Método de inmovilización vertical para el análisis de microscopía time-lapse en cianobacterias filamentosas

Summary

Presentamos un método simple y accesible para la visualización de cianobacterias filamentosas en el plano XY. Se utilizó una matriz de agarosa de bajo punto de fusión, que permite la adquisición de imágenes de proteínas implicadas en la división, en orientación vertical. Por lo tanto, esta metodología se puede aplicar a cualquier organismo filamentoso y diferentes tipos de proteínas.

Abstract

Un evento principal en la división celular bacteriana es el proceso de septación, donde la proteína FtsZ es el elemento clave. FtsZ polimeriza formando una estructura en forma de anillo (anillo Z) en el centro de la célula que sirve como andamio para otras proteínas de división. La microscopía de súper resolución en modelos bacterianos Escherichia coli y Bacillus subtilis mostró que el anillo Z es discontinuo, mientras que los estudios de imágenes de células vivas demostraron que FtsZ se mueve a lo largo del anillo por un mecanismo conocido como cinta rodante. Para estudiar la dinámica de FtsZ in vivo, es necesaria una colocación especial de la celda en posición vertical para obtener imágenes de la estructura completa del anillo en el plano XY. En el caso de las imágenes de FtsZ en cianobacterias multicelulares, como Anabaena sp. PCC7120, mantener los filamentos en posición vertical es un desafío debido al tamaño de las células y la longitud de los filamentos. En este artículo, describimos un método que permite la inmovilización vertical de filamentos PCC 7120 de Anabaena sp. utilizando agarosa y jeringas de bajo punto de fusión, para registrar el anillo Z en un mutante que expresa una proteína de fusión FtsZ-sfGFP. Este método es una forma rápida y económica de registrar la dinámica de proteínas en el sitio de división utilizando microscopía confocal.

Introduction

La división celular bacteriana es el proceso en el que una célula madre genera dos células hijas, en la mayoría de los casos por el mecanismo conocido como fisión binaria. Uno de los primeros eventos en el proceso de septación es la localización de FtsZ en el centro de la celda¹. Esta proteína, que es estructuralmente homóloga a la tubulina², se conserva y distribuye ampliamente en la mayoría de las bacterias, y su polimerización genera una estructura contráctil conocida como anillo Z³. Este anillo sirve como andamio para otras proteínas de división y juntas forman una maquinaria molecular llamada divisoma. Varios estudios han demostrado que el anillo Z es altamente dinámico y que los protofilamentos FtsZ se mueven por cinta de correr ^4,5,6. Para estudiar el anillo Z en experimentos de lapso de tiempo, es aconsejable registrar el sitio de división en el plano XY para una mejor resolución y un muestreo rápido. Para lograr esto, es necesario desarrollar métodos de inmovilización celular vertical que comúnmente incluyen la nanofabricación de trampas celulares de microagujeros y dispositivos microfluídicos complejos⁷.

Las cianobacterias son microorganismos fotosintéticos que se clasifican como gramnegativos por su morfología celular. Sin embargo, filogenéticamente están más cerca de las bacterias grampositivas⁸. Estos organismos tienen genes de división celular que son comunes dentro de las bacterias grampositivas y gramnegativas, pero su divisoma también contiene elementos únicos⁹. PCC 7120 (en adelante Anabaena sp.) es cianobacteria filamentosa con un plano de división y es un modelo para el estudio de la división celular en cianobacterias multicelulares. En esta cepa, ha sido posible determinar el posicionamiento de FtsZ en el centro de las células¹⁰. Sin embargo, no hay estudios que muestren la dinámica in vivo de FtsZ en este modelo. En nuestro laboratorio, mediante apareamiento triparental y recombinación homóloga, obtuvimos un mutante totalmente segregado de Anabaena sp. que expresa la proteína FtsZ fusionada con sfGFP, que sustituyó al gen ftsZ endógeno completo. Desarrollamos un método de inmovilización celular rápido y sencillo que favorece la orientación vertical de los filamentos de cepa mutantes para experimentos time-lapse para visualizar las proteínas de división en cianobacterias filamentosas. Este método no necesita dispositivos microfluídicos que pueden ser costosos y difíciles de desarrollar. Como ejemplo, utilizamos este protocolo para visualizar el anillo Z en el mutante FtsZ-sfGFP mediante microscopía confocal.

Protocol

1. Consideraciones y selección del modelo celular

NOTA: Las cianobacterias tienen una fuerte autofluorescencia debido a la presencia de pigmentos fotosintéticos. Esta señal se encuentra en la parte roja del espectro, por lo tanto, las proteínas fluorescentes adecuadas para la obtención de imágenes en cianobacterias son las que están lejos de la emisión roja. Por ejemplo, GFP, YFP, Venus, Turquesa y BFP.

1. Seleccione un componente divisoma presente en la cepa de cianobacterias filamentosas objetivo. Para los experimentos, es necesario construir un mutante cianobacteriano filamentoso que exprese el componente divisoma seleccionado fusionado a una proteína fluorescente. En este protocolo, un mutante Anabaena sp. que expresa FstZ-sfGFP, como ejemplo. Esta cepa se obtuvo por apareamiento triparental con E. coli¹¹.
2. Compruebe el nivel de segregación del mutante que se utilizará. En el ejemplo, la segregación se determinó mediante la amplificación por PCR del gen diana. El mutante FtsZ-sfGFP utilizado en este protocolo es una cepa totalmente segregada que carece del gen ftsZ de tipo salvaje.

2. Condiciones de crecimiento

1. Hacer un nuevo subcultivo del mutante utilizando 10 mL de cultivo en fase estacionaria (cultivado durante aproximadamente 14 días a luz constante, a 25°C, para Anabaena sp.) y añadiendo a 90 mL de medio BG11 suplementado con antibióticos (Espectinomicina y Estreptomicina 10 μl ml-1 para el mutante FtsZ-sfGFP).
2. Cultivar el nuevo cultivo celular en luz constante y a la temperatura óptima hasta alcanzar la fase exponencial. El mutante FtsZ-sfGFP de Anabaena sp. se cultiva a 25 °C durante 7 días antes de la preparación de la muestra.

3. Preparación de muestras en matriz de agarosa

1. Tomar 2 mL del cultivo de crecimiento homogeneizado.
2. Centrifugar a 2.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
3. Mientras tanto, en un matraz de 50 ml, calentar 30 ml de agarosa de bajo punto de fusión al 3% en medio líquido BG11. Use un microondas ajustado al nivel de potencia medio y verifique la solución cada 15 s hasta que se disuelva por completo. Dejar enfriar a 37 °C.
   NOTA: Autoclave la solución de agarosa para evitar la contaminación.
4. Una vez realizada la centrifugación, deseche 1,9 ml del sobrenadante y resuspenda las células en el volumen restante pipeteando al menos tres veces hacia arriba y hacia abajo.
5. Mezclar las células resuspendidas con 900 μL de la solución de agarosa al 3% pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces.
   NOTA: La solución de agarosa debe ser líquida pero no demasiado caliente para evitar daños celulares. El siguiente paso debe realizarse rápidamente y antes de que la solución de agarosa forme una consistencia similar a un gel =.
6. Aspire cuidadosamente la matriz de agarosa en una jeringa de 1 ml. Es importante evitar la generación de burbujas mientras se aspira la muestra con la jeringa.
   NOTA: Antes de este paso, asegúrese de cortar la punta de la jeringa para eliminar el orificio de entrada estrecho.
7. Deje que la mezcla de muestra y agarosa se solidifique colocando la jeringa en posición horizontal a temperatura ambiente durante 2 h.
8. Retire la matriz de agarosa con cuidado con el émbolo y colóquela sobre una superficie limpia y plana.
9. Corte la muestra solidificada en rodajas, en un rango de espesor de 0,5 - 1 mm, manteniendo la integridad de la matriz.
   NOTA: Para obtener mejores resultados, corte la matriz de agarosa con un bisturí o cuchillas de afeitar delgadas.
10. Coloque las rodajas una al lado de la otra en un cubreobjetos. El número de discos en un cubreobjetos dependerá de sus dimensiones.
    NOTA: Para la microscopía de lapso de tiempo, se recomienda utilizar una cámara celular hecha para el análisis de microscopía (por ejemplo, cámaras magnéticas Attofluor o Chamlide). Estas cámaras permiten la adquisición de la muestra evitando la deshidratación. En este ejemplo, las muestras se preparan en cubreobjetos redondeados (25 mm) utilizando la cámara de Attofluor.
11. Agregue 2 ml de solución de agarosa derretida al 3% en la muestra colocada en la cámara para prevenir la deshidratación.
12. Espere hasta que la solución de agarosa esté completamente solidificada para formar un gel.

4. Adquisición de imágenes

1. Estandarizar los parámetros para visualizar la proteína fluorescente de interés en la cepa mutante en un microscopio confocal. Asegúrese de que el microscopio pueda detectar tanto la autofluorescencia como el marcador fluorescente seleccionado.
2. Visualice la muestra en la conformación de campo brillante con el máximo aumento y busque un filamento orientado verticalmente como se muestra en la Figura 1.
3. Encuentre el sitio de división de interés con un escaneo inicial utilizando la señal de autofluorescencia a lo largo del plano Z.
4. Utilice los parámetros del marcador de proteína fluorescente para visualizar la señal de la proteína de interés en el sitio de división.
5. Realizar experimentos time-lapse según el modelo biológico y la proteína de interés. Por ejemplo, en este caso se realizaron experimentos de lapso de tiempo de 10 s en 50 s para registrar la dinámica de FtsZ a lo largo del anillo Z en Anabaena sp. (Figura 2).

Representative Results

Visualización del anillo Z en Anabaena sp. utilizando el método de inmovilización vertical
Para estudiar la dinámica de los componentes del anillo Z en bacterias, es necesario adquirir imágenes en células orientadas verticalmente. En esta posición, es posible visualizar el anillo Z y las principales proteínas del divisoma para monitorear la dinámica de las proteínas mediante microscopía de lapso de tiempo. La preparación clásica de muestras para bacterias no funciona para cianobacterias filamentosas. En el caso de Anabaena sp., los filamentos están orientados en una posición que no permite visualizar el anillo Z. Además, no es posible mantener los filamentos inmovilizados para la correcta visualización de las proteínas de división celular en una sola célula durante largos períodos de tiempo. Por lo tanto, para visualizar los anillos Z del mutante FtsZ-sfGFP en Anabaena sp desarrollamos y estandarizamos un protocolo utilizando agarosa LMP e incubación horizontal de la muestra. Este protocolo permite obtener una mayor proporción de filamentos orientados verticalmente, en comparación con los procedimientos utilizados anteriormente (Figura 1). Por lo tanto, fue posible registrar el anillo Z en el plano XY en células de la cepa mutante en contacto directo con el cubreobjetos (Figura 2A).

Dinámica del anillo Z en el mutante FtsZ-sfGFP Anabaena sp. usando el método de inmovilización vertical
Después de probar el método de inmovilización vertical en microscopía confocal convencional, se visualizaron muestras del mutante FtsZ-sfGFP Anabaena sp preparadas utilizando el mismo protocolo mediante microscopía Airyscan. Con esta técnica, observamos menos fotoblanqueo en los anillos y, por lo tanto, los experimentos se pueden realizar durante períodos más largos sin perder la señal de fluorescencia. De hecho, pudimos obtener imágenes durante períodos de aproximadamente 16,5 min, con adquisición de imágenes cada 10 s con bajo fotoblanqueo, lo que nos permitió detectar variaciones en la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo en diferentes regiones del anillo Z (Figura 2B).

Figura 1. Visualización de filamentos de Anabaena sp. mediante el método de inmovilización vertical. Una muestra de Anabaena sp. se incubó horizontalmente en agarosa LMP 3% en BG11 dentro de una jeringa. La muestra se cortó en discos y finalmente se colocó en la cámara celular. La visualización de las células se llevó a cabo utilizando un microscopio invertido. (A) Microscopía representativa de campo claro de una muestra incubada en la matriz de agarosa sin realizar el método de inmovilización vertical. Esta imagen muestra que la mayoría de los filamentos están orientados horizontalmente. Barra de escala = 20 μm. (B) Microscopía representativa de campo claro que muestra una alta proporción de filamentos orientados verticalmente de Anabaena sp. después de utilizar el método de inmovilización vertical. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Visualización del anillo Z en filamentos orientados verticalmente de Anabaena sp. utilizando el método de inmovilización vertical. Para mostrar los anillos Z en el plano XY, las células de la cepa sfGFP-FtsZ se incubaron en agarosa LMP al 3% a 25 °C siguiendo el método de inmovilización vertical (I.A.). La microscopía de campo claro muestra un filamento del mutante en posición vertical. Barra de escala =10 μm. (A.II) La señal FtsZ-sfGFP en un anillo Z del filamento mostrado en (A.I ). Esta imagen es la intensidad promedio de 6 imágenes tomadas cada 10 s durante 1 minuto. Barra de escala = 2 μm (B) Señal FtsZ-sfGFP del anillo Z registrada cada 10 s durante 50 s en las celdas del mutante FtsZ-sfGFP orientadas verticalmente en la matriz BG11-agarosa. El tiempo (segundos) se indica en la esquina superior izquierda de cada imagen. Es posible observar el anillo Z y un grupo de FtsZ-sfGFP que cambia su posición con el tiempo (flechas blancas). Barra de escala = 1 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El estudio de la dinámica de las proteínas divisómicas es sin duda un desafío. Particularmente, en las cianobacterias filamentosas, uno de los desafíos es la visualización del anillo Z en el plano horizontal, para lo cual las células deben estar orientadas verticalmente. El método que describimos aquí permite el posicionamiento del anillo Z en el plano XY para realizar los diferentes análisis. Este es el primer método simple para cianobacterias filamentosas que permite la visualización completa del anillo Z.

Aunque este protocolo es simple y rápido, se debe tener especial cuidado durante el paso de preparación de la muestra en la matriz de agarosa, ya que la agarosa de bajo punto de fusión debe estar a una temperatura adecuada para ser lo suficientemente fluida como para mezclarse con la solución celular. Al mismo tiempo, la solución de agarosa no puede estar demasiado caliente, ya que podría provocar daño celular. Otro paso crítico a considerar es el corte de los discos ya que si no se hace con cuidado, la matriz puede colapsar y dañar la muestra.

Usando este método, la proporción de filamentos en posición vertical es mayor que con el protocolo clásico. Sin embargo, es necesario cortar tantos discos como sea posible para garantizar el análisis estadístico, es decir, varios filamentos en posición vertical.

En comparación con otros métodos, donde se pueden llevar a cabo estudios de células individuales en sistemas microfluídicos, nuestro método es más fácil, más rápido y más barato, requiriendo solo materiales y reactivos que están fácilmente disponibles en cualquier laboratorio. Por otro lado, aunque los sistemas microfluídicos están siendo ampliamente utilizados en estudios de cianobacterias multicelulares, hasta donde sabemos no han resuelto el problema del posicionamiento celular en posición vertical¹².

Una limitación de la técnica es que la orientación no siempre es perfecta. Esto se debe a que hemos visto filamentos inclinados en la matriz de agarosa, sin embargo, con el cribado anterior utilizando señal de autofluorescencia es posible identificar este artefacto. Además, no pudimos visualizar un evento de división completo, porque este protocolo permite la visualización del sitio de división hasta 1 hora, mientras que el tiempo de división de Anabaena sp. es de alrededor de 12 horas. Sin embargo, este protocolo puede ser útil para registrar un evento de división completa en bacterias de rápido crecimiento.

Aunque nuestro método fue estandarizado para Anabaena sp. se puede aplicar a todas las cianobacterias filamentosas u organismos filamentosos, para estudiar no solo FtsZ sino también otras proteínas asociadas con el divisoma ya que estarán orientadas en el mismo plano XY.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml syringe	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.
Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block	CORNING	THERM-1001	The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.
Low Melting Point agarose	Promega	V3841	Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.
LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan	Zeiss	-	The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.
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