Summary
我々は、XY平面における糸状シアノバクテリアの可視化のための簡単でアクセスしやすい方法を提示する。低融点のアガロースマトリックスを使用し、垂直方向で分裂に関与するタンパク質の画像を取得できるようにしました。したがって、この方法論は、任意の糸状生物および異なる種類のタンパク質に適用することができる。
Abstract
細菌細胞分裂の主なイベントは、タンパク質FtsZが重要な要素である分離プロセスです。FtsZは重合し、細胞の中央にリング状の構造(Zリング)を形成し、他の分裂タンパク質の足場として機能します。細菌モデル である大腸 菌と 枯草菌 の超解像顕微鏡では、Zリングが不連続であることが示され、ライブセルイメージング研究では、FtsZがトレッドミルと呼ばれるメカニズムによってリングに沿って移動することが示されました。 in vivoでのFtsZのダイナミクスを研究するには、XY平面内のリングの完全な構造をイメージングするために、垂直位置での特別な細胞配置が必要です。 Anabaena sp. PCC7120などの多細胞シアノバクテリアにおけるFtsZイメージングの場合、細胞のサイズとフィラメントの長さのために、フィラメントを垂直位置に維持することは困難です。本稿では、低融点アガロースとシリンジを用いて Anabaena sp. PCC 7120フィラメントを垂直固定化し、FtsZ-sfGFP融合タンパク質を発現する変異体でZリングを記録する方法について説明します。この方法は、共焦点顕微鏡を使用して分裂部位のタンパク質動態を登録するための迅速かつ安価な方法です。
Introduction
細菌の細胞分裂は、母細胞が2つの娘細胞を生成するプロセスであり、ほとんどの場合、二元分裂として知られるメカニズムによるものです。分離プロセスにおける最も初期のイベントの1つは、細胞1の中央でのFtsZの局在化です。チューブリン2と構造的に相同なこのタンパク質は、ほとんどの細菌に保存され、広く分布しており、その重合はZリング3として知られる収縮構造を生成します。このリングは、他の分裂タンパク質の足場として機能し、一緒になってディビソームと呼ばれる分子機構を形成します。いくつかの研究は、Zリングが非常に動的であり、FtsZプロトフィラメントがトレッドミルによって動くことを示しています4,5,6。タイムラプス実験でZリングを研究するには、より良い分解能と迅速なサンプリングのために、分割サイトをXY平面に記録することをお勧めします。これを達成するためには、マイクロホールセルトラップや複雑なマイクロ流体デバイス7のナノファブリケーションを一般的に含む垂直細胞固定化法を開発する必要がある。
シアノバクテリアは、その細胞形態によってグラム陰性に分類される光合成微生物です。しかし、系統発生的にはグラム陽性菌に近い8。これらの生物は、グラム陽性菌とグラム陰性菌に共通する細胞分裂遺伝子を持っていますが、それらの分割体には固有の要素も含まれています9。Anabaena sp. PCC 7120(以下、Anabaena sp.)は、1つの分裂面を持つ糸状藍藻であり、多細胞藍藻の細胞分裂研究のモデルである。この菌株では、細胞10の途中におけるFtsZの位置を決定することができた。それにもかかわらず、このモデルにおけるFtsZのin vivoダイナミクスを示す研究はありません。私たちの研究室では、三親交配と相同組換えにより、完全な内因性ftsZ遺伝子に置き換わるsfGFPに融合したFtsZタンパク質を発現するアナバエナ属の完全分離変異体を取得しました。我々は、糸状藍藻の分裂タンパク質を可視化するためのタイムラプス実験のために、変異株フィラメントの垂直配向を支持する迅速かつ簡便な細胞固定化法を開発しました。この方法は、高価で開発が困難なマイクロ流体デバイスを必要としません。一例として、このプロトコルを使用して、共焦点顕微鏡によってFtsZ-sfGFP変異体のZリングを視覚化しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 細胞モデルの考察と選択
注:シアノバクテリアは、光合成色素の存在により強い自家蛍光を発します。このシグナルはスペクトルの赤色部分にあり、したがって、シアノバクテリアにおけるイメージングに適した蛍光タンパク質は、赤色発光からかけ離れたものである。たとえば、GFP、YFP、金星、ターコイズ、BFPなどです。
- 対象の糸状シアノバクテリア株に存在する二種成分を選択する。実験のためには、蛍光タンパク質に融合した選択されたディビソーム成分を発現する糸状シアノバクテリア変異体を構築する必要がある。このプロトコルでは、FstZ-sfGFPを発現する アナバエナ 属変異体を例に挙げる。この菌株は、 大腸菌11との三親交配によって得られた。
- 使用する変異体の分離レベルを確認します。実施例において、単析は、標的遺伝子のPCR増幅により決定した。このプロトコルで使用されるFtsZ-sfGFP変異体は、野生型 ftsZ遺伝子を欠く完全に分離された株です。
2.成長条件
- 固定期の10 mL培養( アナバエナ 種については25°Cで常時光で約14日間増殖)を使用し、抗生物質を添加したBG11培地90 mL(FtsZ-sfGFP変異体の場合はスペクチノマイシンおよびストレプトマイシン10 μl ml-1 )を加えて、変異体の新しい継代培養を行います。
- 指数関数的段階に達するまで、新しい細胞培養物を一定の光と最適な温度で増殖させます。 アナバエナ 属のFtsZ-sfGFP変異体は、サンプル調製前に25°Cで7日間増殖させます。
3. アガロースマトリックスでのサンプル調製
- ホモジナイズした増殖培養物を2mL取ります。
- 2,500 x g で室温で10分間遠心分離します。
- その間に、50 mLフラスコ中で、3%低融点アガロース30 mLをBG11液体培地中で加熱する。中程度の電力レベルに設定されたマイクロ波を使用し、完全に溶解するまで15秒ごとに溶液をチェックします。37°Cまで冷却するために取っておきます。
注:汚染を避けるために、アガロースの溶液をオートクレーブします。 - 遠心分離が完了したら、1.9 mLの上清を廃棄し、少なくとも3回上下にピペッティングして残りの容量の細胞を再懸濁します。
- 再懸濁した細胞を900 μLの3%アガロース溶液と少なくとも3回ピペッティングして混合します。
注:アガロース溶液は液体でなければなりませんが、細胞の損傷を避けるために熱すぎてはいけません。次のステップは、アガロース溶液が粘稠度=のようなゲルを形成する前に、迅速に実行する必要があります。 - 1 mLシリンジでアガロースマトリックスを慎重に吸引します。サンプルがシリンジで吸引されている間は、気泡の発生を避けることが重要です。
注意: この手順の前に、シリンジの先端が狭い入口穴をなくすために切断されていることを確認してください。 - シリンジを室温で2時間水平位置に置いて、サンプルとアガロースの混合物を固化させます。
- プランジャーを使用してアガロースマトリックスを慎重に取り外し、清潔で平らな面に置きます。
- 固化したサンプルを0.5〜1 mmの厚さ範囲でスライスにカットし、マトリックスの完全性を維持します。
注意: より良い結果を得るには、メスまたは薄いかみそりの刃を使用してアガロースマトリックスを切断します。 - スライスをカバーガラスに並べて置きます。カバーガラス上のディスクの数は、その寸法によって異なります。
注:タイムラプス顕微鏡では、顕微鏡分析用に作られた細胞チャンバー(アトフルーまたはチャムライド磁気チャンバーなど)を使用することをお勧めします。これらのチャンバーは、脱水を回避するサンプルの取得を可能にします。この例では、サンプルはAttofluorチャンバーを使用して丸みを帯びたカバーガラス(25 mm)で準備されます。 - 脱水を防ぐために、チャンバーに入れたサンプルに2 mLの溶融3%アガロース溶液を加えます。
- アガロース溶液が完全に固化してゲルを形成するまで待ちます。
4. 画像取得
- パラメータを標準化して、変異株中の目的の蛍光タンパク質を共焦点顕微鏡で可視化します。顕微鏡が自家蛍光と選択した蛍光マーカーの両方を検出できることを確認してください。
- 最大倍率で明視野コンフォメーションでサンプルを視覚化し、 図1に示すように垂直方向のフィラメントを検索します。
- Z平面に沿った自家蛍光シグナルを使用した初期スキャンで、目的の分割部位を見つけます。
- 蛍光タンパク質マーカーのパラメータを使用して、分裂部位における目的のタンパク質のシグナルを可視化します。
- 生体モデルと目的のタンパク質に応じてタイムラプス実験を行います。例えば、この場合、50秒で10秒のタイムラプス実験を行い、 アナバエナ 属のZリングに沿ったFtsZのダイナミクスを記録しました(図2)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
垂直固定化法を用いた アナバエナ 属のZリングの可視化
細菌のZリング成分の動態を調べるためには、垂直方向の細胞で画像を取得する必要があります。この位置では、Z環とディビソームの主要タンパク質を可視化し、タイムラプス顕微鏡でタンパク質の動態をモニタリングすることができます。細菌の古典的なサンプル調製は、糸状シアノバクテリアには機能しません。 Anabaena sp.の場合、フィラメントはZリングを視覚化できない位置に配向しています。さらに、長期間にわたって単一細胞内の細胞分裂タンパク質を正しく可視化するためにフィラメントを固定化しておくことはできません。そこで、 アナバエナ 属のFtsZ-sfGFP変異体のZ環を可視化するために、LMPアガロースとサンプルの水平インキュベーションを用いたプロトコルを開発し、標準化しました。このプロトコルにより、以前に使用された手順と比較して、より高い割合の垂直配向フィラメントを得ることができます(図1)。したがって、カバーガラスと直接接触した変異株の細胞におけるXY平面におけるZリングを記録することができた(図2A)。
垂直固定化法を用いたFtsZ-sfGFP アナバエナ 属変異体のZリングダイナミクス
従来の共焦点顕微鏡で垂直固定化法をテストした後、同じプロトコルを使用して調製されたFtsZ-sfGFP Anabaena sp変異体のサンプルをエアリスカン顕微鏡で視覚化しました。この技術では、リング内の光退色が少ないため、蛍光シグナルを失うことなく、より長い期間実験を行うことができます。実際、光退色が少ない状態で10秒ごとに画像を取得することで、約16.5分の画像を取得することができ、Zリングのさまざまな領域で時間の経過に伴う蛍光強度の変化を検出することができました(図2B)。
図 1.垂直固定化法を用いたアナバエナ属フィラメントの可視化Anabaena sp.のサンプルを、シリンジ内のBG11中のLMPアガロース3%中で水平にインキュベートした。次に、サンプルをディスクに切断し、最後にセルチャンバーに入れました。細胞の可視化は倒立顕微鏡を用いて行った。 (A)垂直固定化法を行わずにアガロースマトリックス中でインキュベートしたサンプルの代表的な明視野顕微鏡。この画像は、ほとんどのフィラメントが水平方向を向いていることを示しています。スケールバー = 20 μm。 (B)垂直固定化法を使用した後のAnabaena sp.の垂直配向フィラメントの高い割合を示す代表的な明視野顕微鏡。スケールバー = 20 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.垂直固定化法を用いた アナバエナ 属の垂直配向フィラメントにおけるZリングの可視化。 ZリングをXY平面に表示するために、sfGFP-FtsZ株の細胞を、LMPアガロース3%中、垂直固定化法 (A.I. )に従い25°Cでインキュベートした。明視野顕微鏡は、垂直位置における変異体のフィラメントを示す。スケールバー = 10 μm。 (A.II) フィラメントのZリングにおけるFtsZ-sfGFPシグナルを (A.I.) に示す。この画像は、10秒ごとに1分間撮影された6枚の画像の平均強度です。スケールバー = 2 μm (B) BG11-アガロースマトリックス中で垂直に配向したFtsZ-sfGFP変異体の細胞において、ZリングのFtsZ-sfGFPシグナルを50秒間10秒ごとに記録した。時間(秒)は、各画像の左上隅に表示されます。Zリングと、時間とともに位置が変化するFtsZ-sfGFPのクラスターを観察することができます(白い矢印)。スケールバー = 1 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ディビソームタンパク質の動態の研究は間違いなく挑戦です。特に糸状藍藻では、細胞を垂直に配向させる水平面内のZリングを可視化することが課題の一つである。ここで説明した方法では、XY平面内のZリングを配置してさまざまな分析を実行できます。これは、Zリングの完全な可視化を可能にする糸状シアノバクテリアの最初の簡単な方法です。
このプロトコルはシンプルで高速ですが、低融点アガロースは細胞溶液と混合するのに十分な流動性を得るために適切な温度になければならないため、アガロースマトリックスのサンプル調製ステップでは特別な注意を払う必要があります。同時に、アガロース溶液は細胞の損傷を引き起こす可能性があるため、温かすぎてはいけません。考慮すべきもう一つの重要なステップは、慎重に行わないとマトリックスが崩壊してサンプルを損傷する可能性があるため、ディスクの切断です。
この方法を使用すると、垂直位置のフィラメントの割合は、従来のプロトコルよりも高くなります。しかしながら、統計分析を確実にするために、できるだけ多くのディスク、すなわち垂直位置にあるいくつかのフィラメントを切断することが必要である。
マイクロ流体システムでのシングルセル研究が可能な他の方法と比較して、私たちの方法はより簡単、迅速、安価であり、どのラボでも簡単に入手できる材料と試薬のみを必要とします。一方、マイクロ流体系は多細胞シアノバクテリアの研究で広く使用されているが、我々の知る限り、それらは垂直位置における細胞の位置付けの問題を解決していない12。
この手法の制限は、向きが常に完璧であるとは限らないことです。これは、アガロースマトリックスでフィラメントが傾いているのを見たためですが、自己蛍光シグナルを使用した以前のスクリーニングでは、このアーチファクトを特定することができます。また、このプロトコルでは分割サイトの可視化が1時間も可能であるのに対し、 Anabaena sp.の分割時間は約12時間であるため、完全な分割イベントを視覚化することはできませんでした。ただし、このプロトコルは、急速に増殖する細菌の完全な分裂イベントを記録するのに役立ちます。
我々の手法は Anabaena sp.で標準化されていますが、FtsZだけでなく、同じXY平面に配向しているため、すべての糸状シアノバクテリアまたは糸状生物に適用できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利益相反はありません。
Acknowledgments
資金提供のための国家博士奨学金(ANID 21211333; 21191389)に感謝します。グラントフォンデサイト1161232。
この研究は、de Advanced Microscopy Facility UMA UCの支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd. | - | The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize. |
| Attofluor Cell Chamber | ThermoFischer Scientific | A7816 | The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes. |
| Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block | CORNING | THERM-1001 | The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates. |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | ThermoFischer Scientific | 12-546-2P | Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant. |
| Low Melting Point agarose | Promega | V3841 | Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis. |
| LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan | Zeiss | - | The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed. |
| Microcentrífuga Fresco 17 | ThermoFischer Scientific | 75002402 | Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument. |
| Nikon Timelapse Microscope | Nikon | - | The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours. |
| Thin razor blades Schick Super Chromium | Farmazon | SKU: 401146 | The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix. |
References
- Löwe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
- Erickson, H. P. FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin. Cell. 80 (3), 367-370 (1995).
- Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E. coli cytokinesis. , 1-24 (2016).
- Perez, A. J., et al. Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).
- Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
- Yang, X., et al. GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis. Science. 355 (6326), 744-747 (2017).
- Whitley, K. D., et al. FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division. Nature Communications. 12 (1), (2021).
- Mazón, G., et al. LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Camargo, S., et al. ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Thiel, T., Peter Wolk, C. Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
