Summary
Представлен простой и доступный метод нитевидной визуализации цианобактерий в плоскости XY. Была использована агарозная матрица с низкой температурой плавления, позволяющая получать изображения белков, участвующих в делении, в вертикальной ориентации. Таким образом, эта методика может быть применена к любому нитевидному организму и различным видам белков.
Abstract
Основным событием в делении бактериальных клеток является процесс септации, где белок FtsZ является ключевым элементом. FtsZ полимеризуется, образуя кольцеобразную структуру (Z-кольцо) в середине клетки, которая служит каркасом для других белков деления. Микроскопия сверхвысокого разрешения на бактериальных моделях Escherichia coli и Bacillus subtilis показала, что Z-кольцо является прерывистым, в то время как исследования визуализации живых клеток показали, что FtsZ движется вдоль кольца с помощью механизма, известного как беговая дорожка. Для изучения динамики FtsZ in vivo необходимо специальное размещение ячейки в вертикальном положении для визуализации полной структуры кольца в плоскости XY. В случае визуализации FtsZ у многоклеточных цианобактерий, таких как Anabaena sp. PCC7120, поддержание нитей в вертикальном положении является сложной задачей из-за размера клеток и длины нитей. В этой статье мы описываем метод, который позволяет вертикально иммобилизовать нити Anabaena sp. PCC 7120 с использованием агарозы и шприцев с низкой температурой плавления для записи Z-кольца в мутанте, экспрессирующем слитый белок FtsZ-sfGFP. Этот метод является быстрым и недорогим способом регистрации динамики белка в месте деления с помощью конфокальной микроскопии.
Introduction
Деление бактериальных клеток — это процесс, при котором материнская клетка генерирует две дочерние клетки, в большинстве случаев с помощью механизма, известного как бинарное деление. Одним из самых ранних событий в процессе септации является локализация FtsZ в середине клетки1. Этот белок, который структурно гомологичен тубулину2, сохраняется и широко распространен у большинства бактерий, а его полимеризация создает сократительную структуру, известную как Z-кольцо3. Это кольцо служит каркасом для других белков деления, и вместе они образуют молекулярный механизм, называемый дивисомой. Несколько исследований показали, что Z-кольцо очень динамично и что протофиламенты FtsZ движутся с помощью беговой дорожки 4,5,6. Для изучения Z-кольца в покадровых экспериментах целесообразно записать участок деления в плоскости XY для лучшего разрешения и быстрой выборки. Для достижения этой цели необходимо разработать методы вертикальной иммобилизации клеток, которые обычно включают наноизготовление микродырочных клеточных ловушек и сложных микрофлюидных устройств7.
Цианобактерии - это фотосинтезирующие микроорганизмы, которые классифицируются как грамотрицательные по своей клеточной морфологии. Однако филогенетически они ближе к грамположительным бактериям8. Эти организмы имеют гены клеточного деления, которые распространены в грамположительных и грамотрицательных бактериях, но их дивисома также содержит уникальные элементы9. Anabaena sp. PCC 7120 (далее Anabaena sp.) представляет собой нитчатые цианобактерии с одной плоскостью деления и является моделью для изучения клеточного деления у многоклеточных цианобактерий. В этом штамме удалось определить положение FtsZ в середине ячеек10. Тем не менее, исследований, показывающих динамику FtsZ in vivo в этой модели, нет. В нашей лаборатории путем триродительского спаривания и гомологичной рекомбинации мы получили полностью сегрегированный мутант Anabaena sp., который экспрессирует белок FtsZ, слитый с sfGFP, который заменил полный эндогенный ген ftsZ. Мы разработали быстрый и простой метод иммобилизации клеток, который способствует вертикальной ориентации нитей мутантных штаммов для покадровых экспериментов по визуализации белков деления в нитевидных цианобактериях. Этот метод не нуждается в микрофлюидных устройствах, которые могут быть дорогими и сложными в разработке. В качестве примера мы использовали этот протокол для визуализации Z-кольца в мутанте FtsZ-sfGFP с помощью конфокальной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Соображения и выбор клеточной модели
ПРИМЕЧАНИЕ: Цианобактерии обладают сильной автофлуоресценцией из-за присутствия фотосинтетических пигментов. Этот сигнал находится в красной части спектра, поэтому флуоресцентные белки, подходящие для визуализации у цианобактерий, далеки от красного излучения. Например, GFP, YFP, Venus, Turquoise и BFP.
- Выберите компонент дивисомы, присутствующий в целевом нитчатом штамме цианобактерий. Для экспериментов необходимо сконструировать нитчатый мутант цианобактерий, экспрессирующий выбранный компонент дивисомы, слитый с флуоресцентным белком. В этом протоколе в качестве примера можно привести мутант Anabaena sp., который экспрессирует FstZ-sfGFP. Этот штамм был получен путем трехродительского спаривания с E. coli11.
- Проверьте уровень сегрегации мутанта, который будет использоваться. В примере сегрегацию определяли методом ПЦР-амплификации гена-мишени. Мутант FtsZ-sfGFP, используемый в этом протоколе, представляет собой полностью сегрегированный штамм, в котором отсутствует ген ftsZ дикого типа.
2. Условия произрастания
- Сделайте свежую субкультуру мутанта, используя 10 мл культуры в стационарной фазе (выращиваемой в течение примерно 14 дней при постоянном освещении при 25 ° C для Anabaena sp.) и добавляя к 90 мл среды BG11 с добавлением антибиотиков (спектиномицин и стрептомицин 10 мкл мл-1 для мутанта FtsZ-sfGFP).
- Выращивайте новую клеточную культуру при постоянном освещении и при оптимальной температуре до достижения экспоненциальной фазы. Мутант FtsZ-sfGFP Anabaena sp. выращивают при 25 °C в течение 7 дней перед пробоподготовкой.
3. Пробоподготовка в агарозной матрице
- Возьмите 2 мл гомогенизированной ростовой культуры.
- Центрифуга при 2 500 x g в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Тем временем в колбе объемом 50 мл нагрейте 30 мл 3% агарозы с низкой температурой плавления в жидкой среде BG11. Используйте микроволновую печь, установленную на средний уровень мощности, и проверяйте раствор каждые 15 с до полного растворения. Отложите в сторону, чтобы остыть до 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклавируйте раствор агарозы, чтобы избежать загрязнения. - После завершения центрифугирования откажитесь от 1,9 мл надосадочной жидкости и ресуспендируйте клетки в оставшемся объеме, пипетируя не менее трех раз вверх и вниз.
- Смешайте ресуспендированные клетки с 900 мкл 3% раствора агарозы, пипеткой вверх и вниз не менее трех раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор агарозы должен быть жидким, но не слишком горячим, чтобы избежать повреждения клеток. Следующий шаг должен быть выполнен быстро и до того, как раствор агарозы образует гелеобразную консистенцию =. - Осторожно аспирируйте агарозный матрикс в шприц объемом 1 мл. Важно избегать образования пузырьков во время аспирации образца с помощью шприца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед этим шагом убедитесь, что кончик шприца отрезан, чтобы исключить узкое входное отверстие. - Дайте образцу-агарозной смеси застыть, поместив шприц в горизонтальное положение при комнатной температуре на 2 часа.
- Осторожно снимите агарозную матрицу с помощью поршня и положите ее на чистую и ровную поверхность.
- Застывший образец нарезать ломтиками, в диапазоне толщин 0,5 – 1 мм, сохраняя целостность матрицы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшего результата разрежьте агарозную матрицу с помощью скальпеля или тонких бритвенных лезвий. - Положите ломтики рядом на покровное стекло. Количество дисков на покровном листе будет зависеть от его габаритов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для покадровой микроскопии рекомендуется использовать клеточную камеру, предназначенную для микроскопического анализа (например, магнитные камеры Attofluor или Chamlide). Эти камеры позволяют получать образец, избегая обезвоживания. В этом примере образцы готовятся на закругленных покровных стеклах (25 мм) с использованием камеры Attofluor. - Добавьте 2 мл расплавленного 3% раствора агарозы на образец, помещенный в камеру, чтобы предотвратить обезвоживание.
- Дождитесь полного застывания раствора агарозы, чтобы образовался гель.
4. Получение изображения
- Стандартизировать параметры для визуализации интересующего флуоресцентного белка в мутантном штамме в конфокальном микроскопе. Убедитесь, что микроскоп может обнаружить как автофлуоресценцию, так и выбранный флуоресцентный маркер.
- Визуализируйте образец в конформации яркого поля с максимальным увеличением и найдите вертикально ориентированную нить, как показано на рисунке 1.
- Найдите интересующий участок деления с помощью начального сканирования с использованием сигнала автофлуоресценции вдоль плоскости Z.
- Используйте параметры маркера флуоресцентного белка для визуализации сигнала интересующего белка в месте деления.
- Проводите покадровые эксперименты в соответствии с биологической моделью и интересующим белком. Например, в этом случае были проведены покадровые эксперименты продолжительностью 10 с за 50 с для регистрации динамики FtsZ вдоль Z-кольца у Anabaena sp. (рис. 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Визуализация Z-кольца у Anabaena sp. методом вертикальной иммобилизации
Для изучения динамики компонентов Z-кольца у бактерий необходимо получение изображений в вертикально ориентированных клетках. В этом положении можно визуализировать Z-кольцо и основные белки дивисомы для мониторинга динамики белков с помощью покадровой микроскопии. Классическая пробоподготовка для бактерий не работает для нитчатых цианобактерий. В случае Anabaena sp. нити ориентированы в положении, которое не позволяет визуализировать Z-кольцо. Кроме того, невозможно держать филаменты иммобилизованными для правильной визуализации белков клеточного деления в одной клетке в течение длительных периодов времени. Поэтому для визуализации Z-колец мутанта FtsZ-sfGFP в Anabaena sp мы разработали и стандартизировали протокол с использованием агарозы LMP и горизонтальной инкубации образца. Этот протокол позволяет получить более высокую долю вертикально ориентированных нитей, по сравнению с ранее использовавшимися процедурами (рис. 1). Таким образом, удалось зарегистрировать Z-кольцо в плоскости XY в клетках мутантного штамма при непосредственном контакте с покровным стеклом (рис. 2А).
Динамика Z-кольца в мутанте FtsZ-sfGFP Anabaena sp. с использованием метода вертикальной иммобилизации
После тестирования метода вертикальной иммобилизации в обычной конфокальной микроскопии образцы мутанта FtsZ-sfGFP Anabaena sp, приготовленные по тому же протоколу, были визуализированы с помощью микроскопии Airyscan. С помощью этого метода мы наблюдали меньшее фотообесцвечивание в кольцах, и, следовательно, эксперименты можно проводить в течение более длительных периодов времени без потери сигнала флуоресценции. Фактически, мы смогли получить изображения в течение примерно 16,5 минут, с получением изображений каждые 10 с с низким фотообесцвечиванием, что позволило нам обнаружить изменения интенсивности флуоресценции с течением времени в разных областях Z-кольца (рис. 2B).
Рисунок 1. Визуализация филаментов Anabaena sp. методом вертикальной иммобилизации. Образец Anabaena sp. инкубировали горизонтально в агарозе LMP 3% в BG11 в шприце. Затем образец разрезали на диски и, наконец, помещали в камеру камеры. Визуализацию клеток проводили с помощью инвертированного микроскопа. (A) Репрезентативная светлопольная микроскопия образца, инкубированного в агарозной матрице, без проведения метода вертикальной иммобилизации. На этом изображении видно, что большинство нитей ориентированы горизонтально. Масштабная линейка = 20 мкм. (B) Репрезентативная светлопольная микроскопия, показывающая высокую долю вертикально ориентированных нитей Anabaena sp. после использования метода вертикальной иммобилизации. Масштабная линейка = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Визуализация Z-кольца в вертикально ориентированных нитях Anabaena sp. методом вертикальной иммобилизации. Для отображения Z-колец в плоскости XY клетки штамма sfGFP-FtsZ инкубировали в агарозе LMP 3% при 25 °C после метода вертикальной иммобилизации (ИИ). Светлопольная микроскопия показывает нить мутанта в вертикальном положении. Масштабная линейка = 10 мкм. (A.II) Сигнал FtsZ-sfGFP в Z-кольце нити накала, показанный в (A.I ). Это изображение представляет собой среднюю интенсивность 6 изображений, сделанных каждые 10 с в течение 1 минуты. Масштабная линейка = 2 мкм (B) Сигнал FtsZ-sfGFP Z-кольца регистрируется каждые 10 с в течение 50 с в клетках мутанта FtsZ-sfGFP, ориентированных вертикально в матрице BG11-агарозы. Время (секунды) указано в верхнем левом углу каждого изображения. Можно наблюдать Z-кольцо и скопление FtsZ-sfGFP, которое меняет свое положение со временем (белые стрелки). Масштабная линейка = 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изучение динамики дивисомных белков, без сомнения, является сложной задачей. В частности, у нитчатых цианобактерий одной из проблем является визуализация Z-кольца в горизонтальной плоскости, для чего клетки должны быть ориентированы вертикально. Метод, который мы здесь описали, позволяет позиционировать Z-кольцо в плоскости XY для выполнения различных анализов. Это первый простой метод для нитчатых цианобактерий, который позволяет полностью визуализировать Z-кольцо.
Несмотря на то, что этот протокол является простым и быстрым, необходимо соблюдать особую осторожность на этапе пробоподготовки в агарозной матрице, поскольку агароза с низкой температурой плавления должна иметь подходящую температуру, чтобы быть достаточно жидкой для смешивания с раствором ячейки. В то же время раствор агарозы не может быть слишком теплым, так как он может спровоцировать повреждение клеток. Еще одним важным шагом, который следует учитывать, является резка дисков, потому что, если это не будет сделано аккуратно, матрица может разрушиться и повредить образец.
При использовании этого метода доля нитей в вертикальном положении выше, чем при классическом протоколе. Однако для обеспечения статистического анализа необходимо разрезать как можно больше дисков, т. е. несколько нитей в вертикальном положении.
По сравнению с другими методами, где можно проводить исследования отдельных клеток в микрофлюидных системах, наш метод проще, быстрее и дешевле, требуя только материалов и реагентов, которые легко доступны в любой лаборатории. С другой стороны, хотя микрофлюидные системы широко используются в исследованиях многоклеточных цианобактерий, насколько нам известно, они не решили проблему позиционирования клеток в вертикальном положении12.
Ограничением техники является то, что ориентация не всегда идеальна. Это связано с тем, что мы видели наклонные нити в агарозной матрице, однако при предыдущем скрининге с использованием сигнала автофлуоресценции можно идентифицировать этот артефакт. Кроме того, мы не смогли визуализировать полное событие деления, потому что этот протокол позволяет визуализировать место деления до 1 часа, в то время как время деления Anabaena sp. составляет около 12 часов. Тем не менее, этот протокол может быть полезен для регистрации полного деления у быстрорастущих бактерий.
Хотя наш метод был стандартизирован для Anabaena sp., он может быть применен ко всем нитчатым цианобактериям или нитчатым организмам для изучения не только FtsZ, но и других белков, связанных с дивисомой, поскольку они будут ориентированы в одной и той же плоскости XY.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликт интересов отсутствует.
Acknowledgments
Мы благодарны Национальным докторским стипендиям (ANID 21211333; 21191389) за финансирование. Грант Фондецит 1161232.
Эта работа была поддержана de Advanced Microscopy Facility UMA UC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | - | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | - | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | - | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
- Löwe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
- Erickson, H. P. FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin. Cell. 80 (3), 367-370 (1995).
- Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E. coli cytokinesis. , 1-24 (2016).
- Perez, A. J., et al. Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).
- Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
- Yang, X., et al. GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis. Science. 355 (6326), 744-747 (2017).
- Whitley, K. D., et al. FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division. Nature Communications. 12 (1), (2021).
- Mazón, G., et al. LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Camargo, S., et al. ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Thiel, T., Peter Wolk, C. Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
