुमापन करने की सिफारिश नहीं की जाती है जो कैप्सिड टिटर्स की मात्रा निर्धारित करता है। वाइल्ड-टाइप एएवी वायरस की तुलना में, आरएएवी खाली और आंशिक रूप से पैक किए गए कैप्सिड्स 39 के अनुपात से ग्रस्त है। एलिसा उनकी जीनोम सामग्री की परवाह किए बिना सभी कैप्सिड ्स की मात्रा निर्धारित करेगा और एक तैयारी में मौजूद ट्रांसड्यूसेबल इकाइयों को अधिक महत्व देगा, जिसके लिए पैक किए गए वीजी की आवश्यकता होती है।
पारगमन विचार।
कई कारक आरएएवी पारगमन को प्रभावित करते हैं और किसी भी नए प्रयोग के लिए उचित विचार किया जाना चाहिए। ट्रांसजीन अभिव्यक्ति को चलाने वाले प्रमोटर के आधार पर, अभिव्यक्ति की शुरुआत 4 घंटे पोस्ट-ट्रांसडक्शन (एचपीटी) के रूप में हो सकती है, और पीक अभिव्यक्ति आमतौर पर 48 एचपीटी द्वारा प्राप्त की जाती है। कोशिकाओं के प्रारंभिक बीजारोपण से प्रयोगात्मक समापन बिंदु तक समय की अवधि को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है। यह कोशिकाओं के शुरुआती संयोजन का अनुमान लगाने और यह सुनिश्चित करने के लिए है कि वे प्रयोग के अंत तक अतिवृद्धि न करें। यदि कोशिकाएं ओवरकॉन्फ्लुएंट हो जाती हैं, तो तनाव प्रतिक्रिया के कारण सेलुलर व्यवहार बदल सकता है और प्रयोगात्मक परिणामों को भ्रमित कर सकता है। कुछ सेल प्रकार, जैसे यू 2-ओएस, अतिवृद्धि / संपर्क अवरोध को काफी अच्छी तरह से सहन कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, वे सीरम-मुक्त वातानुकूलित माध्यम में लंबी अवधि (48 एच +) का सामना कर सकते हैं- इस उत्पादन प्रोटोकॉल का उत्पाद। हालांकि, संवेदनशील सेल प्रकारों को पारगमन के दौरान स्वास्थ्य बनाए रखने के लिए विशेष विकास माध्यम के साथ कच्चे मिश्रण की तैयारी के सीरम जोड़ या कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है। सीरम युक्त मीडिया का उपयोग करने से थोड़ी कम पारगमन दक्षता सेल स्वास्थ्य के लिए एक संभावित व्यापार है और शोधकर्ता द्वारा इस पर विचार किया जाना चाहिए।
आमतौर पर, तेजी से विभाजित कोशिकाओं के लिए, लगभग 50% का प्रारंभिक संयोजन उन अनुप्रयोगों के लिए इष्टतम होता है जिन्हें 48 एचपीटी समाप्त कर दिया जाएगा। हालांकि, प्रयोग की जरूरतों के आधार पर सामंजस्य को तदनुसार समायोजित किया जा सकता है। ट्रांसडक्शन क्षमता में कमी के कारण 75% से अधिक मोनोलेयर-प्रकार अमर सेल लाइनों को ट्रांसड्यूस करने की सिफारिश नहीं की जाती है। अधिकांश सुसंस्कृत सेल प्रकार कच्चे आरएएवी तैयारी के साथ रात भर इनक्यूबेशन के बाद सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूस और स्वस्थ होते हैं, इसके बाद सुबह में ताजा सीरम युक्त मीडिया में बदलाव होता है।
कैप्सिड सीरोटाइप एक लक्ष्य सेल को ट्रांसड्यूस करने के लिए आरएएवी का उत्पादन करते समय विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, क्योंकि कैप्सिड सेलुलर ट्रोपिज्म और बाद में ट्रांसजेन अभिव्यक्ति13 का प्राथमिक निर्धारक है। एएवी 2 एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला सीरोटाइप है क्योंकि इसकी क्षमता कई प्रकार की सुसंस्कृतकोशिकाओं को प्रभावी ढंग से ट्रांसड्यूस करने की है। एएवी 2 की इस संपत्ति को हेपरिन सल्फेट प्रोटिओग्लाइकेन्स (एचएसपीजी) के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जो एएवी 2 के लिए प्राथमिक लगाव कारक के रूप में कार्य करता है और डिश40 में बढ़ने के अनुकूलन से सुसंस्कृत कोशिकाओं पर एचएसपीजी के उच्च स्तर को दर्शाता है। अन्य कैप्सिड्स, जैसे कि एएवी 9, व्यापक सेल प्रकारों को ट्रांसड्यूस करने में कम प्रभावी हैं और उन्हें उनके निर्भरता अनुलग्नक कारकों द्वारा समझाया जा सकता है जो इस सेटिंग41 में व्यक्त नहीं किए गए हैं। इसलिए, हम एएवी 2 को सुसंस्कृत कोशिकाओं में पहली पसंद के कैप्सिड के रूप में सुझाते हैं यदि वांछित लक्ष्य सेल को पहले साहित्य में आरएएवी के साथ परीक्षण नहीं किया गया है।
कृपया ध्यान दें कि कच्चे वेक्टर तैयारी की एक बड़ी सीमा यह है कि वे पशु मॉडल को ट्रांसड्यूस करने के लिए अनुचित हैं। विवो अध्ययनों में शुद्ध होने और गुणवत्ता मूल्यांकन से गुजरने की तैयारी की आवश्यकता होती है।
ट्रांसजीन अभिव्यक्ति और संभावित एकीकरण विचार।
आरएएवी विश्वसनीय रूप से ट्रांसजेन की स्थायी अभिव्यक्ति में परिणाम नहीं देते हैं। समय के साथ, वीजी चुप हो सकते हैं और ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति को कईअंशों के बाद बंद किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, अधिकांश वीजी एपिसोमल रहते हैं, और आरएएवी में वायरल रेप प्रोटीन नहीं होते हैं जो मेजबान जीनोम में लगातार एकीकरण को मध्यस्थ करेंगे जैसा कि जंगली-प्रकार के वायरल लाइसोजेनिक संक्रमण में होता है या वीजी43 की प्रतिकृति को बढ़ावा देता है। नतीजतन, ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं में एपिसोम अंततः विभाजन के माध्यम से बेटी कोशिकाओं के बीच पतला हो जाएगा।
बेसल-स्तरीय एकीकरण सभी वितरित ट्रांसजेनिक डीएनए सामग्री के लिए एक संभावना है। हालांकि, आईटीआर युक्त वीजी को उच्च आवृत्ति44 पर एकीकरण की संभावना है। इसलिए, कोशिकाओं के एक छोटे से उप-समूह में एक ट्रांसजीन की स्थायी अभिव्यक्ति देखी जा सकती है। उपयोगकर्ताओं को इस संभावना पर विचार करना चाहिए, विशेष रूप से जब डीएनए-काटने वाले एंजाइमों को वितरित करने के लिए आरएएवी का उपयोग किया जाता है, जैसे कि कैस 9, क्योंकि डबल-फंसे हुए ब्रेक के परिणामस्वरूप एकीकरण और स्थायी अभिव्यक्ति45 की एक बड़ी आवृत्ति हो सकती है। हालांकि यह आरएएवी को अंतर्जात टैगिंग या जीन जोड़ के लिए होमोलॉजी निर्देशित मरम्मत टेम्पलेट देने के लिए एक अच्छा उम्मीदवार बनाता है, सीएएस 9 सम्मिलन की संभावना को19,46 माना जाना चाहिए।
The authors have nothing to disclose.
हम रॉबर्ट त्जियान और जेवियर डारज़ैक को उनके समर्थन और प्रयोगशाला उपकरणों के उपयोग के लिए धन्यवाद देते हैं। हम केपी 1 और एलके03 प्रतिनिधि / कैप प्लास्मिड के उपहार के लिए मार्क के को धन्यवाद देते हैं, और एएवी 4 प्रतिनिधि / कैप प्लास्मिड के लिए लुक वांडेनबर्ग। फंडिंग हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (34430, आरटी) और कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट फॉर रीजेनरेटिव मेडिसिन ट्रेनिंग प्रोग्राम ईडीयूसी 4-12790 द्वारा प्रदान की गई थी। एनडब्ल्यू एक सिबेल पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप के माध्यम से बर्कले स्टेम सेल सेंटर से और वाल्टर बेंजामिन फैलोशिप के माध्यम से जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) से धन स्वीकार करता है।
Snapgene DNA viewing sofrware | Snapgene | ||
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 | AddGene | 105533 | |
pAAV2/2 (Rep/Cap) | AddGene | 104963 | |
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LB Agar Carbenicillin | Sigma-Aldrich | L0418 | |
Boekel Scientific Economy Digital Incubator | Boekel Scientific | 133000 | |
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Carbencillin (Disodium) | GoldBio | C-103-5 | |
New Brunswick I26 Shaker | Eppendorf | M1324-0000 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
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QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit | Qiagen | 12945 | |
PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS | USA Scientific | 1402-3900 | |
Mastercycler nexus | Eppendorf | 6333000022 | |
dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
5x Phusion Buffer | NEB | B0518S | Provided with purchase of Phusion Polymerase |
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Gel Loading Dye, Orange (6X) | NEB | B7022S | |
DNA Clean & Concentrator-100 | Zymo | D4029 | |
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Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
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T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with purchase of T4 Ligase |
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Precision Microprocessor Water Bath | Thermo Scientific | 51221046 | |
Sterile Plastic Culture Tubes | Fisher Scientific | 149566B | |
2.0 mL Microcentrifuge Tube | Thomas Scientific | 1149Y01 | |
ZR Plasmid Miniprep – Classic | Zymo | D4015 | |
Xma1 | NEB | R0180S | |
Sma1 | NEB | R0141S | |
HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
Falcon 6-well | Corning | 353046 | |
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo-Fisher | 11995065 | |
Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 Incubator | Marshall Scientific | MCO-18AIC | |
PEI MAX (Polyethylenimine Hydrochloride) | Polysciences | 24765-100 | |
Mixer Vortex Genie 2 | Electron Microscopy Sciences | 102091-234 | |
Sanyo Ultra Low Freezer | Sanyo | 14656-15267-16219 | |
INCU-Line IL 10 with transparent window | VWR | 390-0384 | |
Eppendorf Microcentrifuges | Eppendorf | 05-400-005 | |
Falcon 96-well | Corning | 353072 | |
C57BL/6J mice | JAX | strain #000664 | |
organoid growth medium | STEMCELL Technologies | 6005 | |
L Wnt-3A cells | ATCC | CRL-2647 | |
nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | |
CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72052 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane | Fisher | 356231 | |
24-well plate | Fisher | 08-772-1 | |
D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-250 | |
TrypLE Express | Fisher | 12604013 | |
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | STEMCELL Technologies | 36254 | |
polybrene | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
48-well plates | Fisher | 08-772-3D | |
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Fisher | 12-565-470 | |
BeWo cells | ATCC | CCL-98 | |
F-12K Medium | ATCC | 30-2004 | |
Hepa1-6 | ATCC | CRL-1830 | |
Huh7 | UC Berkeley BSD Cell Culture Facility | HUH-7 | |
C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
HSkMC | ATCC | PCS-950-010 | |
Skeletal Muscle Cell Growth Medium | Sigma | C-23060 | |
Skeletal Muscle Differentiation Medium | Sigma | C-23061 | |
Invitrogen EVOS Digital Color Fluorescence Microscope | Fisher Scientific | 12-563-340 | |
Perkin Elmer Opera Phenix | Perkin Elmer | HH14001000 | |
PhenoPlate 96-well | Perkin Elmer | 6055302 | |
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Thermo-Fisher | 31053028 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo-Fisher | 35050079 | |
Sodium Pyruvate | Thermo-Fisher | 11360070 | |
pAAV2/5 (Rep/Cap) | Addgene | 104964 | |
pAAV2/8 (Rep/Cap) | Addgene | 112864 | |
pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap) | Addgene | 130878 | |
pAAV2/9n (Rep/Cap) | Addgene | 112865 | |
pAnc80L65AAP | Addgene | 92307 | |
KP1 (rep/cap) | gifted by Professor Mark Kay (Stanford University) | ||
LK03 (rep/cap) | gifted by Professor Mark Kay (Stanford University) | ||
pAAV4 (rep/cap) | gifted by Professor Luk Vandenberghe (Harvard Medical School) | ||
pAAV.Cas9.sgRNA | Addgene | 61591 | |
pAAV.MCS | Addgene | 46954 | |
gBlock (synthetic DNA fragement) | IDT |