Metodo di immobilizzazione verticale per l'analisi al microscopio time-lapse in cianobatteri filamentosi

Summary

Presentiamo un metodo semplice e accessibile per la visualizzazione cianobatterica filamentosa nel piano XY. È stata utilizzata una matrice di agarosio a basso punto di fusione, che consente l'acquisizione di immagini di proteine coinvolte nella divisione, con orientamento verticale. Pertanto, questa metodologia può essere applicata a qualsiasi organismo filamentoso e diversi tipi di proteine.

Abstract

Un evento principale nella divisione cellulare batterica è il processo di settizione, dove la proteina FtsZ è l'elemento chiave. FtsZ polimerizza formando una struttura ad anello (Z-ring) nel mezzo della cellula che funge da impalcatura per altre proteine di divisione. La microscopia a super-risoluzione in modelli batterici Escherichia coli e Bacillus subtilis ha mostrato che l'anello Z è discontinuo, mentre studi di imaging cellulare vivo hanno dimostrato che FtsZ si muove lungo l'anello con un meccanismo noto come tapis roulant. Per studiare la dinamica di FtsZ in vivo, è necessario uno speciale posizionamento delle celle in posizione verticale per l'imaging della struttura completa dell'anello nel piano XY. Nel caso dell'imaging FtsZ nei cianobatteri multicellulari, come Anabaena sp. PCC7120, mantenere i filamenti in posizione verticale è difficile a causa delle dimensioni delle cellule e della lunghezza dei filamenti. In questo articolo, descriviamo un metodo che consente l'immobilizzazione verticale dei filamenti di Anabaena sp. PCC 7120 utilizzando agarosio a basso punto di fusione e siringhe, per registrare l'anello Z in un mutante che esprime una proteina di fusione FtsZ-sfGFP. Questo metodo è un modo rapido ed economico per registrare la dinamica delle proteine nel sito di divisione utilizzando la microscopia confocale.

Introduction

La divisione cellulare batterica è il processo in cui una cellula madre genera due cellule figlie, nella maggior parte dei casi dal meccanismo noto come fissione binaria. Uno dei primi eventi nel processo di settazione è la localizzazione di FtsZ nel mezzo della cella¹. Questa proteina, che è strutturalmente omologa alla tubulina², è conservata e ampiamente distribuita nella maggior parte dei batteri e la sua polimerizzazione genera una struttura contrattile nota come Z-ring³. Questo anello funge da impalcatura per altre proteine di divisione e insieme formano un meccanismo molecolare chiamato divisomia. Diversi studi hanno dimostrato che l'anello Z è altamente dinamico e che i protofilamenti FtsZ si muovono per tapis roulant ^4,5,6. Per studiare l'anello Z in esperimenti time-lapse, è consigliabile registrare il sito di divisione nel piano XY per una migliore risoluzione e un campionamento rapido. Per raggiungere questo obiettivo, è necessario sviluppare metodi di immobilizzazione cellulare verticale che includano comunemente la nanofabbricazione di trappole cellulari microforate e dispositivi microfluidici complessi⁷.

I cianobatteri sono microrganismi fotosintetici classificati come gram-negativi dalla loro morfologia cellulare. Tuttavia, filogeneticamente sono più vicini ai batteri gram-positivi⁸. Questi organismi hanno geni di divisione cellulare che sono comuni all'interno dei batteri gram-positivi e gram-negativi, ma il loro divisore contiene anche elementi unici⁹. PCC 7120 (di seguito Anabaena sp.) è un cianobatterio filamentoso con un piano di divisione ed è un modello per lo studio della divisione cellulare nei cianobatteri multicellulari. In questo ceppo, è stato possibile determinare il posizionamento di FtsZ al centro delle celle¹⁰. Tuttavia, non ci sono studi che mostrano la dinamica in vivo di FtsZ in questo modello. Nel nostro laboratorio, attraverso l'accoppiamento triparentale e la ricombinazione omologa, abbiamo ottenuto un mutante totalmente segregato di Anabaena sp. che esprime la proteina FtsZ fusa a sfGFP, che ha sostituito il gene ftsZ endogeno completo. Abbiamo sviluppato un metodo di immobilizzazione cellulare rapido e semplice che favorisce l'orientamento verticale dei filamenti di ceppo mutanti per esperimenti time-lapse per visualizzare le proteine di divisione nei cianobatteri filamentosi. Questo metodo non ha bisogno di dispositivi microfluidici che possono essere costosi e difficili da sviluppare. Ad esempio, abbiamo usato questo protocollo per visualizzare l'anello Z nel mutante FtsZ-sfGFP mediante microscopia confocale.

Protocol

1. Considerazioni e selezione del modello cellulare

NOTA: I cianobatteri hanno una forte autofluorescenza dovuta alla presenza di pigmenti fotosintetici. Questo segnale è nella parte rossa dello spettro, quindi, le proteine fluorescenti adatte per l'imaging nei cianobatteri sono quelle lontane dall'emissione rossa. Ad esempio, GFP, YFP, Venere, Turchese e BFP.

1. Selezionare un componente divisivo presente nel ceppo cianobatterico filamentoso bersaglio. Per gli esperimenti, è necessario costruire un mutante cianobatterico filamentoso che esprima la componente divisiva selezionata fusa ad una proteina fluorescente. In questo protocollo, un mutante Anabaena sp. che esprime FstZ-sfGFP, come esempio. Questo ceppo è stato ottenuto dall'accoppiamento triparentale con E. coli¹¹.
2. Controllare il livello di segregazione del mutante che verrà utilizzato. Nell'esempio, la segregazione è stata determinata mediante amplificazione PCR del gene bersaglio. Il mutante FtsZ-sfGFP utilizzato in questo protocollo è un ceppo completamente segregato che manca del gene ftsZ wild-type.

2. Condizioni di crescita

1. Fare una nuova sottocoltura del mutante usando 10 mL di coltura in fase stazionaria (coltivata per circa 14 giorni in luce costante, a 25°C, per Anabaena sp.) e aggiungendo a 90 mL di terreno BG11 integrato con antibiotici (Spectinomicina e Streptomicina 10 μl ml-1 per il mutante FtsZ-sfGFP).
2. Far crescere la nuova coltura cellulare in luce costante e alla temperatura ottimale fino a raggiungere la fase esponenziale. Il mutante FtsZ-sfGFP di Anabaena sp. viene coltivato a 25 °C per 7 giorni prima della preparazione del campione.

3. Preparazione del campione in una matrice di agarosio

1. Prendi 2 ml di cultura della crescita omogeneizzata.
2. Centrifugare a 2.500 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
3. Nel frattempo, in un matraccio da 50 ml, riscaldare 30 mL di agarosio a basso punto di fusione al 3% in mezzo liquido BG11. Utilizzare un forno a microonde impostato sul livello di potenza medio e controllare la soluzione ogni 15 s fino a completa dissoluzione. Mettere da parte per raffreddare fino a 37 °C.
   NOTA: Autoclavare la soluzione di agarosio per evitare contaminazioni.
4. Una volta eseguita la centrifugazione, scartare 1,9 ml di surnatante e risospendere le cellule nel volume rimanente mediante pipettaggio almeno tre volte su e giù.
5. Mescolare le cellule risospese con 900 μL della soluzione di agarosio al 3% pipettando su e giù almeno tre volte.
   NOTA: La soluzione di agarosio deve essere liquida ma non troppo calda per evitare danni alle cellule. Il passo successivo deve essere eseguito velocemente e prima che la soluzione di agarosio formi un gel come consistenza =.
6. Aspirare accuratamente la matrice di agarosio in una siringa da 1 ml. È importante evitare la generazione di bolle mentre il campione viene aspirato con la siringa.
   NOTA: prima di questo passaggio, assicurarsi che la punta della siringa sia tagliata per eliminare il foro di ingresso stretto.
7. Lasciare solidificare la miscela campione-agarosio posizionando la siringa in posizione orizzontale a temperatura ambiente per 2 ore.
8. Rimuovere con cura la matrice di agarosio utilizzando lo stantuffo e metterla su una superficie pulita e piana.
9. Tagliare il campione solidificato a fette, in un intervallo di spessore di 0,5 - 1 mm, mantenendo l'integrità della matrice.
   NOTA: Per risultati migliori, tagliare la matrice di agarosio usando un bisturi o sottili lamette da barba.
10. Disporre le fette una accanto all'altra su un coprivetrino. Il numero di dischi su un vetrino dipenderà dalle sue dimensioni.
    NOTA: Per la microscopia time-lapse, si consiglia di utilizzare una camera cellulare realizzata per l'analisi al microscopio (ad esempio, camere magnetiche Attofluor o Chamlide). Queste camere permettono l'acquisizione del campione evitando la disidratazione. In questo esempio i campioni vengono preparati su vetrini arrotondati (25 mm) utilizzando la camera Attofluor.
11. Aggiungere 2 ml di soluzione fusa di agarosio al 3% sul campione posto nella camera per prevenire la disidratazione.
12. Attendere che la soluzione di agarosio sia completamente solidificata per formare un gel.

4. Acquisizione di immagini

1. Standardizzare i parametri per visualizzare la proteina fluorescente di interesse nel ceppo mutante in un microscopio confocale. Assicurarsi che il microscopio sia in grado di rilevare sia l'autofluorescenza che il marcatore fluorescente selezionato.
2. Visualizzate il campione nella conformazione del campo luminoso con il massimo ingrandimento e cercate un filamento orientato verticalmente come mostrato nella Figura 1.
3. Trova il sito di divisione di interesse con una scansione iniziale utilizzando il segnale di autofluorescenza lungo il piano Z.
4. Utilizzare i parametri del marcatore proteico fluorescente per visualizzare il segnale della proteina di interesse nel sito di divisione.
5. Eseguire esperimenti time-lapse secondo il modello biologico e la proteina di interesse. Ad esempio, in questo caso sono stati eseguiti esperimenti time-lapse di 10 s in 50 s per registrare la dinamica di FtsZ lungo l'anello Z in Anabaena sp. (Figura 2).

Representative Results

Visualizzazione dell'anello Z in Anabaena sp. utilizzando il metodo dell'immobilizzazione verticale
Per studiare la dinamica dei componenti dell'anello Z nei batteri, è necessario acquisire immagini in cellule orientate verticalmente. In questa posizione, è possibile visualizzare l'anello Z e le principali proteine del divisore per monitorare la dinamica delle proteine mediante microscopia time-lapse. La classica preparazione del campione per i batteri non funziona per i cianobatteri filamentosi. Nel caso di Anabaena sp., i filamenti sono orientati in una posizione che non consente di visualizzare l'anello Z. Inoltre, non è possibile mantenere i filamenti immobilizzati per una corretta visualizzazione delle proteine di divisione cellulare in una singola cellula per lunghi periodi di tempo. Pertanto, al fine di visualizzare gli anelli Z del mutante FtsZ-sfGFP in Anabaena sp abbiamo sviluppato e standardizzato un protocollo utilizzando agarosio LMP e l'incubazione orizzontale del campione. Questo protocollo consente di ottenere una percentuale maggiore di filamenti orientati verticalmente, rispetto alle procedure precedentemente utilizzate (Figura 1). Pertanto, è stato possibile registrare l'anello Z nel piano XY in cellule del ceppo mutante a contatto diretto con il coprislip (Figura 2A).

Dinamica dell'anello Z nel mutante FtsZ-sfGFP Anabaena sp. utilizzando il metodo dell'immobilizzazione verticale
Dopo aver testato il metodo di immobilizzazione verticale in microscopia confocale convenzionale, campioni del mutante FtsZ-sfGFP Anabaena sp preparati utilizzando lo stesso protocollo sono stati visualizzati mediante microscopia Airyscan. Con questa tecnica, abbiamo osservato meno fotosbiancamento negli anelli e, quindi, gli esperimenti possono essere eseguiti per periodi più lunghi senza perdere il segnale di fluorescenza. Infatti, siamo stati in grado di ottenere immagini per periodi di circa 16,5 minuti, con acquisizione di immagini ogni 10 s con basso photobleaching, che ci ha permesso di rilevare variazioni di intensità di fluorescenza nel tempo in diverse regioni dell'anello Z (Figura 2B).

Figura 1. Visualizzazione dei filamenti di Anabaena sp. utilizzando il metodo dell'immobilizzazione verticale. Un campione di Anabaena sp. è stato incubato orizzontalmente in LMP agarosio 3% in BG11 all'interno di una siringa. Il campione è stato poi tagliato in dischi e infine posto nella camera cellulare. La visualizzazione delle cellule è stata effettuata utilizzando un microscopio invertito. (A) Microscopia rappresentativa in campo chiaro di un campione incubato nella matrice di agarosio senza eseguire il metodo dell'immobilizzazione verticale. Questa immagine mostra che la maggior parte dei filamenti sono orientati orizzontalmente. Barra di scala = 20 μm. (B) Microscopia rappresentativa a campo chiaro che mostra un'alta percentuale di filamenti orientati verticalmente di Anabaena sp. dopo aver utilizzato il metodo di immobilizzazione verticale. Barra di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2. Visualizzazione dell'anello Z in filamenti orientati verticalmente di Anabaena sp. utilizzando il metodo dell'immobilizzazione verticale. Per visualizzare gli anelli Z nel piano XY, le cellule del ceppo sfGFP-FtsZ sono state incubate in agarosio LMP al 3% a 25 °C seguendo il metodo di immobilizzazione verticale (A.I). La microscopia a campo chiaro mostra un filamento del mutante in posizione verticale. Barra di scala =10 μm. (A.II) Il segnale FtsZ-sfGFP in un anello Z del filamento mostrato in (A.I ). Questa immagine è l'intensità media di 6 immagini scattate ogni 10 s per 1 minuto. Barra di scala = 2 μm (B) Segnale FtsZ-sfGFP dell'anello Z registrato ogni 10 s per 50 s nelle celle del mutante FtsZ-sfGFP orientato verticalmente nella matrice BG11-agarosio. Il tempo (secondi) è indicato nell'angolo in alto a sinistra di ogni immagine. E' possibile osservare l'anello Z e un ammasso di FtsZ-sfGFP che cambia posizione nel tempo (frecce bianche). Barra di scala = 1 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Lo studio della dinamica delle proteine divisive è senza dubbio una sfida. In particolare, nei cianobatteri filamentosi, una delle sfide è la visualizzazione dell'anello Z nel piano orizzontale, per il quale le cellule devono essere orientate verticalmente. Il metodo che abbiamo descritto qui consente il posizionamento dell'anello Z nel piano XY per eseguire le diverse analisi. Questo è il primo metodo semplice per cianobatteri filamentosi che consente la visualizzazione completa dell'anello Z.

Sebbene questo protocollo sia semplice e veloce, è necessario prestare particolare attenzione durante la fase di preparazione del campione nella matrice di agarosio, poiché l'agarosio a basso punto di fusione deve essere ad una temperatura adeguata per essere abbastanza fluido per la miscelazione con la soluzione cellulare. Allo stesso tempo, la soluzione di agarosio non può essere troppo calda poiché potrebbe provocare danni cellulari. Un altro passaggio critico da considerare è il taglio dei dischi perché se non viene fatto con attenzione, la matrice può collassare e danneggiare il campione.

Utilizzando questo metodo, la proporzione di filamenti nella posizione verticale è superiore rispetto al protocollo classico. Tuttavia, è necessario tagliare il maggior numero possibile di dischi per garantire l'analisi statistica, cioè diversi filamenti in posizione verticale.

Rispetto ad altri metodi, in cui è possibile effettuare studi su singole cellule in sistemi microfluidici, il nostro metodo è più semplice, veloce ed economico, richiedendo solo materiali e reagenti facilmente disponibili in qualsiasi laboratorio. D'altra parte, sebbene i sistemi microfluidici siano ampiamente utilizzati negli studi sui cianobatteri multicellulari, a nostra conoscenza non hanno risolto il problema del posizionamento cellulare in posizione verticale¹².

Un limite della tecnica è che l'orientamento non è sempre perfetto. Questo perché abbiamo visto filamenti inclinati nella matrice di agarosio, tuttavia, con lo screening precedente utilizzando il segnale di autofluorescenza è possibile identificare questo artefatto. Inoltre, non è stato possibile visualizzare un evento di divisione completo, perché questo protocollo consente la visualizzazione del sito della divisione fino a 1 ora, mentre il tempo di divisione di Anabaena sp. è di circa 12 ore. Tuttavia, questo protocollo può essere utile per registrare un evento di divisione completa nei batteri in rapida crescita.

Sebbene il nostro metodo sia stato standardizzato per Anabaena sp. può essere applicato a tutti i cianobatteri filamentosi o organismi filamentosi, per studiare non solo FtsZ ma anche altre proteine associate al divisomia poiché saranno orientate nello stesso piano XY.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml syringe	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.
Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block	CORNING	THERM-1001	The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.
Low Melting Point agarose	Promega	V3841	Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.
LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan	Zeiss	-	The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.
Microcentrífuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument.
Nikon Timelapse Microscope	Nikon	-	The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours.
Thin razor blades Schick Super Chromium	Farmazon	SKU: 401146	The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix.