Summary
우리는 XY 평면에서 필라멘트 시아노박테리아 시각화를 위한 간단하고 접근 가능한 방법을 제시합니다. 저융점 아가로스 매트릭스가 사용되어 수직 방향에서 분열에 관여하는 단백질의 이미지를 획득할 수 있었습니다. 따라서 이 방법론은 모든 필라멘트 유기체와 다양한 종류의 단백질에 적용할 수 있습니다.
Abstract
박테리아 세포 분열의 주요 사건은 단백질 FtsZ가 핵심 요소인 중격 과정입니다. FtsZ는 중합되어 세포의 중간에 고리형 구조(Z-ring)를 형성하여 다른 분열 단백질의 스캐폴드 역할을 한다. 박테리아 모델 대장균(Escherichia coli) 과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis )의 초고해상도 현미경은 Z-링이 불연속적이라는 것을 보여주었고, 라이브 셀 이미징 연구는 FtsZ가 트레드밀링으로 알려진 메커니즘에 의해 링을 따라 움직이는 것으로 나타났습니다. 생체 내에서 FtsZ의 역학을 연구하기 위해서는 XY 평면에서 링의 전체 구조를 이미징하기 위해 수직 위치에 특수 셀 배치가 필요합니다. Anabaena sp. PCC7120와 같은 다세포 시아노박테리아에서 FtsZ 이미징의 경우 세포의 크기와 필라멘트의 길이 때문에 필라멘트를 수직 위치로 유지하는 것이 어렵습니다. 이 기사에서는 Anabaena sp. PCC 7120 필라멘트는 저융점 아가로스와 주사기를 사용하여 FtsZ-sfGFP 융합 단백질을 발현하는 돌연변이에서 Z-링을 기록합니다. 이 방법은 컨포칼 현미경을 사용하여 분열 부위에서 단백질 역학을 빠르고 저렴하게 기록할 수 있는 방법입니다.
Introduction
박테리아 세포 분열은 모세포가 두 개의 딸 세포를 생성하는 과정으로, 대부분의 경우 이분법으로 알려진 메커니즘에 의해 생성됩니다. 중격 과정에서 가장 초기의 사건 중 하나는 셀1의 중간에 FtsZ의 국소화입니다. 튜불린2와 구조적으로 상동성인 이 단백질은 보존되어 대부분의 박테리아에 널리 분포되어 있으며, 중합은 Z-링3으로 알려진 수축 구조를 생성합니다. 이 고리는 다른 분열 단백질의 스캐폴드 역할을 하며 함께 점쟁이라고 하는 분자 기계를 형성합니다. 여러 연구에 따르면 Z-링은 매우 역동적이며 FtsZ 프로토필라멘트는 트레드밀링 4,5,6에 의해 움직입니다. 타임랩스 실험에서 Z-링을 연구하려면 더 나은 해상도와 빠른 샘플링을 위해 XY 평면에 분할 부위를 기록하는 것이 좋습니다. 이를 달성하기 위해서는 일반적으로 마이크로홀 세포 트랩 및 복잡한 미세유체 장치의 나노 제조를 포함하는 수직 세포 고정화 방법을 개발할 필요가 있습니다(7).
시아노박테리아는 세포 형태에 따라 그람 음성으로 분류되는 광합성 미생물입니다. 그러나 계통발생학적으로 그들은 그람 양성균에 더 가깝다8. 이 유기체는 그람 양성균과 그람 음성균 내에서 흔히 볼 수 있는 세포 분열 유전자를 가지고 있지만, 그 점에는 독특한 원소도 포함되어 있다9. Anabaena sp. PCC 7120(이하 Anabaena sp.)은 하나의 분열면을 가진 필라멘트 시아노박테리아로 다세포 시아노박테리아의 세포 분열 연구를 위한 모델입니다. 이러한 변형에서, 셀(10)의 중간에서 FtsZ의 위치를 결정하는 것이 가능하였다. 그럼에도 불구하고 이 모델에서 FtsZ의 생체 내 역학을 보여주는 연구는 없습니다. 우리 실험실에서는 삼부모 짝짓기와 상동 재조합을 통해 완전히 분리된 Anabaena sp. 완전한 내인성 ftsZ 유전자를 대체한 sfGFP에 융합된 FtsZ 단백질을 발현합니다. 우리는 필라멘트 시아노박테리아의 분열 단백질을 시각화하기 위한 타임랩스 실험을 위해 돌연변이 균주 필라멘트의 수직 방향을 선호하는 빠르고 간단한 세포 고정화 방법을 개발했습니다. 이 방법은 비싸고 개발하기 어려울 수 있는 미세유체 장치가 필요하지 않습니다. 예를 들어, 이 프로토콜을 사용하여 공초점 현미경으로 FtsZ-sfGFP 돌연변이의 Z-링을 시각화했습니다.
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Protocol
1. 세포 모델의 고려 사항 및 선택
참고: 시아노박테리아는 광합성 색소의 존재로 인해 강력한 자가형광을 가지고 있습니다. 이 신호는 스펙트럼의 빨간색 부분에 있으므로 시아노박테리아의 이미징에 적합한 형광 단백질은 적색 방출과는 거리가 먼 단백질입니다. 예를 들어 GFP, YFP, 금성, 청록색 및 BFP가 있습니다.
- 표적 사상 시아노박테리아 균주에 존재하는 점술 성분을 선택합니다. 실험을 위해서는 형광 단백질에 융합된 선택된 점쟁이 성분을 발현하는 필라멘트 시아노박테리아 돌연변이체를 구성할 필요가 있습니다. 이 프로토콜에서, Anabaena sp. FstZ-sfGFP를 발현하는 돌연변이를 예로 들 수 있다. 이 균주는 E. coli11과의 삼부모 교배에 의해 얻어졌습니다.
- 사용할 돌연변이의 분리 수준을 확인하십시오. 실시예에서, 분리는 표적 유전자의 PCR 증폭에 의해 결정되었다. 이 프로토콜에 사용된 FtsZ-sfGFP 돌연변이체는 야생형 ftsZ 유전자가 결여된 완전히 분리된 균주입니다.
2. 성장 조건
- 고정상( Anabaena sp.의 경우 25°C에서 일정한 빛에서 약 14일 동안 성장)에서 10mL 배양물을 사용하고 항생제가 보충된 BG11 배지 90mL(FtsZ-sfGFP 돌연변이의 경우 Spectinomycin 및 Streptomycin 10μl ml-1 )를 추가하여 돌연변이의 신선한 계대 배양을 만듭니다.
- 지수 단계에 도달할 때까지 일정한 빛과 최적의 온도에서 새로운 세포 배양을 성장시킵니다. Anabaena sp.의 FtsZ-sfGFP 돌연변이체는 시료 전처리 전에 25°C에서 7일 동안 성장시킨다.
3. 아가로스 매트릭스에서의 샘플 준비
- 균질화 된 성장 배양 물 2 mL를 취한다.
- 실온에서 2,500 x g 로 10분 동안 원심분리합니다.
- 한편, 50 mL 플라스크에서, BG11 액체 배지 중의 3% 저융점 아가로스의 30 mL를 가열하였다. 중간 전력 수준으로 설정된 전자레인지를 사용하고 완전히 녹을 때까지 15초마다 용액을 확인하십시오. 37°C로 식히기 위해 따로 보관하십시오.
참고: 오염을 피하기 위해 아가로오스 용액을 오토클레이브합니다. - 원심분리가 완료되면 상층액 1.9mL를 버리고 위아래로 최소 3회 피펫팅하여 남은 부피의 세포를 다시 현탁합니다.
- 재현탁된 세포를 900 μL의 3% 아가로스 용액과 혼합하여 위아래로 3회 이상 피펫팅한다.
참고: 아가로스 용액은 액체여야 하지만 세포 손상을 방지하기 위해 너무 뜨겁지 않아야 합니다. 다음 단계는 아가로스 용액이 겔을 형성하기 전에 신속하게 수행되어야한다 = . - 1mL 주사기에서 아가로스 매트릭스를 조심스럽게 흡인합니다. 샘플이 주사기로 흡입되는 동안 기포가 발생하지 않도록 하는 것이 중요합니다.
알림: 이 단계를 수행하기 전에 주사기 끝이 절단되어 좁은 입구 구멍을 제거했는지 확인하십시오. - 샘플-아가로스 혼합물을 실온에서 2시간 동안 수평 위치에 주사기를 놓음으로써 고형화시킨다.
- 플런저를 사용하여 아가로스 매트릭스를 조심스럽게 제거하고 깨끗하고 평평한 표면에 놓습니다.
- 응고된 샘플을 0.5 - 1 mm의 두께 범위에서 조각으로 절단하여 매트릭스의 무결성을 유지합니다.
알림: 더 나은 결과를 얻으려면 메스나 얇은 면도날을 사용하여 아가로스 매트릭스를 자릅니다. - 슬라이스를 커버슬립에 나란히 놓습니다. 커버슬립의 디스크 수는 치수에 따라 다릅니다.
참고: 타임랩스 현미경의 경우 현미경 분석용으로 만들어진 세포 챔버(예: Attofluor 또는 Chamlide 자기 챔버)를 사용하는 것이 좋습니다. 이 챔버는 탈수를 피하면서 샘플을 획득 할 수 있습니다. 이 예에서 샘플은 Attofluor 챔버를 사용하여 둥근 커버슬립(25mm)에서 준비됩니다. - 탈수를 방지하기 위해 챔버에 놓인 샘플에 녹인 3% 아가로스 용액 2mL를 추가합니다.
- 아가로스 용액이 완전히 고형화되어 겔을 형성 할 때까지 기다리십시오.
4. 이미지 획득
- 파라미터를 표준화하여 컨포칼 현미경에서 돌연변이 균주에서 관심 있는 형광 단백질을 시각화합니다. 현미경이 자가형광과 선택한 형광 마커를 모두 감지할 수 있는지 확인하십시오.
- 최대 배율로 명시야 형태의 샘플을 시각화하고 그림 1과 같이 수직 방향의 필라멘트를 검색합니다.
- Z 평면을 따라 자가형광 신호를 사용하여 초기 스캔으로 관심 분할 부위를 찾습니다.
- 형광 단백질 마커의 파라미터를 사용하여 분열 부위에서 관심 단백질의 신호를 시각화합니다.
- 생물학적 모델과 관심 단백질에 따라 타임랩스 실험을 수행합니다. 예를 들어, 이 경우 Anabaena sp.의 Z-링을 따라 FtsZ의 역학을 기록하기 위해 50초 동안 10초의 타임랩스 실험을 수행했습니다(그림 2).
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Representative Results
수직 고정화 방법을 사용한 Anabaena sp.의 Z-링 시각화
박테리아에서 Z-링 구성 요소의 역학을 연구하려면 수직 방향 세포에서 이미지를 획득해야 합니다. 이 위치에서 Z-링과 디비솜의 주요 단백질을 시각화하여 타임랩스 현미경으로 단백질 역학을 모니터링할 수 있습니다. 박테리아에 대한 고전적인 샘플 준비는 필라멘트 시아노박테리아에 대해 작동하지 않습니다. Anabaena sp.의 경우 필라멘트는 Z-링을 시각화할 수 없는 위치에 배향됩니다. 또한, 장기간에 걸쳐 단일 세포에서 세포 분열 단백질의 정확한 시각화를 위해 필라멘트를 고정된 상태로 유지하는 것은 불가능합니다. 따라서 Anabaena sp에서 FtsZ-sfGFP 돌연변이의 Z-링을 시각화하기 위해 LMP 아가로스와 샘플의 수평 배양을 사용하여 프로토콜을 개발하고 표준화했습니다. 이 프로토콜을 사용하면 이전에 사용된 절차에 비해 더 높은 비율의 수직 방향 필라멘트를 얻을 수 있습니다(그림 1). 따라서 커버슬립과 직접 접촉한 돌연변이 균주의 세포에서 XY 평면의 Z-링을 기록할 수 있었습니다(그림 2A).
FtsZ-sfGFP Anabaena sp. 수직 고정화 방법을 사용한 돌연변이
기존의 공초점 현미경에서 수직 고정화 방법을 테스트한 후 동일한 프로토콜을 사용하여 제조된 FtsZ-sfGFP Anabaena sp 돌연변이의 샘플을 Airyscan 현미경으로 시각화했습니다. 이 기술을 통해 고리에서 광표백이 덜 관찰되었으므로 형광 신호를 잃지 않고 실험을 더 오랜 기간 동안 수행할 수 있습니다. 실제로 약 16.5분 동안 이미지를 얻을 수 있었고, 낮은 광표백으로 10초마다 이미지를 획득하여 Z-링의 여러 영역에서 시간 경과에 따른 형광 강도의 변화를 감지할 수 있었습니다(그림 2B).
그림 1. 수직 고정화 방법을 사용한 Anabaena sp. 필라멘트의 시각화. Anabaena sp.의 샘플을 주사기 내의 BG11 중 3% LMP 아가로오스에서 수평 배양하였다. 그런 다음 샘플을 디스크로 절단하고 최종적으로 세포 챔버에 넣었습니다. 세포의 시각화는 도립 현미경을 사용하여 수행되었습니다. (a) 수직 고정화 방법을 수행하지 않고 아가로스 매트릭스에서 배양한 샘플의 대표적인 명시야 현미경. 이 이미지는 대부분의 필라멘트가 수평 방향임을 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm. (B) 수직 고정화 방법을 사용한 후 Anabaena sp.의 수직 배향 필라멘트의 높은 비율을 보여주는 대표적인 명시야 현미경. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 수직 고정화 방법을 사용한 Anabaena sp.의 수직 방향 필라멘트에서 Z-링의 시각화. X-Y 평면에서 Z-링을 표시하기 위해, 수직 고정화 방법 (A.I) 에 따라 sfGFP-FtsZ 균주의 세포를 25°C에서 3% LMP 아가로스에서 배양하였다. 명시야 현미경은 수직 위치에 있는 돌연변이의 필라멘트를 보여줍니다. 스케일 바 = 10 μm. ( A.II) (A.I) 에 표시된 필라멘트의 Z-링에 있는 FtsZ-sfGFP 신호. 이 이미지는 1분 동안 10초마다 촬영한 6개 이미지의 평균 강도입니다. 스케일 바 = 2 μm (B) Z-링의 FtsZ-sfGFP 신호는 BG11-아가로스 매트릭스에서 수직으로 배향된 FtsZ-sfGFP 돌연변이체의 세포에서 50초 동안 10초마다 기록되었다. 시간(초)은 각 이미지의 왼쪽 상단 모서리에 표시됩니다. Z-링과 시간이 지남에 따라 위치가 변하는 FtsZ-sfGFP 클러스터(흰색 화살표)를 관찰할 수 있습니다. 스케일 바 = 1 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
나뭇잎 단백질의 역학에 대한 연구는 의심할 여지 없이 도전 과제입니다. 특히, 필라멘트 시아노박테리아에서 과제 중 하나는 세포가 수직 방향이어야 하는 수평면에서 Z-링을 시각화하는 것입니다. 여기에서 설명한 방법을 사용하면 XY 평면에서 Z-링을 배치하여 다양한 분석을 수행할 수 있습니다. 이것은 Z-링의 완전한 시각화를 가능하게 하는 사상 시아노박테리아에 대한 최초의 간단한 방법입니다.
이 프로토콜은 간단하고 빠르지만, 저융점 아가로스는 세포 용액과 혼합하기에 충분히 유동적이어야 하기 때문에 아가로스 매트릭스에서 샘플 준비 단계 동안 특별한 주의를 기울여야 합니다. 동시에, 아가로스 용액은 세포 손상을 유발할 수 있기 때문에 너무 따뜻할 수 없습니다. 고려해야 할 또 다른 중요한 단계는 조심스럽게 수행하지 않으면 매트릭스가 붕괴되어 샘플이 손상될 수 있기 때문에 디스크 절단입니다.
이 방법을 사용하면 수직 위치의 필라멘트 비율이 기존 프로토콜보다 높습니다. 그러나, 통계 분석, 즉 수직 위치에 있는 여러 필라멘트를 보장하기 위해 가능한 한 많은 디스크를 절단할 필요가 있다.
미세유체 시스템에서 단일 세포 연구를 수행할 수 있는 다른 방법과 비교할 때, 우리의 방법은 더 쉽고, 빠르고, 저렴하며, 모든 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 재료와 시약만 있으면 됩니다. 반면에, 미세유체 시스템이 다세포 시아노박테리아 연구에서 널리 사용되고 있지만, 우리가 아는 한, 그것들은 수직 위치에서의 세포 위치 문제를 해결하지 못했다12.
이 기술의 한계는 방향이 항상 완벽하지는 않다는 것입니다. 이것은 우리가 아가로스 매트릭스에서 기울어진 필라멘트를 보았기 때문이지만, 자가형광 신호를 사용한 이전 스크리닝을 통해 이 아티팩트를 식별할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 분할 부위를 최대 1시간까지 시각화할 수 있는 반면 Anabaena sp.의 분할 시간은 약 12시간이기 때문에 전체 분할 이벤트를 시각화할 수 없었습니다. 그러나 이 프로토콜은 빠르게 성장하는 박테리아에서 전체 분열 이벤트를 기록하는 데 도움이 될 수 있습니다.
우리의 방법은 Anabaena sp.에 대해 표준화되었지만 모든 필라멘트 시아노박테리아 또는 필라멘트 유기체에 적용할 수 있으며, FtsZ뿐만 아니라 동일한 XY 평면에서 배향되기 때문에 점과 관련된 다른 단백질도 연구할 수 있습니다.
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Disclosures
이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
자금 조달을 위해 국립 박사 장학금 (ANID 21211333; 21191389)에 감사드립니다. 그랜트 폰데시트 1161232.
이 작업은 고급 현미경 시설 UMA UC의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | - | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | - | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | - | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
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