Summary
Wir stellen eine einfache und zugängliche Methode zur Visualisierung filamentöser Cyanobakterien in der XY-Ebene vor. Es wurde eine Agarosematrix mit niedrigem Schmelzpunkt verwendet, die die Aufnahme von Bildern von Proteinen, die an der Teilung beteiligt sind, in vertikaler Ausrichtung ermöglicht. Daher kann diese Methodik auf jeden fadenförmigen Organismus und verschiedene Arten von Proteinen angewendet werden.
Abstract
Ein Hauptereignis bei der bakteriellen Zellteilung ist der Septierungsprozess, bei dem das Protein FtsZ das Schlüsselelement ist. FtsZ polymerisiert und bildet in der Mitte der Zelle eine ringförmige Struktur (Z-Ring), die als Gerüst für andere Teilungsproteine dient. Hochauflösende Mikroskopie in den Bakterienmodellen Escherichia coli und Bacillus subtilis zeigte, dass der Z-Ring diskontinuierlich ist, während Lebendzell-Bildgebungsstudien zeigten, dass sich FtsZ durch einen Mechanismus, der als Lauffräsen bekannt ist, entlang des Rings bewegt. Um die Dynamik von FtsZ in vivo zu untersuchen, ist eine spezielle Zellplatzierung in vertikaler Position notwendig, um die komplette Struktur des Rings in der XY-Ebene abzubilden. Im Falle der FtsZ-Bildgebung in mehrzelligen Cyanobakterien wie Anabaena sp. PCC7120 ist es aufgrund der Größe der Zellen und der Länge der Filamente schwierig, die Filamente in einer vertikalen Position zu halten. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode, die die vertikale Immobilisierung von Anabaena sp. PCC 7120 Filamenten unter Verwendung von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und Spritzen ermöglicht, um den Z-Ring in einer Mutante zu erfassen, die ein FtsZ-sfGFP-Fusionsprotein exprimiert. Diese Methode ist eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, die Proteindynamik an der Teilungsstelle mittels konfokaler Mikroskopie zu registrieren.
Introduction
Die bakterielle Zellteilung ist der Prozess, bei dem eine Mutterzelle zwei Tochterzellen erzeugt, in den meisten Fällen durch den Mechanismus, der als binäre Spaltung bekannt ist. Eines der frühesten Ereignisse im Septationsprozess ist die Lokalisierung von FtsZ in der Mitte der Zelle1. Dieses Protein, das strukturell homolog zu Tubulin2 ist, ist in den meisten Bakterien konserviert und weit verbreitet, und seine Polymerisation erzeugt eine kontraktile Struktur, die als Z-Ring3 bekannt ist. Dieser Ring dient als Gerüst für andere Teilungsproteine und zusammen bilden sie eine molekulare Maschinerie, die als Divisom bezeichnet wird. Mehrere Studien haben gezeigt, dass der Z-Ring hochdynamisch ist und dass sich FtsZ-Protofilamente durch Tretfräsen bewegen 4,5,6. Um den Z-Ring in Zeitrafferexperimenten zu untersuchen, ist es ratsam, die Teilungsstelle in der XY-Ebene aufzuzeichnen, um eine bessere Auflösung und eine schnelle Abtastung zu ermöglichen. Um dies zu erreichen, ist es notwendig, vertikale Zellimmobilisierungsmethoden zu entwickeln, die üblicherweise die Nanofabrikation von Mikroloch-Zellfallen und komplexen mikrofluidischen Gerätenumfassen 7.
Cyanobakterien sind photosynthetische Mikroorganismen, die aufgrund ihrer Zellmorphologie als gramnegativ klassifiziert werden. Phylogenetisch sind sie jedoch näher an grampositiven Bakterien8. Diese Organismen haben Zellteilungsgene, die in grampositiven und gramnegativen Bakterien üblich sind, aber ihr Divisom enthält auch einzigartige Elemente9. PCC 7120 (im Folgenden Anabaena sp.) ist ein filamentöses Cyanobakterium mit einer Teilungsebene und ist ein Modell für die Untersuchung der Zellteilung in mehrzelligen Cyanobakterien. Bei diesem Stamm ist es gelungen, die Positionierung von FtsZ in der Mitte der Zellen10 zu bestimmen. Dennoch gibt es keine Studien, die die in vivo Dynamik von FtsZ in diesem Modell zeigen. In unserem Labor haben wir durch triparentale Paarung und homologe Rekombination eine vollständig segregierte Mutante von Anabaena sp. erhalten, die das mit sfGFP fusionierte FtsZ-Protein exprimiert, das das komplette endogene ftsZ-Gen ersetzt. Wir haben eine schnelle und einfache Methode zur Zellimmobilisierung entwickelt, die die vertikale Ausrichtung der mutierten Stammfilamente für Zeitrafferexperimente bevorzugt, um die Teilungsproteine in filamentösen Cyanobakterien sichtbar zu machen. Diese Methode benötigt keine mikrofluidischen Geräte, die teuer und schwierig zu entwickeln sein können. Als Beispiel haben wir dieses Protokoll verwendet, um den Z-Ring in der FtsZ-sfGFP-Mutante durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen.
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Protocol
1. Überlegungen und Auswahl des zellulären Modells
HINWEIS: Cyanobakterien haben aufgrund des Vorhandenseins von photosynthetischen Pigmenten eine starke Autofluoreszenz. Dieses Signal liegt im roten Teil des Spektrums, daher sind die fluoreszierenden Proteine, die für die Bildgebung in Cyanobakterien geeignet sind, diejenigen, die am weitesten von der roten Emission entfernt sind. Zum Beispiel GFP, YFP, Venus, Turquoise und BFP.
- Wählen Sie eine divisome Komponente aus, die im filamentösen Cyanobakterienstamm vorhanden ist. Für die Experimente ist es notwendig, eine filamentöse cyanobakterielle Mutante zu konstruieren, die die ausgewählte divosomische Komponente exprimiert, die mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert ist. In diesem Protokoll wird beispielsweise eine Anabaena sp.-Mutante verwendet, die FstZ-sfGFP exprimiert. Dieser Stamm wurde durch triparentale Verpaarung mit E. coli11 erhalten.
- Überprüfen Sie den Entmischungsgrad der Mutante, die verwendet werden soll. Im Beispiel wurde die Segregation durch PCR-Amplifikation des Zielgens bestimmt. Bei der in diesem Protokoll verwendeten FtsZ-sfGFP-Mutante handelt es sich um einen vollständig segregierten Stamm, dem das Wildtyp-FTS-Z-Genfehlt.
2. Wachstumsbedingungen
- Herstellung einer frischen Subkultur der Mutante unter Verwendung einer 10-ml-Kultur in stationärer Phase (ca. 14 Tage lang bei konstantem Licht bei 25 °C für Anabaena sp.) und Zugabe zu 90 ml BG11-Medium, das mit Antibiotika (Spectinomycin und Streptomycin 10 μl ml-1 für die FtsZ-sfGFP-Mutante) ergänzt wird.
- Züchten Sie die neue Zellkultur bei konstantem Licht und optimaler Temperatur, bis Sie die exponentielle Phase erreichen. Die FtsZ-sfGFP-Mutante von Anabaena sp. wird vor der Probenvorbereitung 7 Tage bei 25 °C gezüchtet.
3. Probenvorbereitung in einer Agarosematrix
- Nehmen Sie 2 ml der homogenisierten Wachstumskultur.
- Bei 2.500 x g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- In der Zwischenzeit werden in einem 50-ml-Kolben 30 ml Agarose mit 3 % niedrigem Schmelzpunkt in einem flüssigen BG11-Medium erhitzt. Verwenden Sie eine Mikrowelle, die auf mittlere Leistungsstufe eingestellt ist, und überprüfen Sie die Lösung alle 15 Sekunden, bis sie sich vollständig aufgelöst hat. Auf 37 °C abkühlen lassen.
Anmerkungen: Autoklavieren Sie die Agaroselösung, um eine Kontamination zu vermeiden. - Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, verwerfen Sie 1,9 ml des Überstandes und resuspendieren Sie die Zellen im verbleibenden Volumen, indem Sie mindestens dreimal auf und ab pipettieren.
- Mischen Sie die resuspendierten Zellen mit 900 μl der 3%igen Agaroselösung, indem Sie mindestens dreimal auf und ab pipettieren.
Anmerkungen: Die Agaroselösung muss flüssig, aber nicht zu heiß sein, um Zellschäden zu vermeiden. Der nächste Schritt muss schnell durchgeführt werden, bevor die Agaroselösung eine gelartige Konsistenz bildet =. - Saugen Sie die Agarosematrix vorsichtig in einer 1-ml-Spritze ab. Es ist wichtig, die Bildung von Blasen zu vermeiden, während die Probe mit der Spritze abgesaugt wird.
Anmerkungen: Stellen Sie vor diesem Schritt sicher, dass die Spitze der Spritze abgeschnitten ist, um das schmale Eintrittsloch zu entfernen. - Lassen Sie das Proben-Agarose-Gemisch erstarren, indem Sie die Spritze 2 h lang in horizontaler Position bei Raumtemperatur platzieren.
- Entfernen Sie die Agarosematrix vorsichtig mit dem Kolben und legen Sie sie auf eine saubere und ebene Oberfläche.
- Schneiden Sie die erstarrte Probe in Scheiben in einem Dickenbereich von 0,5 - 1 mm, wobei die Integrität der Matrix erhalten bleibt.
Anmerkungen: Um bessere Ergebnisse zu erzielen, schneiden Sie die Agarosematrix mit einem Skalpell oder dünnen Rasierklingen ab. - Legen Sie die Scheiben nebeneinander auf ein Deckglas. Die Anzahl der Scheiben auf einem Deckglas hängt von seinen Abmessungen ab.
HINWEIS: Für die Zeitraffermikroskopie wird empfohlen, eine Zellkammer für die Mikroskopieanalyse zu verwenden (z. B. Attofluor- oder Chamlide-Magnetkammern). Diese Kammern ermöglichen die Entnahme der Probe, wodurch eine Dehydrierung vermieden wird. In diesem Beispiel werden die Proben auf abgerundeten Deckgläsern (25 mm) mit der Attofluor-Kammer vorbereitet. - Fügen Sie 2 ml geschmolzene 3%ige Agaroselösung auf die in die Kammer gegebene Probe hinzu, um eine Austrocknung zu verhindern.
- Warten Sie, bis sich die Agaroselösung vollständig verfestigt hat, um ein Gel zu bilden.
4. Bildaufnahme
- Standardisieren Sie die Parameter, um das Fluoreszenzprotein zu visualisieren, das für den mutierten Stamm von Interesse ist, in einem konfokalen Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop sowohl die Autofluoreszenz als auch den ausgewählten Fluoreszenzmarker erkennen kann.
- Visualisieren Sie die Probe in der Hellfeldkonformation mit maximaler Vergrößerung und suchen Sie nach einem vertikal ausgerichteten Filament, wie in Abbildung 1 gezeigt.
- Finden Sie die gewünschte Teilungsstelle mit einer ersten Abtastung unter Verwendung des Autofluoreszenzsignals entlang der Z-Ebene.
- Verwenden Sie die Parameter des fluoreszierenden Proteinmarkers, um das Signal des interessierenden Proteins an der Teilungsstelle sichtbar zu machen.
- Führen Sie Zeitrafferexperimente entsprechend dem biologischen Modell und dem interessierenden Protein durch. Zum Beispiel wurden in diesem Fall Zeitrafferexperimente von 10 s in 50 s durchgeführt, um die Dynamik von FtsZ entlang des Z-Rings in Anabaena sp. aufzunehmen (Abbildung 2).
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Representative Results
Visualisierung des Z-Rings bei Anabaena sp. mit der vertikalen Immobilisierungsmethode
Um die Dynamik der Z-Ring-Komponenten in Bakterien zu untersuchen, ist es notwendig, Bilder in vertikal ausgerichteten Zellen aufzunehmen. In dieser Position ist es möglich, den Z-Ring und die Hauptproteine des Divisoms sichtbar zu machen, um die Proteindynamik durch Zeitraffermikroskopie zu überwachen. Die klassische Probenvorbereitung für Bakterien funktioniert bei filamentösen Cyanobakterien nicht. Bei Anabaena sp. sind die Filamente in einer Position ausgerichtet, die es nicht erlaubt, den Z-Ring sichtbar zu machen. Darüber hinaus ist es nicht möglich, die Filamente für die korrekte Visualisierung von Zellteilungsproteinen in einer einzelnen Zelle über längere Zeiträume immobilisiert zu halten. Um die Z-Ringe der FtsZ-sfGFP-Mutante in Anabaena sp sichtbar zu machen, haben wir daher ein Protokoll mit LMP-Agarose und horizontaler Inkubation der Probe entwickelt und standardisiert. Dieses Protokoll ermöglicht es, einen höheren Anteil an vertikal ausgerichteten Filamenten im Vergleich zu bisher verwendeten Verfahren zu erhalten (Abbildung 1). Daher war es möglich, den Z-Ring in der XY-Ebene in Zellen des mutierten Stammes bei direktem Kontakt mit dem Deckglas aufzunehmen (Abbildung 2A).
Z-Ring-Dynamik in der FtsZ-sfGFP Anabaena sp. Mutante mit der vertikalen Immobilisierungsmethode
Nach der Erprobung der vertikalen Immobilisierungsmethode in der konventionellen konfokalen Mikroskopie wurden Proben der FtsZ-sfGFP Anabaena sp-Mutante, die mit dem gleichen Protokoll hergestellt wurden, mittels Airyscan-Mikroskopie visualisiert. Mit dieser Technik konnten wir weniger Photobleichung in den Ringen beobachten und daher können die Experimente über längere Zeiträume durchgeführt werden, ohne das Fluoreszenzsignal zu verlieren. Tatsächlich waren wir in der Lage, Bilder für Zeiträume von etwa 16,5 Minuten zu erhalten, wobei Bilder alle 10 s mit geringer Photobleichung aufgenommen wurden, was es uns ermöglichte, Variationen der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit in verschiedenen Regionen des Z-Rings zu erkennen (Abbildung 2B).
Abbildung 1. Visualisierung von Anabaena sp.-Filamenten mit der vertikalen Immobilisierungsmethode. Eine Probe von Anabaena sp. wurde horizontal in LMP-Agarose 3% in BG11 in einer Spritze inkubiert. Die Probe wurde dann in Scheiben geschnitten und schließlich in die Zellkammer gegeben. Die Visualisierung der Zellen erfolgte mit einem inversen Mikroskop. (A) Repräsentative Hellfeldmikroskopie einer in der Agarosematrix inkubierten Probe ohne Durchführung der vertikalen Immobilisierungsmethode. Dieses Bild zeigt, dass die meisten Filamente horizontal ausgerichtet sind. Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Repräsentative Hellfeldmikroskopie mit einem hohen Anteil an vertikal ausgerichteten Filamenten von Anabaena sp. nach Anwendung der vertikalen Immobilisierungsmethode. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Visualisierung des Z-Rings in vertikal ausgerichteten Filamenten von Anabaena sp. mit der vertikalen Immobilisierungsmethode. Um die Z-Ringe in der XY-Ebene darzustellen, wurden die Zellen des sfGFP-FtsZ-Stammes in LMP-Agarose 3% bei 25 °C nach der vertikalen Immobilisierungsmethode (A.I.) inkubiert. Die Hellfeldmikroskopie zeigt ein Filament der Mutante in vertikaler Position. Maßstabsbalken = 10 μm. (A.II) Das FtsZ-sfGFP-Signal in einem Z-Ring des in (A.I) gezeigten Filaments. Dieses Bild ist die durchschnittliche Intensität von 6 Bildern, die alle 10 s für 1 Minute aufgenommen wurden. Maßstabsbalken = 2 μm (B) FtsZ-sfGFP-Signal des Z-Rings, aufgezeichnet alle 10 s für 50 s in den Zellen der FtsZ-sfGFP-Mutante, die vertikal in der BG11-Agarose-Matrix orientiert sind. Die Zeit (Sekunden) wird in der oberen linken Ecke jedes Bildes angezeigt. Es ist möglich, den Z-Ring und einen Cluster von FtsZ-sfGFP zu beobachten, der seine Position im Laufe der Zeit ändert (weiße Pfeile). Maßstabsbalken = 1 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Untersuchung der Dynamik divisome Proteine ist zweifelsohne eine Herausforderung. Insbesondere bei filamentösen Cyanobakterien besteht eine der Herausforderungen in der Visualisierung des Z-Rings in der horizontalen Ebene, für die die Zellen vertikal ausgerichtet sein müssen. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Positionierung des Z-Rings in der XY-Ebene, um die verschiedenen Analysen durchzuführen. Dies ist die erste einfache Methode für filamentöse Cyanobakterien, die eine vollständige Visualisierung des Z-Rings ermöglicht.
Obwohl dieses Protokoll einfach und schnell ist, ist bei der Probenvorbereitung in der Agarosematrix besondere Vorsicht geboten, da die Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eine geeignete Temperatur haben muss, um flüssig genug für die Vermischung mit der Zelllösung zu sein. Gleichzeitig darf die Agaroselösung nicht zu warm sein, da sie Zellschäden hervorrufen könnte. Ein weiterer kritischer Schritt, den es zu berücksichtigen gilt, ist das Schneiden der Scheiben, denn wenn es nicht sorgfältig durchgeführt wird, kann die Matrix kollabieren und die Probe beschädigen.
Bei dieser Methode ist der Anteil der Filamente in vertikaler Position höher als beim klassischen Protokoll. Es ist jedoch notwendig, so viele Scheiben wie möglich zu schneiden, um die statistische Analyse zu gewährleisten, d. h. mehrere Filamente in vertikaler Position.
Im Vergleich zu anderen Methoden, bei denen Einzelzellstudien in mikrofluidischen Systemen durchgeführt werden können, ist unsere Methode einfacher, schneller und kostengünstiger und erfordert nur Materialien und Reagenzien, die in jedem Labor leicht verfügbar sind. Auf der anderen Seite haben mikrofluidische Systeme, obwohl sie in Studien zu mehrzelligen Cyanobakterien weit verbreitet sind, unseres Wissens nach das Problem der Zellpositionierung in vertikaler Position nicht gelöst12.
Eine Einschränkung der Technik besteht darin, dass die Ausrichtung nicht immer perfekt ist. Dies liegt daran, dass wir gekippte Filamente in der Agarosematrix gesehen haben, aber mit dem vorherigen Screening mit Autofluoreszenzsignal ist es möglich, dieses Artefakt zu identifizieren. Außerdem konnten wir kein vollständiges Teilungsereignis visualisieren, da dieses Protokoll die Visualisierung der Teilungsstelle von bis zu 1 Stunde erlaubt, während die Teilungszeit von Anabaena sp. etwa 12 Stunden beträgt. Dieses Protokoll kann jedoch hilfreich sein, um ein vollständiges Teilungsereignis in schnell wachsenden Bakterien aufzuzeichnen.
Obwohl unsere Methode für Anabaena sp. standardisiert wurde, kann sie auf alle filamentösen Cyanobakterien oder filamentösen Organismen angewendet werden, um nicht nur FtsZ, sondern auch andere Proteine zu untersuchen, die mit dem Divisom assoziiert sind, da sie in der gleichen XY-Ebene ausgerichtet sind.
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Disclosures
Es besteht kein Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Wir danken den Nationalen Promotionsstipendien (ANID 21211333; 21191389) für die Finanzierung. Grant Fondecyt 1161232.
Diese Arbeit wurde von der Advanced Microscopy Facility UMA UC unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | - | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | - | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | - | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
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