Rekombinant adenoassosiert virus (rAAV) er mye brukt for klinisk og preklinisk genlevering. En undervurdert bruk for rAAVs er robust transduksjon av dyrkede celler uten behov for rensing. For forskere som er nye innen rAAV, tilbyr vi en protokoll for transgen kassettkloning, råvektorproduksjon og cellekulturtransduksjon.
Rekombinante adenoassosierte virale vektorer (rAAV) kan oppnå potent og holdbart transgenuttrykk uten integrering i et bredt spekter av vevstyper, noe som gjør dem til et populært valg for genlevering i dyremodeller og i kliniske omgivelser. I tillegg til terapeutiske anvendelser er rAAVs et nyttig laboratorieverktøy for å levere transgener skreddersydd for forskerens eksperimentelle behov og vitenskapelige mål i dyrkede celler. Noen eksempler inkluderer eksogene reportergener, overuttrykkskasetter, RNA-interferens og CRISPR-baserte verktøy, inkludert de for genombrede skjermer. rAAV-transduksjoner er mindre skadelige for celler enn elektroporering eller kjemisk transfeksjon og krever ikke noe spesielt utstyr eller dyre reagenser for å produsere. Rålysater eller kondisjonerte medier som inneholder rAAV-er kan tilsettes direkte til dyrkede celler uten ytterligere rensing for å transdusere mange celletyper – en undervurdert egenskap ved rAAV. Her gir vi protokoller for grunnleggende transgen kassettkloning og demonstrerer hvordan man produserer og påfører rå rAAV-preparater på dyrkede celler. Som prinsippbevis demonstrerer vi transduksjon av tre celletyper som ennå ikke er rapportert i rAAV-applikasjoner: placentaceller, myoblaster og små tarmorganoider. Vi diskuterer hensiktsmessige bruksområder for rAAV-preparater, rAAVs begrensninger for genfødsler og hensyn til kapsidvalg. Denne protokollen skisserer en enkel, billig og effektiv metode for forskere å oppnå produktiv DNA-levering i cellekultur ved hjelp av rAAV uten behov for arbeidskrevende titrerings- og rensetrinn.
Å belyse molekylære baser av cellulære funksjoner krever ofte ekspresjon av transgent DNA i cellekultur. For å komme til uttrykk må transgener trenge gjennom en celles selektive membran og nå kjernen 1,2. Derfor er evnen til effektivt å omgå cellens fysiske barrierer og manipulere dens sentrale prosesser en nødvendighet for å anvende transgenese for å avdekke nye biologiske fenomener. En tilnærming utnytter virusets iboende evne til å levere og uttrykke fremmed DNA 3,4.
Adenoassosiert virus (AAV) er et av de minste pattedyrvirusene: dets 4,7 kilobase (kb), enkeltstrengede DNA-genom inneholder to gener, rep (for replikasjon) og cap (for kapsid), pakket inne i et 60-mer icosahedral kapsid som måler 25 nm. Rep / cap-genene har flere promotorer, leserammer og spleiseprodukter som koder for minst ni unike proteiner som kreves for viral replikasjon, produksjon og emballasje 5,6. I tillegg inneholder begge ender av genomet sekundære strukturer kalt inverterte terminale repetisjoner (ITR) som er nødvendige for DNA-replikasjon, genomemballasje og nedstrømsbehandling under transduksjon 7,8,9,10. ITR er de eneste DNA-elementene som kreves for å pakke genomet inn i kapsiden, og derfor kan AAV klones for transgene leveringsformål ved å erstatte virusrep/cap-genene med forskerens valg av regulatoriske elementer og/eller gener av interesse6. Den resulterende rekombinante AAV (rAAV), med et konstruert vektorgenom (VG), er mye brukt i klinikken for human genterapi og har oppnådd suksess11. En undervurdert bruk av vektoren er i laboratoriet; rAAVs kan effektivt oppnå transgen ekspresjon i dyrkede celler for å oppfylle en forskers eksperimentelle behov12.
Den vanligste metoden for å produsere rAAV er ved trippelplasmidtransfeksjon til HEK293- eller 293T-celler (figur 1). Det første plasmidet, ofte kalt cis-plasmidet, inneholder det ønskede transgenet flankert av ITR (pAAV). Avhengig av applikasjonen er cis-plasmider med vanlige elementer, for eksempel sterke promotorer eller CRISPR-baserte verktøy, tilgjengelige for kjøp. Det andre er pRep/Cap-plasmidet som inneholder villtype-AAV-rep- og cap-genene gitt i trans – dvs. på et separat, ikke-ITR-holdig plasmid som uttrykker regulatoriske og strukturelle elementer som deretter interagerer med cis-plasmidet – og kalles dermed transplasmidet. I tillegg til å fysisk omslutte VG, påvirker kapsidet cellulær tropisme12,13. Ved å gi det serotypespesifikke cap-genet i trans, kan forskere enkelt maksimere transduksjonseffektiviteten ved å velge en optimalisert kapsidserotype for deres gitte målcelle. Til slutt, som et Dependoparvovirus, krever AAV et hjelpervirus for å aktivere rep / cap-uttrykk fra sine virale promotorer, oppnådd av adenovirale hjelpergener, gitt på et tredje plasmid som pAdΔF614,15. Etter 72 timer trippelplasmidtransfeksjon kan vektoren frigjøres fra produsentceller til kulturmediet ved gjentatte fryse-/tinesykluser. Hele plateinnholdet samles deretter, og store cellulære rusk fjernes ved sentrifugering; den resulterende mediesupernatanten er en grov rAAV-forberedelse klar for nedstrøms transduksjoner.
Figur 1: Oversikt over rAAV vektorproduksjon av råolje. Produksjon og transduksjon av rav rAAV kan oppnås innen 5 dager. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
rAAV kan være gunstigere for transgenlevering sammenlignet med andre transfeksjonsmetoder, som ofte er forbundet med cellulær toksisitet, lav effektivitet og dyre reagenser og utstyr, for eksempel for elektroporering eller kjemisk/lipidbasert transfeksjon16,17. rAAV omgår disse hindringene og gir ofte potent transgenuttrykk med minimal toksisitet og minimal praktisk tid. Det er viktig å produsere rAAV og anvende det i cellekultur er enkelt og krever sjelden rensing av vektoren fra kulturmediet (figur 1). I tillegg integrerer ikke rAAV sin VG i vertsgenomet, i motsetning til lentiviral transgenlevering, og reduserer dermed risikoen for innsettingsmutagenese18. Til tross for de potensielle fordelene ved å bruke rAAV for transgen levering, må begrensninger vurderes. Det er viktig at størrelsen på transgenet, inkludert ITR, ikke bør overstige 4,9 kb på grunn av fysiske begrensninger av kapsiden, og dermed begrense forskerens evne til effektivt å levere store regulatoriske elementer og transgener. Videre, siden rAAV er et ikke-integrerende virus, resulterer transduksjon i forbigående transgenuttrykk i delende celler og kan ikke være praktisk for stabilt uttrykk. Imidlertid kan metoder som bruker doble rAAV-leverte Cas9 og homologi-rettet reparasjon (HDR) maler brukes til å stabilt sette inn sekvenser på bestemte genomiske loci hvis en forsker ønsker19.
Kloning
Kloningsprotokollen er ikke begrenset til pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40-plasmidet som brukes ovenfor, og kan enkelt endres basert på forskerens eksperimentelle behov. Mange ITR-holdige plasmider er lett tilgjengelig online for kjøp. For eksempel er plasmider som inneholder både Cas9 og et sgRNA-kloningssted tilgjengelige, men krever få ekstra trinn som oligonukleotidglødning og PNK-behandling30. I tillegg kan plasmider som inneholder et multippel kloningssted (MCS) med bare ITR og ingen indre regulatoriske elementer finnes31. Hvis forskjellige plasmider skal brukes, er restriksjonsenzymene (RE) som brukes til fordøyelsen vanligvis de eneste elementene som kanskje må endres i denne protokollen. En begrensning ved rAAV er imidlertid den begrensede lastekapasiteten. På grunn av kapsidens fysiske begrensninger bør vektorgenomet ikke overstige 4,9 kb, inkludert ITR-ene.
Når du isolerer plasmid fra bakterier, er det viktig å bruke et endotoksin-lavt eller fritt midiprep- eller maxiprep-sett for å redusere skade på celler under trippelplasmidtransfeksjon eller transduksjon. Plasmid fra miniprep-sett inneholder ofte høyere urenheter, reduserte konsentrasjoner og færre supercoiled DNA, som alle kan påvirke nedstrømsproduksjonen av rAAV og anbefales derfor ikke.
Det er viktig å forstå strukturen og egenskapene til ITR under kloning. For det første er det ekstremt vanskelig å bruke PCR gjennom ITR. Kloning av design som krever PCR-forsterkning gjennom ITR bør unngås, og i tillegg begrense bruken av Gibson-monteringskloningsteknikken. Som sådan er kloning av restriksjonsenzymer den foretrukne metoden for kloning i ITR-holdige plasmider. Videre kan det hende at visse primere for Sanger-sekvensering ikke er kompatible hvis det sekvenserte området inneholder ITR. I stedet anbefales det å bruke primere som sekvenserer vekk fra ITR-ene og inn i vektorgenomkroppen for å få mer presise sekvenseringsresultater. For det andre er ITR utsatt for delesjoner, omorganiseringer og mutasjoner når de transformeres til bakterier for plasmidamplifikasjon32,33. For å redusere disse hendelsene anbefales det å bruke kompetente bakteriestammer med rekombinasjonsmangel, som Stbl3, og inkubere dem ved 30 °C for å bremse celledelingen. Til slutt har det blitt observert at mindre kolonier kan korrespondere med kloner uten omorganiseringer eller slettinger, da de uten ITR kan gi en vekstfordel og være større. Derfor anbefales det å velge kolonier som er små.
Vektor produksjon
Den vellykkede produksjonen av rAAV-vektor kan påvirkes av flere elementer. En kritisk faktor er helsen til HEK293 eller 293T-celler som brukes til transfeksjon. Generelt er lave passasjenumre ideelle, da høyt passasjerte celler kan utvise genotypiske og fenotypiske varianser som kan redusere rAAV-titer. I tillegg bør tettheten av de frøede cellene være 75% -90% sammenløp for effektiv produksjon. Spredte celler genererer lave vektorutbytter fordi det er færre celler tilgjengelig for å produsere vektorer, mens overgrodde celler ikke vil bli effektivt transfektert.
Variasjoner mellom reagenspartier, cellelagre og generell lab-til-lab-variabilitet bidrar til forskjeller i transfeksjonseffektivitet og produksjonstiter. En optimaliserbar faktor som kan føre til titerforbedringer er plasmid: PEI-forholdet i transfeksjonsreaksjoner. Det er viktig å bruke fersk (<1 måned gammel) PEI MAX. Det anbefales at et plasmid:PEI-forhold på 1:1 brukes som utgangspunkt, og hvis transfeksjons- eller transduksjonseffektiviteten virker dårlig, test flere forskjellige forhold. Titeroptimalisering er enklest hvis du bruker et transgen med en visuell avlesning, for eksempel CMV.Luc.IRES.EGFP-reporteren trangene som brukes her som utgangsmateriale for kloning. For å utføre optimaliseringen, følg protokoll trinn 3 ved hjelp av en 12-brønns plate og skalering ned plasmidmassene og reagensvolumene med to (endelig plasmidmasse er 2,6 μg). Juster PEI-volumet tilsvarende for å korrespondere med forhold fra 1:0,75 til 1:3, med økende økninger på 0,25 (figur 6). Fortynn hver reaksjon med 950 μL SF-medier etter 15 minutter. For enkelhets skyld kan en masterblanding som inneholder trippelplasmidene lages og pipetteres individuelt i 1,5 ml rør før tilsetning av PEI-se tilleggsfil 2. Høst vektoren, transdusere celler av interesse og bilde. Brønnen med høyest transduksjonseffektivitet (andel GFP+ celler) tilsvarer det høyeste titer og mest optimale forholdet mellom PEI:DNA.
Figur 6: Arbeidsflyt for PEI-optimalisering. Skjematisk av trinnene som kreves for PEI-optimalisering. Flere forhold mellom plasmid: PEI testes for å bestemme det optimale forholdet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Høste- og titerhensyn
Fryse-/tineteknikken som brukes til å høste rAAV-vektor, lyser effektivt HEK293-celler på en måte som er kompatibel med direkte bruk av det klargjorte lysatet for å transdusere dyrkede celler. Visse rAAV-serotyper, som AAV1, AAV8 og AAV9, frigjøres fra celler under vektorproduksjon og kan høstes fra det dyrkede cellemediet uten fryse-/tinesykluser34. Metoden beskrevet her gir typisk titere i størrelsesorden 1 x 10 10 VG/ml ved bruk av AAV2-kapsider, og 1 x10 11 VG/ml for AAV8. Mens høyere titere kan oppnås ved vaskemiddel eller annen kjemisk basert lysis, er disse skadelige for celler i nedstrøms bruk og krever at rAAVs blir ytterligere renset fra lysatet. Lavere titer er en avveining en forsker bør vurdere når man skal avgjøre om råpreparater passer for deres forskningsbehov, men de marginalt lavere titere produsert av metodene beskrevet her kan transdusere mange celletyper veldig bra (se representative resultater). I tillegg til transfeksjonseffektivitet og cellehelse, varierer vektortitere avhengig av kapsidet som brukes under rAAV-produksjon og størrelsen og sekvensen av transgenet i VG35.
Ved høsting av råvektorpreparater kan plasmid-DNA som ble brukt under trippelplasmidtransfeksjon være tilstede og, selv om det er sjeldent, resultere i nedstrøms transfeksjon under transduksjon. Videre kan uemballerte VG-er binde seg til utsiden av kapsider og påkalle en medfødt immunrespons mot nakent og fremmed enkeltstrenget DNA36,37. Derfor kan sensitive celletyper kreve at vektorpreparater fordøyes og renses for å fjerne uemballerte VG-er og plasmid.
Hvis man ønsker å beregne titer av et råpreparat, kan qPCR utføres for å kvantifisere antall pakkede VG inne i DNase-resistente partikler (DRP). Kort fortalt fordøyes en liten mengde råpreparat for å fjerne plasmid-DNA, forurensende nukleinsyrer eller delvis pakket VG. Prøven blir deretter gjenstand for qPCR og den beskyttede VG inne i DRPs kvantifiseres, noe som resulterer i en titer med enheter vektorgenom per ml råpreparat38. Det anbefales ikke å utføre vektortitrering ved bruk av ELISA-baserte analyser som kvantifiserer kapsidtiter. Sammenlignet med villtype AAV-virus lider rAAV av en andel tomme og delvis pakkede kapsider39. ELISA vil kvantifisere alle kapsider uavhengig av genominnholdet og vil overvurdere de overførbare enhetene som er tilstede i et preparat, noe som krever en pakket VG.
Transduksjon betraktninger
Mange faktorer påvirker rAAV-transduksjoner, og det bør tas riktige hensyn for ethvert nytt eksperiment. Avhengig av promotoren som driver transgenuttrykk, kan uttrykksutbrudd oppstå så tidlig som 4 timer etter transduksjon (hpt), og topputtrykk oppnås vanligvis ved 48 hpt. Det er viktig å huske på varigheten av tiden fra den første såingen av celler til det eksperimentelle endepunktet. Dette er for å estimere startkonfluensen til cellene og sikre at de ikke vokser over ved slutten av forsøket. Hvis celler blir overkonfluerende, kan cellulær oppførsel endres på grunn av en stressrespons og kan forvirre eksperimentelle resultater. Noen celletyper, som U2-OS, tåler overvekst/kontakthemming ganske godt. I tillegg tåler de lange perioder (48 h+) i serumfritt kondisjonert medium – produktet av denne produksjonsprotokollen. Imidlertid kan sensitive celletyper kreve serumtillegg eller fortynning av råpreparatet med spesielt vekstmedium for å opprettholde helsen under transduksjon. En noe redusert transduksjonseffektivitet ved bruk av serumholdige medier er en potensiell avveining for cellehelse og bør vurderes av forskeren.
Vanligvis, for raskt delende celler, er en startkonfluens på rundt 50% optimal for applikasjoner som vil bli avsluttet 48 hpt. Imidlertid kan sammenløp justeres tilsvarende basert på eksperimentets behov. Det anbefales ikke å transdusere monolayer-type immortaliserte cellelinjer over 75% konfluens på grunn av redusert transduksjonseffektivitet. De fleste dyrkede celletyper blir vellykket transdusert og friske etter inkubasjon over natten med rå rAAV-preparater, etterfulgt av bytte til ferske serumholdige medier om morgenen.
Kapsidserotype er en viktig faktor å vurdere når man produserer rAAV for å transdusere en målcelle, da kapsidet er den primære determinanten for cellulær tropisme og påfølgende transgenuttrykk13. AAV2 er en mye brukt serotype på grunn av sin evne til effektivt å transdusere mange typer dyrkede celler12. Denne egenskapen til AAV2 kan tilskrives heparinsulfatproteoglykaner (HSPG) som tjener som den primære vedleggsfaktoren for AAV2 og de høye nivåene av HSPG på dyrkede celler fra tilpasningen til å vokse i en tallerken40. Andre kapsider, som AAV9, er mindre effektive til å transdusere brede celletyper og kan forklares av deres avhengighetstilknytningsfaktorer som ikke uttrykkes i denne innstillingen41. Vi anbefaler derfor AAV2 som førstevalgskapsid i dyrkede celler dersom ønsket målcelle ikke tidligere er testet med rAAV i litteraturen.
Vær oppmerksom på at en stor begrensning for råvektorpreparater er at de er upassende for å transdusere dyremodeller. In vivo studier krever preparater som skal renses og gjennomgå kvalitetsvurdering.
Transgene uttrykk og potensielle integrasjonshensyn
rAAVs resulterer ikke pålitelig i permanent ekspresjon av transgenet. Over tid kan VGs bli fortiet og transgene uttrykk kan bli stengt etter flere passasjer42. I tillegg forblir flertallet av VG-er episomale, og rAAV-er inneholder ikke virale Rep-proteiner som vil formidle hyppig integrasjon i vertsgenomet som i en villtype viral lysogen infeksjon eller fremme replikasjon av VGs43. Som et resultat vil episomer i transducerte celler etter hvert bli fortynnet ut blant datterceller gjennom divisjoner.
Basal-nivå integrasjon er en mulighet for alt levert transgent DNA-materiale. ITR-holdige VG-er er imidlertid utsatt for integrasjon med høyere frekvens44. Derfor kan permanent ekspresjon av et transgen observeres i en liten delmengde av celler. Brukere bør vurdere denne muligheten spesielt når de bruker rAAV til å levere DNA-skjærende enzymer, som Cas9, da dobbeltstrengede brudd kan resultere i en enda større frekvens av integrasjon og permanent uttrykk45. Selv om dette gjør rAAV til en god kandidat for å levere homologirettede reparasjonsmaler for endogen merking eller genaddisjon, bør muligheten for Cas9-innsetting vurderes19,46.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Robert Tjian og Xavier Darzacq for deres støtte og bruk av laboratorieutstyr. Vi takker Kay for hans gave av KP1 og LK03 rep / cap plasmider, og Luk Vandenberghe for AAV4 rep / cap plasmid. Finansiering ble gitt av Howard Hughes Medical Institute (34430, RT) og California Institute for Regenerative Medicine Training Program EDUC4-12790. NW anerkjenner finansiering fra Berkeley Stem Cell Center via et Siebel postdoktoralt stipend og fra den tyske forskningsstiftelsen (DFG) via et Walter Benjamin-stipend.
Snapgene DNA viewing sofrware | Snapgene | ||
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 | AddGene | 105533 | |
pAAV2/2 (Rep/Cap) | AddGene | 104963 | |
pAdΔF6 | AddGene | 112867 | |
LB Agar Carbenicillin | Sigma-Aldrich | L0418 | |
Boekel Scientific Economy Digital Incubator | Boekel Scientific | 133000 | |
LB medium, powder | MP Biomedicals | 113002042 | |
Carbencillin (Disodium) | GoldBio | C-103-5 | |
New Brunswick I26 Shaker | Eppendorf | M1324-0000 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22627040 | |
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit | Qiagen | 12945 | |
PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS | USA Scientific | 1402-3900 | |
Mastercycler nexus | Eppendorf | 6333000022 | |
dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
5x Phusion Buffer | NEB | B0518S | Provided with purchase of Phusion Polymerase |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
Gel Loading Dye, Orange (6X) | NEB | B7022S | |
DNA Clean & Concentrator-100 | Zymo | D4029 | |
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo | D4001 | |
NotI-HF | NEB | R3189S | |
EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
CutSmart Buffer (10x) | NEB | B6004S | Provided with purchase of restriction enzyme |
UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500100 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | Provided with purchase of T4 Ligase |
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL) | Eppendorf | 22363204 | |
Precision Microprocessor Water Bath | Thermo Scientific | 51221046 | |
Sterile Plastic Culture Tubes | Fisher Scientific | 149566B | |
2.0 mL Microcentrifuge Tube | Thomas Scientific | 1149Y01 | |
ZR Plasmid Miniprep – Classic | Zymo | D4015 | |
Xma1 | NEB | R0180S | |
Sma1 | NEB | R0141S | |
HEK 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
Falcon 6-well | Corning | 353046 | |
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo-Fisher | 11995065 | |
Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 Incubator | Marshall Scientific | MCO-18AIC | |
PEI MAX (Polyethylenimine Hydrochloride) | Polysciences | 24765-100 | |
Mixer Vortex Genie 2 | Electron Microscopy Sciences | 102091-234 | |
Sanyo Ultra Low Freezer | Sanyo | 14656-15267-16219 | |
INCU-Line IL 10 with transparent window | VWR | 390-0384 | |
Eppendorf Microcentrifuges | Eppendorf | 05-400-005 | |
Falcon 96-well | Corning | 353072 | |
C57BL/6J mice | JAX | strain #000664 | |
organoid growth medium | STEMCELL Technologies | 6005 | |
L Wnt-3A cells | ATCC | CRL-2647 | |
nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | |
CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72052 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane | Fisher | 356231 | |
24-well plate | Fisher | 08-772-1 | |
D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-250 | |
TrypLE Express | Fisher | 12604013 | |
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | STEMCELL Technologies | 36254 | |
polybrene | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
48-well plates | Fisher | 08-772-3D | |
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Fisher | 12-565-470 | |
BeWo cells | ATCC | CCL-98 | |
F-12K Medium | ATCC | 30-2004 | |
Hepa1-6 | ATCC | CRL-1830 | |
Huh7 | UC Berkeley BSD Cell Culture Facility | HUH-7 | |
C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
HSkMC | ATCC | PCS-950-010 | |
Skeletal Muscle Cell Growth Medium | Sigma | C-23060 | |
Skeletal Muscle Differentiation Medium | Sigma | C-23061 | |
Invitrogen EVOS Digital Color Fluorescence Microscope | Fisher Scientific | 12-563-340 | |
Perkin Elmer Opera Phenix | Perkin Elmer | HH14001000 | |
PhenoPlate 96-well | Perkin Elmer | 6055302 | |
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Thermo-Fisher | 31053028 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo-Fisher | 35050079 | |
Sodium Pyruvate | Thermo-Fisher | 11360070 | |
pAAV2/5 (Rep/Cap) | Addgene | 104964 | |
pAAV2/8 (Rep/Cap) | Addgene | 112864 | |
pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap) | Addgene | 130878 | |
pAAV2/9n (Rep/Cap) | Addgene | 112865 | |
pAnc80L65AAP | Addgene | 92307 | |
KP1 (rep/cap) | gifted by Professor Mark Kay (Stanford University) | ||
LK03 (rep/cap) | gifted by Professor Mark Kay (Stanford University) | ||
pAAV4 (rep/cap) | gifted by Professor Luk Vandenberghe (Harvard Medical School) | ||
pAAV.Cas9.sgRNA | Addgene | 61591 | |
pAAV.MCS | Addgene | 46954 | |
gBlock (synthetic DNA fragement) | IDT |