Vertikal immobiliseringsmetode til time-lapse mikroskopi analyse i filamentøse cyanobakterier

Summary

Vi præsenterer en enkel og tilgængelig metode til filamentøs cyanobakteriel visualisering i XY-planet. En agarosematrix med lavt smeltepunkt blev anvendt, hvilket tillod erhvervelse af billeder af proteiner involveret i divisionen i lodret orientering. Derfor kan denne metode anvendes på enhver filamentøs organisme og forskellige slags proteiner.

Abstract

En hovedbegivenhed i bakteriel celledeling er septationsprocessen, hvor proteinet FtsZ er nøgleelementet. FtsZ polymeriserer og danner en ringlignende struktur (Z-ring) i midten af cellen, der tjener som et stillads for andre divisionsproteiner. Superopløsningsmikroskopi i bakteriemodeller Escherichia coli og Bacillus subtilis viste, at Z-ringen er diskontinuerlig, mens levende cellebilleddannelsesundersøgelser viste, at FtsZ bevæger sig langs ringen ved en mekanisme kendt som løbebånd. For at studere dynamikken i FtsZ in vivo er en speciel celleplacering i lodret position nødvendig for at afbilde ringens komplette struktur i XY-planet. I tilfælde af FtsZ-billeddannelse i flercellede cyanobakterier, såsom Anabaena sp. PCC7120, er det udfordrende at opretholde filamenterne lodret på grund af cellernes størrelse og filamenternes længde. I denne artikel beskriver vi en metode, der tillader lodret immobilisering af Anabaena sp. PCC 7120-filamenter ved hjælp af agarose og sprøjter med lavt smeltepunkt til registrering af Z-ringen i en mutant, der udtrykker et FtsZ-sfGFP-fusionsprotein. Denne metode er en hurtig og billig måde at registrere proteindynamik på divisionsstedet ved hjælp af konfokal mikroskopi.

Introduction

Bakteriel celledeling er den proces, hvor en modercelle genererer to datterceller, i de fleste tilfælde ved mekanismen kendt som binær fission. En af de tidligste begivenheder i septeringsprocessen er lokaliseringen af FtsZ i midten af celle¹. Dette protein, som er strukturelt homologt med tubulin², bevares og fordeles bredt i de fleste bakterier, og dets polymerisation genererer en kontraktil struktur kendt som Z-ring³. Denne ring fungerer som et stillads for andre divisionsproteiner, og sammen danner de et molekylært maskineri kaldet et divisom. Flere undersøgelser har vist, at Z-ringen er meget dynamisk, og at FtsZ-protofilamenter bevæger sig ved løbebånd ^4,5,6. For at studere Z-ringen i time-lapse-eksperimenter anbefales det at registrere divisionsstedet i XY-planet for bedre opløsning og hurtig prøveudtagning. For at opnå dette er det nødvendigt at udvikle vertikale celleimmobiliseringsmetoder, der almindeligvis omfatter nanofabrikation af mikrohulcellefælder og komplekse mikrofluidiske enheder⁷.

Cyanobakterier er fotosyntetiske mikroorganismer, der klassificeres som gram-negative ved deres cellulære morfologi. Imidlertid fylogenetisk er de tættere på gram-positive bakterier⁸. Disse organismer har celledelingsgener, der er almindelige inden for gram-positive og gram-negative bakterier, men deres divisome indeholder også unikke elementer⁹. Anabaena sp. PCC 7120 (herefter Anabaena sp.) er filamentøse cyanobakterier med et divisionsplan og er en model for studiet af celledeling i flercellede cyanobakterier. I denne stamme har det været muligt at bestemme placeringen af FtsZ i midten af cellerne¹⁰. Ikke desto mindre er der ingen undersøgelser, der viser in vivo-dynamikken i FtsZ i denne model. I vores laboratorium opnåede vi gennem triparental parring og homolog rekombination en totalt adskilt mutant af Anabaena sp., der udtrykker FtsZ-proteinet fusioneret med sfGFP, som erstattede det komplette endogene ftsZ-gen . Vi udviklede en hurtig og enkel celleimmobiliseringsmetode, der favoriserer den lodrette orientering af de mutante stammefilamenter til time-lapse-eksperimenter for at visualisere divisionsproteinerne i filamentøse cyanobakterier. Denne metode behøver ikke mikrofluidiske enheder, der kan være dyre og vanskelige at udvikle. Som et eksempel brugte vi denne protokol til at visualisere Z-ringen i FtsZ-sfGFP-mutanten ved konfokal mikroskopi.

Protocol

1. Overvejelser og valg af den cellulære model

BEMÆRK: Cyanobakterier har en stærk autofluorescens på grund af tilstedeværelsen af fotosyntetiske pigmenter. Dette signal er i den røde del af spektret, derfor er de fluorescerende proteiner, der er egnede til billeddannelse i cyanobakterier, dem, der langt fra den røde emission. For eksempel GFP, YFP, Venus, turkis og BFP.

1. Vælg en divisom komponent til stede i målet filamentøs cyanobakteriel stamme. Til forsøgene er det nødvendigt at konstruere en filamentøs cyanobakteriel mutant, der udtrykker den valgte divisomkomponent smeltet sammen med et fluorescerende protein. I denne protokol er en Anabaena sp. mutant, der udtrykker FstZ-sfGFP, som et eksempel. Denne stamme blev opnået ved triparental parring med E. coli¹¹.
2. Kontroller adskillelsesniveauet for den mutant, der skal bruges. I eksemplet blev adskillelsen bestemt ved PCR-amplifikation af målgenet. FtsZ-sfGFP-mutanten, der anvendes i denne protokol, er en fuldt adskilt stamme, der mangler vildtype ftsZ-genet.

2. Vækstbetingelser

1. Lav en frisk subkultur af mutanten ved hjælp af 10 ml kultur i stationær fase (dyrket i ca. 14 dage i konstant lys ved 25 ° C til Anabaena sp.) og tilsæt til 90 ml BG11-medium suppleret med antibiotika (Spectinomycin og Streptomycin 10 μl ml-1 til FtsZ-sfGFP-mutanten).
2. Dyrk den nye cellekultur i konstant lys og ved den optimale temperatur, indtil den når eksponentialfasen. FtsZ-sfGFP-mutanten af Anabaena sp. dyrkes ved 25 °C i 7 dage før prøveforberedelsen.

3. Prøveforberedelse i en agarosematrix

1. Tag 2 ml af den homogeniserede vækstkultur.
2. Der centrifugeres ved 2.500 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
3. I mellemtiden opvarmes 30 ml 3% agarose med lavt smeltepunkt i BG11 flydende medium i en 50 ml kolbe. Brug en mikrobølgeovn, der er indstillet til medium effektniveau, og kontroller opløsningen hver 15. s, indtil den er helt opløst. Sæt til side for at køle ned til 37 °C.
   BEMÆRK: Autoklave opløsningen af agarose for at undgå forurening.
4. Når centrifugeringen er færdig, kasseres 1,9 ml supernatant, og cellerne i det resterende rumfang opslæmmes igen ved pipettering mindst tre gange op og ned.
5. De resuspenderede celler blandes med 900 μL af 3% agaroseopløsningen ved pipettering op og ned mindst tre gange.
   BEMÆRK: Agaroseopløsningen skal være flydende, men ikke for varm for at undgå celleskader. Det næste trin skal udføres hurtigt, og før agaroseopløsningen danner en gel som konsistens =.
6. Opsug agarosematrixen forsigtigt i en 1 ml sprøjte. Det er vigtigt at undgå dannelse af bobler, mens prøven aspireres med sprøjten.
   BEMÆRK: Før dette trin skal du sørge for, at spidsen af sprøjten er skåret for at fjerne det smalle indgangshul.
7. Lad prøve-agaroseblandingen størkne ved at placere sprøjten vandret ved stuetemperatur i 2 timer.
8. Agarosematrixen fjernes forsigtigt med stemplet og anbringes på en ren og flad overflade.
9. Skær den størknede prøve i skiver i et tykkelsesområde på 0,5 - 1 mm, idet matrixens integritet opretholdes.
   BEMÆRK: For bedre resultater skal du skære agarosematrixen ved hjælp af en skalpel eller tynde barberblade.
10. Placer skiverne side om side på en dæksel. Antallet af diske på en coverslip afhænger af dens dimensioner.
    BEMÆRK: Til time-lapse-mikroskopi anbefales det at bruge et cellekammer lavet til mikroskopianalyse (f.eks. Attofluor- eller Chamlide-magnetiske kamre). Disse kamre gør det muligt at erhverve prøven og undgå dehydrering. I dette eksempel fremstilles prøverne på afrundede dæksedler (25 mm) ved hjælp af attofluorkammeret.
11. Tilsæt 2 ml smeltet 3% agaroseopløsning på prøven anbragt i kammeret for at forhindre dehydrering.
12. Vent, indtil agaroseopløsningen er fuldstændigt størknet for at danne en gel.

4. Optagelse af billeder

1. Standardiser parametrene for at visualisere det fluorescerende protein af interesse i den mutante stamme i et konfokalmikroskop. Sørg for, at mikroskopet kan detektere både autofluorescensen og den valgte fluorescerende markør.
2. Visualiser prøven i den lyse feltkonformation med maksimal forstørrelse, og søg i et lodret orienteret filament som vist i figur 1.
3. Find divisionsstedet af interesse med en indledende scanning ved hjælp af autofluorescenssignalet langs Z-planet.
4. Brug parametrene for fluorescerende proteinmarkør til at visualisere signalet fra proteinet af interesse på divisionsstedet.
5. Udfør time-lapse eksperimenter i henhold til den biologiske model og proteinet af interesse. For eksempel blev der i dette tilfælde udført time-lapse-eksperimenter på 10 s i 50 s for at registrere dynamikken i FtsZ langs Z-ringen i Anabaena sp. (figur 2).

Representative Results

Visualisering af Z-ringen i Anabaena sp. ved hjælp af den vertikale immobiliseringsmetode
For at studere dynamikken i Z-ringkomponenter i bakterier er det nødvendigt at erhverve billeder i lodret orienterede celler. I denne position er det muligt at visualisere Z-ringen og de vigtigste proteiner i divisomet for at overvåge proteindynamikken ved time-lapse-mikroskopi. Det klassiske prøvepræparat til bakterier virker ikke for filamentøse cyanobakterier. I tilfælde af Anabaena sp. er filamenterne orienteret i en position, der ikke tillader at visualisere Z-ringen. Derudover er det ikke muligt at holde filamenterne immobiliseret til korrekt visualisering af celledelingsproteiner i en enkelt celle over længere perioder. For at visualisere Z-ringene i FtsZ-sfGFP-mutanten i Anabaena sp udviklede og standardiserede vi derfor en protokol ved hjælp af LMP-agarose og vandret inkubation af prøven. Denne protokol gør det muligt at opnå en højere andel af vertikalt orienterede filamenter sammenlignet med tidligere anvendte procedurer (figur 1). Det var derfor muligt at optage Z-ringen i XY-planet i celler af den mutante stamme ved direkte kontakt med dæksedlen (figur 2A).

Z-ringdynamik i FtsZ-sfGFP Anabaena sp. mutant ved hjælp af den vertikale immobiliseringsmetode
Efter test af den vertikale immobiliseringsmetode i konventionel konfokal mikroskopi blev prøver af FtsZ-sfGFP Anabaena sp-mutant fremstillet ved hjælp af den samme protokol visualiseret ved Airyscan-mikroskopi. Med denne teknik observerede vi mindre fotoblegning i ringene, og derfor kan eksperimenterne udføres i længere perioder uden at miste fluorescenssignalet. Faktisk var vi i stand til at få billeder i perioder på ca. 16,5 minutter med erhvervelse af billeder hver 10. sek. med lav fotoblegning, hvilket gjorde det muligt for os at detektere variationer i fluorescensintensitet over tid i forskellige områder af Z-ringen (figur 2B).

Figur 1. Visualisering af Anabaena sp. filamenter ved hjælp af den vertikale immobiliseringsmetode. En prøve af Anabaena sp. blev inkuberet vandret i LMP agarose 3% i BG11 i en sprøjte. Prøven blev derefter skåret i skiver og til sidst anbragt i cellekammeret. Visualiseringen af cellerne blev udført ved hjælp af et omvendt mikroskop. A) Repræsentativ brightfieldmikroskopi af en prøve inkuberet i agarosematrixen uden udførelse af den vertikale immobiliseringsmetode. Dette billede viser, at de fleste filamenter er vandret orienterede. Skalabjælke = 20 μm. (B) Repræsentativ brightfieldmikroskopi, der viser en høj andel af lodret orienterede filamenter af Anabaena sp. efter anvendelse af den vertikale immobiliseringsmetode. Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2. Visualisering af Z-ringen i lodret orienterede filamenter af Anabaena sp. ved hjælp af den vertikale immobiliseringsmetode. For at vise Z-ringene i XY-planet blev cellerne i sfGFP-FtsZ-stammen inkuberet i LMP-agarose 3% ved 25 °C efter den vertikale immobiliseringsmetode (AI). Brightfieldmikroskopi viser et filament af mutanten i lodret position. Skalabjælke = 10 μm. (A.II) FtsZ-sfGFP-signalet i en Z-ring af glødetråden vist i (A.I ). Dette billede er den gennemsnitlige intensitet af 6 billeder taget hver 10 s i 1 min. Skalabjælke = 2 μm (B) FtsZ-sfGFP-signal fra Z-ringen registreret hver 10. s i 50 s i cellerne i FtsZ-sfGFP-mutanten orienteret lodret i BG11-agarosematrixen. Tid (sekunder) er angivet i øverste venstre hjørne af hvert billede. Det er muligt at observere Z-ringen og en klynge af FtsZ-sfGFP, der ændrer sin position over tid (hvide pile). Skalabjælke = 1 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Studiet af dynamikken i divisome proteiner er uden tvivl en udfordring. Især i filamentøse cyanobakterier er en af udfordringerne visualiseringen af Z-ringen i det vandrette plan, hvor cellerne skal være lodret orienterede. Den metode, vi beskrev her, gør det muligt for placeringen af Z-ringen i XY-planet at udføre de forskellige analyser. Dette er den første enkle metode til filamentøse cyanobakterier, der muliggør fuldstændig visualisering af Z-ringen.

Selvom denne protokol er enkel og hurtig, skal der udvises særlig forsigtighed under prøveforberedelsestrinnet i agarosematrixen, da agarose med lavt smeltepunkt skal have en passende temperatur til at være flydende nok til blanding med celleopløsningen. Samtidig kan agaroseopløsningen ikke være for varm, da den kan fremkalde celleskader. Et andet kritisk trin at overveje er skæring af skiverne, fordi hvis det ikke gøres omhyggeligt, kan matrixen kollapse og beskadige prøven.

Ved anvendelse af denne metode er andelen af filamenter i lodret position højere end med den klassiske protokol. Det er dog nødvendigt at skære så mange skiver som muligt for at sikre den statistiske analyse, dvs. flere filamenter i lodret position.

Sammenlignet med andre metoder, hvor enkeltcelleundersøgelser i mikrofluidiske systemer kan udføres, er vores metode lettere, hurtigere og billigere og kræver kun materialer og reagenser, der er let tilgængelige på ethvert laboratorium. På den anden side, selv om mikrofluidiske systemer anvendes i vid udstrækning i flercellede cyanobakterieundersøgelser, har de, så vidt vi ved, ikke løst problemet med cellepositionering i lodret position¹².

En begrænsning af teknikken er, at orienteringen ikke altid er perfekt. Dette skyldes, at vi har set vippede filamenter i agarosematrixen, men med den tidligere screening ved hjælp af autofluorescenssignal er det muligt at identificere denne artefakt. Vi kunne heller ikke visualisere en fuld divisionsbegivenhed, fordi denne protokol tillader visualisering af divisionsstedet så meget som 1 time, mens divisionstiden for Anabaena sp. er omkring 12 timer. Denne protokol kan dog være nyttig til at registrere en fuld divisionsbegivenhed i hurtigt voksende bakterier.

Selvom vores metode blev standardiseret til Anabaena sp., kan den anvendes på alle filamentøse cyanobakterier eller filamentøse organismer for at studere ikke kun FtsZ, men også andre proteiner forbundet med divisomet, da de vil være orienteret i samme XY-plan.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml syringe	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.
Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block	CORNING	THERM-1001	The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.
Low Melting Point agarose	Promega	V3841	Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.
LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan	Zeiss	-	The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.
Microcentrífuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument.
Nikon Timelapse Microscope	Nikon	-	The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours.
Thin razor blades Schick Super Chromium	Farmazon	SKU: 401146	The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix.