Summary
Nous présentons une méthode simple et accessible pour la visualisation filamenteuse des cyanobactéries dans le plan XY. Une matrice d’agarose à bas point de fusion a été utilisée, permettant l’acquisition d’images des protéines impliquées dans la division, dans une orientation verticale. Par conséquent, cette méthodologie peut être appliquée à n’importe quel organisme filamenteux et à différents types de protéines.
Abstract
Un événement principal dans la division cellulaire bactérienne est le processus de septation, où la protéine FtsZ est l’élément clé. FtsZ polymérise en formant une structure en forme d’anneau (anneau Z) au milieu de la cellule qui sert d’échafaudage pour d’autres protéines de division. La microscopie à super-résolution dans les modèles bactériens Escherichia coli et Bacillus subtilis a montré que l’anneau Z est discontinu, tandis que les études d’imagerie sur cellules vivantes ont démontré que FtsZ se déplace le long de l’anneau par un mécanisme connu sous le nom de tapis roulant. Pour étudier la dynamique de FtsZ in vivo, un placement spécial de la cellule en position verticale est nécessaire pour imager la structure complète de l’anneau dans le plan XY. Dans le cas de l’imagerie FtsZ chez les cyanobactéries multicellulaires, telles que Anabaena sp. PCC7120, le maintien des filaments en position verticale est difficile en raison de la taille des cellules et de la longueur des filaments. Dans cet article, nous décrivons une méthode qui permet l’immobilisation verticale des filaments Anabaena sp. PCC 7120 à l’aide d’agarose à bas point de fusion et de seringues, pour enregistrer l’anneau Z dans un mutant qui exprime une protéine de fusion FtsZ-sfGFP. Cette méthode est un moyen rapide et peu coûteux d’enregistrer la dynamique des protéines au site de division en utilisant la microscopie confocale.
Introduction
La division cellulaire bactérienne est le processus par lequel une cellule mère génère deux cellules filles, dans la plupart des cas par le mécanisme connu sous le nom de fission binaire. L’un des premiers événements dans le processus de septation est la localisation de FtsZ au milieu de la cellule1. Cette protéine, structurellement homologue à la tubuline2, est conservée et largement distribuée dans la plupart des bactéries, et sa polymérisation génère une structure contractile connue sous le nom d’anneau Z3. Cet anneau sert d’échafaudage pour d’autres protéines de division et ensemble, elles forment une machinerie moléculaire appelée divisome. Plusieurs études ont montré que l’anneau Z est très dynamique et que les protofilaments FtsZ se déplacent en roulant 4,5,6. Pour étudier l’anneau Z dans des expériences time-lapse, il est conseillé d’enregistrer le site de division dans le plan XY pour une meilleure résolution et un échantillonnage rapide. Pour ce faire, il est nécessaire de développer des méthodes d’immobilisation cellulaire verticale qui incluent généralement la nanofabrication de pièges cellulaires à microtrous et de dispositifs microfluidiques complexes7.
Les cyanobactéries sont des micro-organismes photosynthétiques classés à Gram négatif par leur morphologie cellulaire. Cependant, phylogénétiquement ils sont plus proches des bactéries gram-positives8. Ces organismes ont des gènes de division cellulaire qui sont communs chez les bactéries gram-positives et gram-négatives, mais leur divisome contient également des éléments uniques9. Anabaena sp. PCC 7120 (ci-après Anabaena sp.) est une cyanobactérie filamenteuse à un plan de division et est un modèle pour l’étude de la division cellulaire chez les cyanobactéries multicellulaires. Dans cette souche, il a été possible de déterminer le positionnement de FtsZ au milieu des cellules10. Néanmoins, il n’y a pas d’études montrant la dynamique in vivo de FtsZ dans ce modèle. Dans notre laboratoire, grâce à l’accouplement triparental et à la recombinaison homologue, nous avons obtenu un mutant totalement séparé d’Anabaena sp. qui exprime la protéine FtsZ fusionnée au sfGFP, qui a remplacé le gène ftsZ endogène complet. Nous avons développé une méthode d’immobilisation cellulaire rapide et simple qui favorise l’orientation verticale des filaments de souche mutants pour des expériences en accéléré afin de visualiser les protéines de division dans les cyanobactéries filamenteuses. Cette méthode ne nécessite pas de dispositifs microfluidiques qui peuvent être coûteux et difficiles à développer. À titre d’exemple, nous avons utilisé ce protocole pour visualiser l’anneau Z dans le mutant FtsZ-sfGFP par microscopie confocale.
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Protocol
1. Considérations et choix du modèle cellulaire
REMARQUE: Les cyanobactéries ont une forte autofluorescence due à la présence de pigments photosynthétiques. Ce signal est dans la partie rouge du spectre, par conséquent, les protéines fluorescentes adaptées à l’imagerie dans les cyanobactéries sont celles qui sont loin de l’émission rouge. Par exemple, GFP, YFP, Vénus, Turquoise et BFP.
- Sélectionnez un composant divisome présent dans la souche de cyanobactérie filamenteuse cible. Pour les expériences, il est nécessaire de construire un mutant cyanobactérien filamenteux qui exprime le composant divisome sélectionné fusionné à une protéine fluorescente. Dans ce protocole, un mutant Anabaena sp. qui exprime FstZ-sfGFP, à titre d’exemple. Cette souche a été obtenue par accouplement triparental avec E. coli11.
- Vérifiez le niveau de ségrégation du mutant qui sera utilisé. Dans l’exemple, la ségrégation a été déterminée par amplification par PCR du gène cible. Le mutant FtsZ-sfGFP utilisé dans ce protocole est une souche entièrement séparée dépourvue du gène ftsZ de type sauvage.
2. Conditions de croissance
- Faire une nouvelle sous-culture du mutant en utilisant une culture de 10 mL en phase stationnaire (cultivée pendant environ 14 jours en lumière constante, à 25°C, pour Anabaena sp.) et en ajoutant à 90 mL de milieu BG11 complété par des antibiotiques (Spectinomycine et Streptomycine 10 μl ml-1 pour le mutant FtsZ-sfGFP).
- Cultivez la nouvelle culture cellulaire en lumière constante et à la température optimale jusqu’à atteindre la phase exponentielle. Le mutant FtsZ-sfGFP d’Anabaena sp. est cultivé à 25 °C pendant 7 jours avant la préparation de l’échantillon.
3. Préparation de l’échantillon dans une matrice d’agarose
- Prendre 2 mL de la culture de croissance homogénéisée.
- Centrifuger à 2 500 x g pendant 10 min à température ambiante.
- Entre-temps, dans une fiole de 50 mL, chauffer 30 mL de point de fusion bas à 3 % agarose dans un milieu liquide BG11. Utilisez un four à micro-ondes réglé à puissance moyenne et vérifiez la solution toutes les 15 s jusqu’à dissolution complète. Laisser refroidir à 37 °C.
NOTE: Autoclaver la solution d’agarose pour éviter la contamination. - Une fois la centrifugation terminée, jeter 1,9 mL du surnageant et remettre en suspension les cellules dans le volume restant en pipetant au moins trois fois de haut en bas.
- Mélanger les cellules remises en suspension avec 900 μL de solution d’agarose à 3 % en pipitant de haut en bas au moins trois fois.
REMARQUE: La solution d’agarose doit être liquide mais pas trop chaude pour éviter d’endommager les cellules. L’étape suivante doit être effectuée rapidement et avant que la solution d’agarose ne forme un gel comme consistance =. - Aspirez soigneusement la matrice d’agarose dans une seringue de 1 mL. Il est important d’éviter la génération de bulles pendant que l’échantillon est aspiré avec la seringue.
REMARQUE: Avant cette étape, assurez-vous que l’embout de la seringue est coupé pour éliminer le trou d’entrée étroit. - Laisser le mélange échantillon-agarose se solidifier en plaçant la seringue en position horizontale à température ambiante pendant 2 h.
- Retirez soigneusement la matrice d’agarose à l’aide du piston et placez-la sur une surface propre et plane.
- Couper l’échantillon solidifié en tranches, dans une gamme d’épaisseur de 0,5 à 1 mm, en maintenant l’intégrité de la matrice.
REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, coupez la matrice d’agarose à l’aide d’un scalpel ou de fines lames de rasoir. - Placez les tranches côte à côte sur une lamelle de couverture. Le nombre de disques sur une feuille de couverture dépend de ses dimensions.
REMARQUE: Pour la microscopie accélérée, il est recommandé d’utiliser une chambre cellulaire conçue pour l’analyse microscopique (par exemple, chambres magnétiques Attofluor ou Chamlide). Ces chambres permettent l’acquisition de l’échantillon en évitant la déshydratation. Dans cet exemple, les échantillons sont préparés sur des lamelles arrondies (25 mm) à l’aide de la chambre Attofluor. - Ajouter 2 mL de solution d’agarose fondue à 3 % sur l’échantillon placé dans la chambre pour prévenir la déshydratation.
- Attendez que la solution d’agarose soit complètement solidifiée pour former un gel.
4. Acquisition d’images
- Normaliser les paramètres pour visualiser la protéine fluorescente d’intérêt dans la souche mutante au microscope confocal. Assurez-vous que le microscope peut détecter à la fois l’autofluorescence et le marqueur fluorescent sélectionné.
- Visualisez l’échantillon dans la conformation en champ clair avec un grossissement maximal et recherchez un filament orienté verticalement comme illustré à la figure 1.
- Trouvez le site de division d’intérêt avec un balayage initial en utilisant le signal d’autofluorescence le long du plan Z.
- Utilisez les paramètres du marqueur protéique fluorescent pour visualiser le signal de la protéine d’intérêt au site de division.
- Réaliser des expériences time-lapse selon le modèle biologique et la protéine d’intérêt. Par exemple, dans ce cas, des expériences en accéléré de 10 s en 50 s ont été réalisées pour enregistrer la dynamique de FtsZ le long de l’anneau Z chez Anabaena sp. (Figure 2).
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Representative Results
Visualisation de l’anneau Z chez Anabaena sp. par la méthode d’immobilisation verticale
Pour étudier la dynamique des composants de l’anneau Z chez les bactéries, il est nécessaire d’acquérir des images dans des cellules orientées verticalement. Dans cette position, il est possible de visualiser l’anneau Z et les principales protéines du divisome pour surveiller la dynamique des protéines par microscopie time-lapse. La préparation classique d’échantillons pour les bactéries ne fonctionne pas pour les cyanobactéries filamenteuses. Dans le cas d’Anabaena sp., les filaments sont orientés dans une position qui ne permet pas de visualiser l’anneau Z. De plus, il n’est pas possible de maintenir les filaments immobilisés pour une visualisation correcte des protéines de division cellulaire dans une seule cellule sur de longues périodes de temps. Par conséquent, afin de visualiser les anneaux Z du mutant FtsZ-sfGFP dans Anabaena sp, nous avons développé et normalisé un protocole utilisant l’agarose LMP et l’incubation horizontale de l’échantillon. Ce protocole permet d’obtenir une proportion plus élevée de filaments orientés verticalement, par rapport aux procédures précédemment utilisées (Figure 1). Par conséquent, il a été possible d’enregistrer l’anneau Z dans le plan XY dans les cellules de la souche mutante en contact direct avec la lamelle de couverture (Figure 2A).
Dynamique des anneaux Z dans le mutant FtsZ-sfGFP Anabaena sp. en utilisant la méthode d’immobilisation verticale
Après avoir testé la méthode d’immobilisation verticale en microscopie confocale conventionnelle, des échantillons du mutant FtsZ-sfGFP Anabaena sp préparés selon le même protocole ont été visualisés par microscopie Airyscan. Avec cette technique, nous avons observé moins de photoblanchiment dans les anneaux et, par conséquent, les expériences peuvent être effectuées pendant de plus longues périodes sans perdre le signal de fluorescence. En fait, nous avons pu obtenir des images pour des périodes d’environ 16,5 min, avec l’acquisition d’images toutes les 10 s avec un faible photoblanchiment, ce qui nous a permis de détecter des variations d’intensité de fluorescence au fil du temps dans différentes régions de l’anneau Z (Figure 2B).
Graphique 1. Visualisation des filaments d’Anabaena sp. par la méthode d’immobilisation verticale. Un échantillon d’Anabaena sp. a été incubé horizontalement dans de l’agarose LMP à 3% dans BG11 dans une seringue. L’échantillon a ensuite été découpé en disques et finalement placé dans la chambre cellulaire. La visualisation des cellules a été réalisée à l’aide d’un microscope inversé. (A) Microscopie représentative en fond clair d’un échantillon incubé dans la matrice d’agarose sans effectuer la méthode d’immobilisation verticale. Cette image montre que la plupart des filaments sont orientés horizontalement. Barre d’échelle = 20 μm. (B) Microscopie représentative en fond clair montrant une forte proportion de filaments orientés verticalement d’Anabaena sp. après utilisation de la méthode d’immobilisation verticale. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Visualisation de l’anneau Z dans des filaments orientés verticalement d’Anabaena sp. par la méthode d’immobilisation verticale. Pour afficher les anneaux Z dans le plan XY, les cellules de la souche sfGFP-FtsZ ont été incubées dans de l’agarose LMP à 3% à 25 °C suivant la méthode d’immobilisation verticale (I.A). La microscopie à fond clair montre un filament du mutant en position verticale. Barre d’échelle = 10 μm. (A.II) Le signal FtsZ-sfGFP dans un anneau Z du filament représenté en (I.A ). Cette image est l’intensité moyenne de 6 images prises toutes les 10 s pendant 1 min. Barre d’échelle = 2 μm (B) de signal FtsZ-sfGFP de l’anneau Z enregistré toutes les 10 s pendant 50 s dans les cellules du mutant FtsZ-sfGFP orientées verticalement dans la matrice d’agarose BG11. Le temps (secondes) est indiqué dans le coin supérieur gauche de chaque image. Il est possible d’observer l’anneau Z et un amas de FtsZ-sfGFP qui change de position au fil du temps (flèches blanches). Barre d’échelle = 1 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’étude de la dynamique des protéines divisomiques est sans aucun doute un défi. En particulier, chez les cyanobactéries filamenteuses, l’un des défis est la visualisation de l’anneau Z dans le plan horizontal, pour lequel les cellules doivent être orientées verticalement. La méthode que nous avons décrite ici permet le positionnement de l’anneau Z dans le plan XY pour effectuer les différentes analyses. C’est la première méthode simple pour les cyanobactéries filamenteuses qui permet la visualisation complète de l’anneau Z.
Bien que ce protocole soit simple et rapide, des précautions particulières doivent être prises lors de l’étape de préparation de l’échantillon dans la matrice d’agarose, car l’agarose à bas point de fusion doit être à une température appropriée pour être suffisamment fluide pour être mélangée à la solution cellulaire. Dans le même temps, la solution d’agarose ne peut pas être trop chaude car elle pourrait provoquer des dommages cellulaires. Une autre étape critique à considérer est la découpe des disques car si elle n’est pas faite avec soin, la matrice peut s’effondrer et endommager l’échantillon.
En utilisant cette méthode, la proportion de filaments en position verticale est plus élevée qu’avec le protocole classique. Cependant, il est nécessaire de couper autant de disques que possible pour assurer l’analyse statistique, c’est-à-dire plusieurs filaments en position verticale.
Par rapport à d’autres méthodes, où des études unicellulaires dans des systèmes microfluidiques peuvent être effectuées, notre méthode est plus facile, plus rapide et moins chère, ne nécessitant que des matériaux et des réactifs facilement disponibles dans n’importe quel laboratoire. D’autre part, bien que les systèmes microfluidiques soient largement utilisés dans les études multicellulaires sur les cyanobactéries, à notre connaissance ils n’ont pas résolu le problème du positionnement cellulaire en position verticale12.
Une limite de la technique est que l’orientation n’est pas toujours parfaite. C’est parce que nous avons vu des filaments inclinés dans la matrice d’agarose, cependant, avec le criblage précédent utilisant le signal d’autofluorescence, il est possible d’identifier cet artefact. De plus, nous n’avons pas pu visualiser un événement de division complet, car ce protocole permet la visualisation du site de division jusqu’à 1 heure, alors que le temps de division d’Anabaena sp. est d’environ 12 heures. Cependant, ce protocole peut être utile pour enregistrer un événement de division complet dans les bactéries à croissance rapide.
Bien que notre méthode ait été standardisée pour Anabaena sp., elle peut être appliquée à toutes les cyanobactéries filamenteuses ou organismes filamenteux, pour étudier non seulement FtsZ mais aussi d’autres protéines associées au divisome puisqu’elles seront orientées dans le même plan XY.
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Disclosures
Il n’y a pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants aux bourses doctorales nationales (ANID 21211333; 21191389) pour le financement. Grant Fondecyt 1161232.
Ce travail a été soutenu par de Advanced Microscopy Facility UMA UC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | - | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | - | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | - | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
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