Summary
我们提出了一种简单易用的XY平面丝状蓝藻可视化方法。使用低熔点琼脂糖基质，允许以垂直方向获取参与分裂的蛋白质的图像。因此，该方法可以应用于任何丝状生物和不同种类的蛋白质。
Abstract
细菌细胞分裂的主要事件是分离过程，其中蛋白质FtsZ是关键元素。FtsZ在细胞中间聚合形成环状结构（Z环），作为其他分裂蛋白的支架。细菌模型 大肠杆菌 和 枯草芽孢杆菌 的超分辨率显微镜显示Z环是不连续的，而活细胞成像研究表明FtsZ通过一种称为跑步机的机制沿着环移动。为了研究FtsZ在 体内的动力学，需要在垂直位置放置特殊的细胞，以便在XY平面中对环的完整结构进行成像。在多细胞蓝藻（例如 Anabaena sp. PCC7120）中进行FtsZ成像的情况下，由于细胞的大小和细丝的长度，将细丝保持在垂直位置具有挑战性。在本文中，我们描述了一种方法，该方法允许使用低熔点琼脂糖和注射器垂直固定 Anabaena sp. PCC 7120细丝，以记录表达FtsZ-sfGFP融合蛋白的突变体中的Z环。该方法是一种使用共聚焦显微镜在分裂位点记录蛋白质动力学的快速且廉价的方法。
Introduction
细菌细胞分裂是母细胞产生两个子细胞的过程，在大多数情况下是通过称为二元裂变的机制。分离过程中最早的事件之一是FtsZ在细胞1中间的定位。这种蛋白质在结构上与微管蛋白2 同源，在大多数细菌中是保守且广泛分布的，其聚合产生称为 Z 环3 的收缩结构。这个环充当其他分裂蛋白的支架，它们一起形成一种称为分裂体的分子机制。多项研究表明，Z 环是高度动态的，FtsZ 原丝通过跑步 4,5,6 移动。为了在延时实验中研究Z环，建议在XY平面中记录分裂位点，以获得更好的分辨率和快速采样。为了实现这一目标，有必要开发垂直细胞固定方法，该方法通常包括微孔细胞陷阱和复杂微流体装置的纳米制造7。
蓝藻是光合微生物，根据其细胞形态被归类为革兰氏阴性菌。然而，在系统发育上，它们更接近革兰氏阳性细菌8。这些生物体具有在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中常见的细胞分裂基因，但它们的分裂体也含有独特的元素9。Anabaena sp. PCC 7120（以下简称Anabaena sp.）是一种具有一个分裂平面的丝状蓝藻，是研究多细胞蓝藻细胞分裂的模型。在该菌株中，已经能够确定FtsZ在细胞10中间的位置。然而，没有研究表明FtsZ在该模型中的体内动力学。在我们的实验室中，通过三亲交配和同源重组，我们获得了Anabaena sp.的完全分离突变体，该突变体表达与sfGFP融合的FtsZ蛋白，取代了完整的内源性ftsZ基因。我们开发了一种快速简单的细胞固定方法，该方法有利于突变菌丝的垂直方向，用于延时实验，以可视化丝状蓝藻中的分裂蛋白。这种方法不需要昂贵且难以开发的微流体装置。例如，我们使用该协议通过共聚焦显微镜可视化FtsZ-sfGFP突变体中的Z环。
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Protocol
1. 蜂窝模型的考虑和选择
注意：由于光合色素的存在，蓝藻具有强烈的自发荧光。该信号位于光谱的红色部分，因此，适合在蓝藻中成像的荧光蛋白是远离红色发射的荧光蛋白。例如，GFP，YFP，金星，绿松石和BFP。
- 选择存在于目标丝状蓝藻菌株中的分裂成分。对于实验，有必要构建一种丝状蓝藻突变体，该突变体表达与荧光蛋白融合的选定分裂体成分。在该协议中，以表达FstZ-sfGFP的 Anabaena sp.突变体为例。该菌株是通过与 大肠杆菌11的三亲交配获得的。
- 检查将使用的突变体的隔离水平。在该示例中，分离是通过靶基因的PCR扩增确定的。该协议中使用的FtsZ-sfGFP突变体是一种完全分离的菌株，缺乏野生型 ftsZ基因。
2. 生长条件
- 使用固定相中的 10 mL 培养物（在恒定光下生长约 14 天，在 25°C 下，对于 Anabaena sp），并加入补充有抗生素的 90 mL BG11 培养基（大观霉素和链霉素 10 μl ml-1 用于 FtsZ-sfGFP 突变体）。
- 在恒定的光照和最佳温度下生长新的细胞培养物，直到达到指数期。在样品制备之前，将 Anabaena sp.的FtsZ-sfGFP突变体在25°C下生长7天。
3. 琼脂糖基质中的样品制备
- 取 2 mL 匀浆生长培养物。
- 在室温下以2,500× g 离心10分钟。
- 同时，在 50 mL 烧瓶中，在 BG11 液体培养基中加热 30 mL 3% 低熔点琼脂糖。使用设置为中等功率水平的微波炉，每15秒检查一次溶液，直到完全溶解。放在一边冷却至37°C。
注意：高压灭菌琼脂糖溶液以避免污染。 - 离心完成后，弃去 1.9 mL 上清液，并通过上下移液至少三次将细胞重悬于剩余体积中。
- 通过上下移液至少三次，将重悬的细胞与 900 μL 的 3% 琼脂糖溶液混合。
注意：琼脂糖溶液必须是液体，但不能太热，以避免细胞损伤。下一步必须快速进行，并且在琼脂糖溶液形成凝胶状稠度=之前。 - 小心地吸出1mL注射器中的琼脂糖基质。重要的是避免在用注射器吸出样品时产生气泡。
注意：在此步骤之前，请确保切断注射器的尖端以消除狭窄的入口孔。 - 通过将注射器在室温下水平放置2小时，使样品琼脂糖混合物固化。
- 使用柱塞小心地取出琼脂糖基质，并将其放在干净平坦的表面上。
- 将固化的样品切成薄片，厚度范围为0.5 - 1 mm，保持基质的完整性。
注意：为获得更好的效果，请使用手术刀或薄剃须刀片切割琼脂糖基质。 - 将切片并排放在盖玻片上。盖玻片上的磁盘数量将取决于其尺寸。
注意：对于延时显微镜，建议使用用于显微镜分析的细胞室（例如，阿托氟或查姆利德磁室）。这些腔室允许采集样品，避免脱水。在本例中，使用阿拓荧光室在圆形盖玻片（25 mm）上制备样品。 - 在放置在腔室中的样品上加入 2 mL 融化的 3% 琼脂糖溶液以防止脱水。
- 等到琼脂糖溶液完全凝固形成凝胶。
4. 图像采集
- 标准化参数以在共聚焦显微镜中可视化突变菌株中感兴趣的荧光蛋白。确保显微镜可以检测到自发荧光和选定的荧光标记物。
- 以最大放大倍率在明场构象中可视化样品，并搜索垂直取向的灯丝，如图 1所示。
- 使用沿Z平面的自发荧光信号进行初始扫描，找到感兴趣的分裂位点。
- 使用荧光蛋白标记物的参数在分裂位点可视化感兴趣蛋白质的信号。
- 根据生物模型和感兴趣的蛋白质进行延时实验。例如，在这种情况下，在50秒内进行了10秒的延时实验，以记录FtsZ沿 Anabaena sp.中Z环的动力学（图2）。
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Representative Results
使用垂直固定法可视化 Anabaena sp.中的Z环
为了研究细菌中Z环成分的动力学，有必要在垂直定向的细胞中获取图像。在这个位置，可以通过延时显微镜可视化Z环和分裂体的主要蛋白质，以监测蛋白质动力学。细菌的经典样品制备不适用于丝状蓝藻。在 Anabaena sp.的情况下，细丝的方向不允许可视化Z环。此外，不可能长时间保持细丝固定以正确观察单个细胞中的细胞分裂蛋白。因此，为了可视化 Anabaena sp中FtsZ-sfGFP突变体的Z环，我们开发并使用LMP琼脂糖和样品的水平孵育来标准化方案。与以前使用的程序相比，该协议允许获得更高比例的垂直定向细丝（图1）。因此，可以在与盖玻片直接接触的突变菌株细胞中的XY平面中记录Z环（图2A）。
使用垂直固定方法的FtsZ-sfGFP Anabaena sp.突变体中的Z环动力学
在常规共聚焦显微镜中测试垂直固定方法后，通过Airyscan显微镜可视化使用相同方案制备的FtsZ-sfGFP Anabaena sp突变体的样品。使用这种技术，我们观察到环中的光漂白较少，因此，实验可以进行更长时间而不会丢失荧光信号。事实上，我们能够获得大约 16.5 分钟的图像，每 10 秒采集一次低光漂白的图像，这使我们能够检测 Z 环不同区域荧光强度随时间的变化（图 2B）。
图1.使用垂直固定方法可视化 Anabaena sp.细丝。 将 Anabaena sp.样品在注射器内的BG11中的LMP琼脂糖中水平孵育3%。然后将样品切成圆盘，最后放入细胞室中。使用倒置显微镜进行细胞的可视化。 （A） 在琼脂糖基质中孵育的样品的代表性明场显微镜，而不执行垂直固定方法。此图显示大多数细丝是水平定向的。比例尺 = 20 μm。 （B） 代表性明场显微镜显示使用垂直固定方法后 Anabaena sp.的垂直定向细丝比例很高。比例尺 = 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图2.使用垂直固定方法在 Anabaena sp.的垂直取向细丝中可视化Z环。 为了在XY平面上显示Z环，将sfGFP-FtsZ菌株的细胞按照垂直固定方法 （A.I） 在25°C的LMP琼脂糖中孵育3%。明场显微镜显示突变体的细丝处于垂直位置。比例尺=10μm。 （ A.II）（A.I） 所示的灯丝Z环中的FtsZ-sfGFP信号。该图像是每10秒拍摄6张图像的平均强度，持续1分钟。比例尺 = 2 μm （B） Z 环的 FtsZ-sfGFP 信号在 BG11-琼脂糖基质中垂直定向的 FtsZ-sfGFP 突变体的细胞中每 10 秒记录一次，持续 50 秒。时间（秒）显示在每个图像的左上角。可以观察到Z环和一簇FtsZ-sfGFP，它们的位置随时间变化（白色箭头）。比例尺 = 1 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
对分裂体蛋白质动力学的研究无疑是一个挑战。特别是在丝状蓝藻中，挑战之一是水平面Z环的可视化，细胞必须垂直定向。我们在这里描述的方法允许在XY平面中定位Z环以执行不同的分析。这是丝状蓝藻的第一种简单方法，可以完全可视化Z环。
尽管该方案简单快速，但在琼脂糖基质的样品制备步骤中必须特别小心，因为低熔点琼脂糖必须处于合适的温度，以使流体足以与细胞溶液混合。同时，琼脂糖溶液不能太热，因为它会引起细胞损伤。另一个需要考虑的关键步骤是切割圆盘，因为如果不小心，基质可能会塌陷并损坏样品。
使用这种方法，垂直位置的细丝比例高于经典协议。但是，有必要切割尽可能多的圆盘以确保统计分析，即垂直位置的几根细丝。
与其他可以在微流体系统中进行单细胞研究的方法相比，我们的方法更容易、更快、更便宜，只需要在任何实验室都可以轻松获得的材料和试剂。另一方面，尽管微流体系统被广泛用于多细胞蓝藻研究，但据我们所知，它们还没有解决细胞在垂直位置定位的问题12。
该技术的局限性是方向并不总是完美的。这是因为我们已经在琼脂糖基质中看到了倾斜的细丝，但是，通过先前使用自发荧光信号的筛选，可以识别这种伪影。此外，我们无法可视化完整的分裂事件，因为该协议允许分裂位点的可视化长达 1 小时，而 Anabaena sp. 的分裂时间约为 12 小时。然而，该协议有助于记录快速生长细菌的全分裂事件。
虽然我们的方法是标准化的 Anabaena sp.，但它可以应用于所有丝状蓝藻或丝状生物，不仅可以研究FtsZ，还可以研究与分裂体相关的其他蛋白质，因为它们将定向在相同的XY平面上。
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Disclosures
没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢国家博士奖学金（ANID 21211333; 21191389）的资助。格兰特·丰德西特1161232。
这项工作得到了de Advanced Microscopy Facility UMA UC的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | - | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | - | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | - | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
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