Summary
نقدم طريقة بسيطة ويمكن الوصول إليها لتصور البكتيريا الزرقاء الخيطية في المستوى XY. تم استخدام مصفوفة أغاروز منخفضة النقطة ، مما يسمح بالحصول على صور للبروتينات المشاركة في الانقسام ، في اتجاه رأسي. لذلك ، يمكن تطبيق هذه المنهجية على أي كائن خيطي وأنواع مختلفة من البروتينات.
Abstract
الحدث الرئيسي في انقسام الخلايا البكتيرية هو عملية التقسيم ، حيث يكون بروتين FtsZ هو العنصر الأساسي. بلمرة FtsZ لتشكيل بنية تشبه الحلقة (حلقة Z) في منتصف الخلية التي تعمل بمثابة سقالة لبروتينات الانقسام الأخرى. أظهر الفحص المجهري فائق الدقة في النماذج البكتيرية Escherichia coli و Bacillus subtilis أن الحلقة Z متقطعة ، بينما أظهرت دراسات تصوير الخلايا الحية أن FtsZ يتحرك على طول الحلقة بواسطة آلية تعرف باسم جهاز المشي. لدراسة ديناميات FtsZ في الجسم الحي ، يعد وضع خلية خاصة في وضع رأسي ضروريا لتصوير البنية الكاملة للحلقة في المستوى XY. في حالة تصوير FtsZ في البكتيريا الزرقاء متعددة الخلايا ، مثل Anabaena sp. PCC7120 ، فإن الحفاظ على الخيوط في وضع عمودي يمثل تحديا بسبب حجم الخلايا وطول الخيوط. في هذه المقالة ، نصف طريقة تسمح بالشلل الرأسي لخيوط Anabaena sp. PCC 7120 باستخدام أغاروز ومحاقن منخفضة نقطة الانصهار ، لتسجيل الحلقة Z في متحولة تعبر عن بروتين اندماج FtsZ-sfGFP. هذه الطريقة هي طريقة سريعة وغير مكلفة لتسجيل ديناميكيات البروتين في موقع الانقسام باستخدام المجهر متحد البؤر.
Introduction
انقسام الخلايا البكتيرية هو العملية التي تولد فيها الخلية الأم خليتين ابنتين ، في معظم الحالات بواسطة الآلية المعروفة باسم الانشطار الثنائي. أحد الأحداث المبكرة في عملية الفصل هو توطين FtsZ في منتصف الخلية1. يتم حفظ هذا البروتين ، المتماثل هيكليا مع توبولين2 ، وتوزيعه على نطاق واسع في معظم البكتيريا ، وتولد بلمرته بنية مقلصة تعرف باسم الحلقة Z3. تعمل هذه الحلقة كسقالة لبروتينات الانقسام الأخرى وتشكل معا آلية جزيئية تسمى divisome. أظهرت العديد من الدراسات أن الحلقة Z ديناميكية للغاية وأن خيوط FtsZ الأولية تتحرك عن طريق الطحن4،5،6. لدراسة الحلقة Z في تجارب الفاصل الزمني ، ينصح بتسجيل موقع القسمة في المستوى XY للحصول على دقة أفضل وأخذ عينات سريعة. من أجل تحقيق ذلك ، من الضروري تطوير طرق تجميد الخلايا العمودية التي تشمل عادة التصنيع النانوي لمصائد الخلايا ذات الثقوب الدقيقة وأجهزة الموائع الدقيقةالمعقدة 7.
البكتيريا الزرقاء هي كائنات دقيقة ضوئية تصنف على أنها سالبة الجرام من خلال مورفولوجيتها الخلوية. ومع ذلك ، من الناحية التطورية فهي أقرب إلى البكتيريا إيجابية الجرام8. تحتوي هذه الكائنات الحية على جينات انقسام الخلايا الشائعة داخل البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام ، لكن قسمها يحتوي أيضا على عناصر فريدة9. Anabaena sp. PCC 7120 (المشار إليها فيما يلي باسم Anabaena sp.) هي بكتيريا زرقاء خيطية ذات مستوى تقسيم واحد وهي نموذج لدراسة انقسام الخلايا في البكتيريا الزرقاء متعددة الخلايا. في هذه السلالة ، كان من الممكن تحديد موضع FtsZ في منتصف الخلايا10. ومع ذلك ، لا توجد دراسات تظهر ديناميكيات FtsZ في الجسم الحي في هذا النموذج. في مختبرنا ، من خلال التزاوج الثلاثي وإعادة التركيب المتماثل ، حصلنا على طفرة منفصلة تماما من Anabaena sp. التي تعبر عن بروتين FtsZ المنصهر في sfGFP ، والذي حل محل جين ftsZ الداخلي الكامل. لقد طورنا طريقة سريعة وبسيطة لتجميد الخلايا تفضل الاتجاه الرأسي لخيوط السلالة الطافرة لتجارب الفاصل الزمني لتصور انقسام البروتينات في البكتيريا الزرقاء الخيطية. لا تحتاج هذه الطريقة إلى أجهزة الموائع الدقيقة التي يمكن أن تكون باهظة الثمن ويصعب تطويرها. على سبيل المثال ، استخدمنا هذا البروتوكول لتصور الحلقة Z في متحولة FtsZ-sfGFP بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. اعتبارات واختيار النموذج الخلوي
ملاحظة: البكتيريا الزرقاء لها تألق ذاتي قوي بسبب وجود أصباغ التمثيل الضوئي. هذه الإشارة موجودة في الجزء الأحمر من الطيف ، وبالتالي ، فإن البروتينات الفلورية المناسبة للتصوير في البكتيريا الزرقاء هي تلك البعيدة عن الانبعاث الأحمر. على سبيل المثال ، GFP و YFP و Venus و Turquoise و BFP.
- حدد مكونا ثنائيا موجودا في سلالة البكتيريا الزرقاء الخيطية المستهدفة. بالنسبة للتجارب ، من الضروري بناء طفرة بكتيرية زرقاء خيطية تعبر عن المكون ثنائي الانقسام المختار المنصهر في بروتين الفلورسنت. في هذا البروتوكول ، أ Anabaena sp. متحولة تعبر عن FstZ-sfGFP ، كمثال. تم الحصول على هذه السلالة عن طريق التزاوج الثلاثي مع الإشريكية القولونية11.
- تحقق من مستوى فصل المتحور الذي سيتم استخدامه. في المثال ، تم تحديد الفصل عن طريق تضخيم PCR للجين المستهدف. متحور FtsZ-sfGFP المستخدم في هذا البروتوكول هو سلالة منفصلة تماما تفتقر إلى جين ftsZ من النوع البري.
2. ظروف النمو
- قم بعمل مزرعة فرعية جديدة من الطافرة باستخدام مزرعة 10 مل في المرحلة الثابتة (نمت لمدة 14 يوما تقريبا في ضوء ثابت ، عند 25 درجة مئوية ، ل Anabaena sp.) وإضافة إلى 90 مل من وسط BG11 المكمل بالمضادات الحيوية (سبكتينومايسين والستربتومايسين 10 ميكرولتر مل -1 لمتحولة FtsZ-sfGFP).
- تنمو زراعة الخلايا الجديدة في ضوء ثابت وفي درجة الحرارة المثلى حتى الوصول إلى المرحلة الأسية. يزرع متحور FtsZ-sfGFP من Anabaena sp. عند 25 درجة مئوية لمدة 7 أيام قبل تحضير العينة.
3. إعداد عينة في مصفوفة أغاروز
- خذ 2 مل من ثقافة النمو المتجانسة.
- جهاز طرد مركزي عند 2500 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- في غضون ذلك ، في دورق سعة 50 مل ، قم بتسخين 30 مل من الأغاروز منخفض نقطة الانصهار بنسبة 3٪ في وسط سائل BG11. استخدم ضبط الميكروويف على مستوى الطاقة المتوسط وتحقق من المحلول كل 15 ثانية حتى يذوب تماما. توضع جانبا لتبرد إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: الأوتوكلاف محلول الأغاروز لتجنب التلوث. - بمجرد الانتهاء من الطرد المركزي ، تخلص من 1.9 مل من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في الحجم المتبقي عن طريق سحب ثلاث مرات على الأقل لأعلى ولأسفل.
- امزج الخلايا المعاد تعليقها مع 900 ميكرولتر من محلول الأغاروز 3٪ عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ثلاث مرات على الأقل.
ملاحظة: يجب أن يكون محلول الأغاروز سائلا ولكن ليس ساخنا جدا لتجنب تلف الخلايا. يجب تنفيذ الخطوة التالية بسرعة وقبل أن يشكل محلول الأغاروز مادة هلامية مثل الاتساق =. - نضح مصفوفة الأغاروز في حقنة 1 مل بعناية. من المهم تجنب توليد الفقاعات أثناء استنشاق العينة باستخدام المحقنة.
ملاحظة: قبل هذه الخطوة ، تأكد من قطع طرف المحقنة لإزالة فتحة الدخول الضيقة. - دع خليط عينة الأغاروز يتصلب عن طريق وضع المحقنة في الوضع الأفقي في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
- قم بإزالة مصفوفة الأغاروز بعناية باستخدام المكبس وضعه على سطح نظيف ومستو.
- قطع العينة الصلبة إلى شرائح ، في نطاق سمك 0.5 - 1 مم ، والحفاظ على سلامة المصفوفة.
ملاحظة: للحصول على نتائج أفضل ، قم بقص مصفوفة الأغاروز باستخدام مشرط أو شفرات حلاقة رفيعة. - ضع الشرائح جنبا إلى جنب على غطاء. يعتمد عدد الأقراص الموجودة على قسيمة الغطاء على أبعادها.
ملاحظة: بالنسبة للفحص المجهري بفاصل زمني ، يوصى باستخدام حجرة خلوية مصنوعة للتحليل المجهري (على سبيل المثال ، غرف Attofluor أو Chamlide المغناطيسية). تسمح هذه الغرف بالحصول على العينة لتجنب الجفاف. في هذا المثال ، يتم تحضير العينات على أغطية مستديرة (25 مم) باستخدام غرفة Attofluor. - أضف 2 مل من محلول الأغاروز المذاب بنسبة 3٪ على العينة الموضوعة في الحجرة لمنع الجفاف.
- انتظر حتى يتم ترسيخ محلول الأغاروز تماما لتشكيل هلام.
4. الحصول على الصور
- توحيد المعلمات لتصور البروتين الفلوري محل الاهتمام في سلالة متحولة في المجهر متحد البؤر. تأكد من أن المجهر يمكنه اكتشاف كل من التألق الذاتي وعلامة الفلورسنت المحددة.
- تصور العينة في شكل المجال الساطع بأقصى تكبير ، وابحث عن خيوط موجهة رأسيا كما هو موضح في الشكل 1.
- ابحث عن موقع التقسيم محل الاهتمام من خلال مسح أولي باستخدام إشارة التألق الذاتي على طول المستوى Z.
- استخدم معلمات علامة البروتين الفلوري لتصور إشارة البروتين محل الاهتمام في موقع التقسيم.
- إجراء تجارب الفاصل الزمني وفقا للنموذج البيولوجي والبروتين محل الاهتمام. على سبيل المثال ، في هذه الحالة ، تم إجراء تجارب الفاصل الزمني لمدة 10 ثوان في 50 ثانية لتسجيل ديناميكيات FtsZ على طول الحلقة Z في Anabaena sp. (الشكل 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصور الحلقة Z في Anabaena sp. باستخدام طريقة الشلل الرأسي
لدراسة ديناميات مكونات الحلقة Z في البكتيريا ، من الضروري الحصول على صور في الخلايا الموجهة رأسيا. في هذا الموقف ، من الممكن تصور الحلقة Z والبروتينات الرئيسية لل divisome لمراقبة ديناميكيات البروتين عن طريق الفحص المجهري بفاصل زمني. لا يعمل تحضير العينة الكلاسيكي للبكتيريا مع البكتيريا الزرقاء الخيطية. في حالة Anabaena sp. ، يتم توجيه الخيوط في وضع لا يسمح بتصور الحلقة Z. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن الحفاظ على الخيوط ثابتة من أجل التصور الصحيح لبروتينات انقسام الخلايا في خلية واحدة على مدى فترات زمنية طويلة. لذلك ، من أجل تصور حلقات Z لمتحولة FtsZ-sfGFP في Anabaena sp ، قمنا بتطوير وتوحيد بروتوكول باستخدام أغاروز LMP والحضانة الأفقية للعينة. يسمح هذا البروتوكول بالحصول على نسبة أعلى من الخيوط الموجهة رأسيا ، مقارنة بالإجراءات المستخدمة سابقا (الشكل 1). لذلك ، كان من الممكن تسجيل الحلقة Z في المستوى XY في خلايا السلالة الطافرة عند الاتصال المباشر مع غطاء الغطاء (الشكل 2A).
ديناميكيات الحلقة Z في FtsZ-sfGFP Anabaena sp. متحولة باستخدام طريقة التثبيت الرأسي
بعد اختبار طريقة التثبيت الرأسي في الفحص المجهري التقليدي متحد البؤر ، تم تصوير عينات من متحولة FtsZ-sfGFP Anabaena sp المحضرة باستخدام نفس البروتوكول بواسطة مجهر Airyscan. باستخدام هذه التقنية ، لاحظنا تبييضا ضوئيا أقل في الحلقات ، وبالتالي ، يمكن إجراء التجارب لفترات أطول دون فقدان إشارة التألق. في الواقع ، تمكنا من الحصول على صور لفترات تقارب 16.5 دقيقة ، مع الحصول على صور كل 10 ثوان مع انخفاض التبييض الضوئي ، مما سمح لنا باكتشاف الاختلافات في شدة التألق بمرور الوقت في مناطق مختلفة من الحلقة Z (الشكل 2B).
الشكل 1. تصور خيوط Anabaena sp. باستخدام طريقة التثبيت الرأسي. تم تحضين عينة من Anabaena sp. أفقيا في LMP agarose 3٪ في BG11 داخل حقنة. ثم تم تقطيع العينة إلى أقراص ووضعها أخيرا في حجرة الخلية. تم إجراء تصور الخلايا باستخدام مجهر مقلوب. (أ) مجهر برايت فيلد التمثيلي لعينة محتضنة في مصفوفة الأغاروز دون تنفيذ طريقة التثبيت الرأسي. توضح هذه الصورة أن معظم الخيوط موجهة أفقيا. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (ب) مجهر برايت فيلد التمثيلي يظهر نسبة عالية من الخيوط الموجهة رأسيا ل Anabaena sp. بعد استخدام طريقة التثبيت الرأسي. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2. تصور الحلقة Z في خيوط موجهة رأسيا من Anabaena sp. باستخدام طريقة الشلل الرأسي. لعرض حلقات Z في المستوى XY ، تم تحضين خلايا سلالة sfGFP-FtsZ في أغاروز LMP بنسبة 3٪ عند 25 درجة مئوية بعد طريقة التثبيت الرأسي (A.I). يظهر مجهر برايتفيلد خيطا من المتحولة في وضع رأسي. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (A.II) إشارة FtsZ-sfGFP في حلقة Z من الفتيل الموضح في (A.I ). هذه الصورة هي متوسط كثافة 6 صور تم التقاطها كل 10 ثوان لمدة 1 دقيقة. شريط المقياس = 2 ميكرومتر (B) إشارة FtsZ-sfGFP للحلقة Z المسجلة كل 10 ثوان لمدة 50 ثانية في خلايا متحولة FtsZ-sfGFP الموجهة رأسيا في مصفوفة BG11-agarose. يشار إلى الوقت (بالثواني) في الزاوية اليسرى العليا من كل صورة. من الممكن مراقبة الحلقة Z ومجموعة من FtsZ-sfGFP التي تغير موضعها بمرور الوقت (الأسهم البيضاء). شريط المقياس = 1 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لا شك أن دراسة ديناميات البروتينات ثنائية الانقسام تمثل تحديا. على وجه الخصوص ، في البكتيريا الزرقاء الخيطية ، يتمثل أحد التحديات في تصور الحلقة Z في المستوى الأفقي ، والتي يجب أن تكون الخلايا موجهة رأسيا لها. تسمح الطريقة التي وصفناها هنا بوضع الحلقة Z في المستوى XY لإجراء التحليلات المختلفة. هذه هي أول طريقة بسيطة للبكتيريا الزرقاء الخيطية التي تسمح بالتصور الكامل للحلقة Z.
على الرغم من أن هذا البروتوكول بسيط وسريع ، إلا أنه يجب توخي الحذر بشكل خاص أثناء خطوة تحضير العينة في مصفوفة الأغاروز ، حيث يجب أن يكون الأغاروز ذو درجة الانصهار المنخفضة في درجة حرارة مناسبة ليكون سائلا بدرجة كافية للخلط مع محلول الخلية. في الوقت نفسه ، لا يمكن أن يكون محلول الأغاروز دافئا جدا لأنه قد يؤدي إلى تلف الخلايا. خطوة أخرى مهمة يجب مراعاتها هي قطع الأقراص لأنه إذا لم يتم ذلك بعناية ، فقد تنهار المصفوفة وتتلف العينة.
باستخدام هذه الطريقة ، تكون نسبة الخيوط في الوضع الرأسي أعلى من البروتوكول الكلاسيكي. ومع ذلك ، من الضروري قطع أكبر عدد ممكن من الأقراص لضمان التحليل الإحصائي ، أي عدة خيوط في وضع رأسي.
بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، حيث يمكن إجراء دراسات الخلية المفردة في أنظمة الموائع الدقيقة ، فإن طريقتنا أسهل وأسرع وأرخص ، ولا تتطلب سوى المواد والكواشف المتوفرة بسهولة في أي مختبر. من ناحية أخرى ، على الرغم من استخدام أنظمة الموائع الدقيقة على نطاق واسع في دراسات البكتيريا الزرقاء متعددة الخلايا ، على حد علمنا أنها لم تحل مشكلة وضع الخلية في وضع عمودي12.
أحد قيود هذه التقنية هو أن الاتجاه ليس دائما مثاليا. هذا لأننا رأينا خيوطا مائلة في مصفوفة الأغاروز ، ومع ذلك ، مع الفحص السابق باستخدام إشارة التألق الذاتي ، من الممكن تحديد هذه القطعة الأثرية. أيضا ، لم نتمكن من تصور حدث تقسيم كامل ، لأن هذا البروتوكول يسمح بتصور موقع القسمة بقدر ساعة واحدة ، في حين أن وقت تقسيم Anabaena sp. حوالي 12 ساعة. ومع ذلك ، يمكن أن يكون هذا البروتوكول مفيدا لتسجيل حدث انقسام كامل في البكتيريا سريعة النمو.
على الرغم من أن طريقتنا كانت موحدة ل Anabaena sp. يمكن تطبيقها على جميع البكتيريا الزرقاء الخيطية أو الكائنات الخيطية ، لدراسة ليس فقط FtsZ ولكن أيضا البروتينات الأخرى المرتبطة ب divisome لأنها ستكون موجهة في نفس المستوى XY.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا يوجد تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن ممتنون لمنح الدكتوراه الوطنية (ANID 21211333 ؛ 21191389) للتمويل. جرانت فونديسيت 1161232.
تم دعم هذا العمل من قبل مرفق الفحص المجهري المتقدم UMA UC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | - | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | - | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | - | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
- Löwe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
- Erickson, H. P. FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin. Cell. 80 (3), 367-370 (1995).
- Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E. coli cytokinesis. , 1-24 (2016).
- Perez, A. J., et al. Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).
- Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
- Yang, X., et al. GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis. Science. 355 (6326), 744-747 (2017).
- Whitley, K. D., et al. FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division. Nature Communications. 12 (1), (2021).
- Mazón, G., et al. LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Camargo, S., et al. ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Thiel, T., Peter Wolk, C. Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
