Summary
该协议描述了模块化可控微型设备系统的开发，该系统可用于海珊瑚的长期养殖和监测。
Abstract
珊瑚是海洋和沿海生态系统中的基本生物。近年来，随着珊瑚保护研究的进步，对珊瑚养殖环境的精确控制对珊瑚保护和研究的需求越来越大。在这里，我们开发了一种半封闭的珊瑚养殖微器件系统作为多功能平台，可以提供精确可编程的温度控制、无菌的初始环境、长期稳定的水质、可调节的溶解氧浓度以及为珊瑚定制的光谱。由于采用模块化设计，珊瑚养殖系统可以通过安装所需的新模块或移除现有模块来升级或修改。目前，在适当的条件下和适当的系统维护下，样本珊瑚可以在健康状态下存活至少 30 天。此外，由于可控和无菌的初始环境，这种珊瑚养殖系统可以支持对珊瑚与相关微生物之间共生关系的研究。因此，这种微型设备系统可以应用于以相对定量的方式监测和研究海珊瑚。
Introduction
在过去的70年里，珊瑚礁生态系统的恶化一直在世界范围内发生。考虑到中美洲1、东南亚2、3、4、5、6、澳大利亚 7、8 和东非9 的所有主要珊瑚区，自 1950 年代以来，全球珊瑚礁覆盖率已减半10.珊瑚礁的大规模丧失导致了生态和经济问题。例如，通过追踪 8 年来各种依赖珊瑚的鱼类的存在/不存在和丰度，研究人员得出结论，珊瑚的减少直接导致巴布亚新几内亚鱼类生物多样性和丰度大幅下降11.这一结果证明，珊瑚数量减少不仅会破坏珊瑚礁生物系统，还会减少渔业收入。
经过几十年的实地调查，包括直接监测、遥感和数据比较，科学界已经确定了导致大规模珊瑚数量下降的几个因素。珊瑚大规模减少的一个主要原因是海水温度高引起的珊瑚白化12,13。通过结合白化和气象记录，科学家们得出结论，在厄尔尼诺-南方涛动阶段14中，珊瑚白化更频繁地发生。珊瑚数量减少的另一个原因是海洋酸化。由于大气和海水中的 CO2 浓度增加，碳酸钙的溶解速度比以前快，导致净珊瑚礁钙化15。事实上，已经得出的结论是，当大气中的 CO2 浓度达到 500 ppm 以上时，数千万人将遭受痛苦，珊瑚礁将面临严重恶化和共生分离的风险16,17。还有其他因素也会影响珊瑚的生存，例如导致或加速珊瑚衰退的近海污染物。夏威夷的研究人员测量了珊瑚中的碳、氧和氮同位素，以及溶解的无机碳酸盐和相关营养物质（NH4+、PO43-、NO2-和NO3-），并得出结论，来自陆地的污染放大了珊瑚的沿海酸化和生物侵蚀18.除了污染之外，城市化还危及珊瑚的生存，并导致珊瑚的建筑复杂性相对较低，正如一项对新加坡、雅加达、香港和冲绳珊瑚生存状况的研究所揭示的那样。因此，人为压力因素的影响和气候变化的叠加影响正在导致珊瑚礁生物多样性的广泛减少，以及珊瑚生态功能和复原力的下降19。
还应该注意的是，大量的微生物参与珊瑚的生理功能，包括固氮、几丁质分解、有机化合物的合成和免疫20，因此，在考虑珊瑚礁退化时，应将这些微生物包括在内。在珊瑚礁等自然环境中，许多因素会导致缺氧或缺氧状况，包括水循环不足、藻类渗出物和藻类过度生长。这种现象对珊瑚和珊瑚相关微生物的种群分布产生了负面影响。例如，越南科学家发现，在芽庄、富国岛和乌戎格拉姆，珊瑚 鹿角藻中的 细菌组成可能受到不同位置溶解氧的影响21。美国的研究人员探索了珊瑚的缺氧或缺氧条件，发现藻类渗出物可以介导微生物活动，导致局部缺氧条件，这可能导致附近的珊瑚死亡。他们还发现，珊瑚可以忍受降低的氧气浓度，但只能超过由暴露时间和氧气浓度22共同确定的给定阈值。印度的研究人员发现，当 夜 光藻类大量繁殖时，溶解氧降至2毫克/升，低于此浓度，约70%的 鹿角 藻因缺氧条件而死亡23。
上述所有事实和因素都表明，环境变化导致珊瑚礁的恶化。为了在一定条件下对珊瑚礁进行养殖和研究，准确、全面地构建珊瑚礁栖息的可控微观环境非常重要。通常，科学家关注温度、光线、水流和营养物质。然而，其他特征，如海水中的溶解氧浓度、微生物丰度和微生物多样性，通常被忽视。为此，我们小组探索了在相对受控的环境中应用小型设备培养珊瑚虫的可能性24,25。在这项工作中，我们设计并建立了一个用于珊瑚养殖的模块化微型设备系统。这种模块化微器件系统可以在温度、光谱、溶解氧浓度、营养物质、微生物等方面提供可控的微环境，并具有扩展和升级的能力。
设备的模块和功能
微型设备系统的灵感来自柏林系统26，但目前的系统中没有使用活石。 如图1所示，目前的系统包括六个主要模块，两个无刷电机泵，一个气泵，一个流通式紫外灯，一个电源，某些电子控制元件以及相关的电线和螺钉。六个主要模块包括海水储存模块（带气泵和温度传感器）、温度控制模块、藻类净化模块、微生物净化模块、活性炭净化模块和珊瑚养殖模块。
设备架构
如图 2 和图 3 所示，整个微器件系统可以水平分为两个隔间，中间有一个温度控制模块。出于安全考虑，所有含海水的模块和部件都放置在左侧隔间中，称为培养隔间。其他电子部件放置在右侧隔间内，称为电子隔间。两个隔间都密封或包装在外壳内。温度控制模块固定在中间的分隔板中。培养室的外壳包括一个踢脚板和三个螺钉固定板。这种设计确保了隔间的密封性，并促进了系统的运行。此外，密封性有利于精确的温度控制。电子隔间的外壳包括一个踢脚线、两个螺丝固定板和一个前控制面板。
水循环
预先设计了与海水储存模块相连的内外海水循环回路。内循环回路成功连接海水储存模块、温控模块、流通式紫外灯、藻类净化模块、微生物净化模块。该循环回路旨在为珊瑚提供合适的理化生理和生理海水条件，无需经常维护。藻类净化模块含有 毛壳藻 ，可吸收水中多余的营养物质（硝酸盐和磷酸盐）。微生物净化模块包含细菌培养基质，培养微生物组，将亚硝酸盐和铵转化为硝酸盐进行水净化。所有这些模块只有在危急情况下才需要更换。
外循环回路依次连接海水储存模块、珊瑚养殖模块、活性炭模块。该循环回路旨在为珊瑚提供光线、密封性、水流和高海水质量。海水可以通过进水口和出水口进行刷新。添加剂通过三通阀添加，海水样品也可以从该阀中提取进行检查。空气可以通过进气口泵入，也可以从出风口排出。
电子设计
整个系统使用带有开关和保险丝的 220 V 交流电源。输入功率分为四个分支。第一个分支是 12 V 直流电源，直接为加热板、冷却板和冷却风扇供电。该分支还通过四通道直流变压器间接为两个泵和两个照明面板供电。第二个分支进入 PID 温度控制器。第三个分支是气泵电源。最后一个分支连接到UV灯电源。固态继电器连接PID温度控制器和温度控制模块中的冷却面板。常规继电器用于连接PID温度控制器和加热面板。四通道直流变压器将电压转换为所需的电压。
系统右侧有两个控制面板。顶部面板上有四个用于UV灯的开关和一个控制器，包括一个主电源开关、一个UV灯电源开关、一个气泵开关和一个温度控制开关。主电源开关控制系统的 12 V 电源。
PID温度控制器、周期定时器、四通道直流变压器和三通道定时器位于前面板上。PID温控器通过控制温控模块中的加热和冷却面板来调节水温。温控模块 仅在 内循环泵工作且水流过温控模块时才工作。循环计时器连接到气泵电源线。其目的是为气泵分配工作时间段。电子隔间中还部署了一个三通道定时器。该定时器控制气泵、珊瑚灯和藻类灯的工作时间段。
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Protocol
用于本研究的珊瑚是在我们的实验室培养的 Seriatopora caliendrum。所有珊瑚均由中国科学院大学南海海洋研究所友情提供。
1.检查和启动
注意： 在组装系统之前，必须单独测试每个模块的密封性和功能。应使用去离子水来测试模块的密封性。所有模块组件的商业细节在 材料表中提供。
- 模块间连接的密封性测试
- 连接所有模块和泵（图 1），并确保水在系统上循环流动至少 30 分钟。
- 检查所有接缝是否有可能的泄漏问题。如果任何粘接缝发生泄漏，请从外部涂抹粘接胶。如果任何连接缝出现泄漏，请再次拧紧连接，并检查是否需要更换密封垫片。
- 装载
- 密封性测试后，将里面的水排空并擦干。
- 加载相应的内容。
注：例如，将细菌培养基质加载到微生物纯化模块中， 将毛壳 藻加载到藻类纯化模块中。
- 组装和测试整个系统
- 加载后，使用螺钉将模块固定在踢脚板上。
- 将内循环模块与外循环模块连接（不带珊瑚养殖模块）。
- 对于海水灌注，通过海水储存模块中的进水口注入海水。当水位高于泵的进水口3厘米时，打开水泵，继续注入海水，直到内循环模块充满海水，海水储存模块中有空气空间（3厘米高）。
注意： 海水是使用纯水和海盐制备的（参见 材料表）。
- 系统测试
- 打开所有开关并将两个海水泵电压设置为 9 V，将水温设置为 25 °C。
- 将循环计时器设置为“1 分钟开启和 1 分钟关闭”。将三通道定时器的所有三个通道都设置为“上午 9：00 开启”和“下午 5：00 关闭”。
- 监控系统至少 24 小时是否有任何故障。如果未发现问题，则系统已准备好进行下一步操作。
注意： 清除除海水存储模块外的所有模块中的所有气泡非常重要。整个系统可以稍微抬起和摇晃，将气泡从模块入口移动到出口。
2. 微生物环境的建立
注意：在珊瑚移植之前，建立对珊瑚友好的微生物环境是必要的。为了培养系统中的微生物，特别是在微生物纯化模块中，应添加稀释后的益生菌溶液作为硝化系统的微生物源。
- 添加微生物组来源
- 搅拌下将 1 mL 商业微生物组源溶液（参见 材料表）加入 500 mL 海水中。
- 将 50 mL 的上述稀释溶液和 10 μL 的商业珊瑚营养溶液（见 材料表）注入循环系统。
- 微生物组培养
- 打开内循环泵和气泵，将微生物组培养 21 天。微生物组的氧含量要求决定了气泵的开启时间和关闭时间比例。
注意：此步骤旨在培养海水净化微生物组并促进系统中对珊瑚有益的微生物组的生长。在这个过程中，从微生物组注射后的第二天到第四天，海水开始变得浑浊。经过这个微生物组培养过程，应建立系统中的营养降解能力。需要注意的是，为了满足不同的实验要求，可以使用不同的微生物组来源来建立微生物组环境。
- 打开内循环泵和气泵，将微生物组培养 21 天。微生物组的氧含量要求决定了气泵的开启时间和关闭时间比例。
3. 珊瑚移植和生长
- 珊瑚移植
- 切割长度为3-5厘米的原始珊瑚树枝，然后将这些珊瑚树枝粘附在3D打印的珊瑚支撑底座上（补充编码文件1）。
- 将这些珊瑚树枝样本放回原来的海水箱中至少 7 天以进行回收。
- 用胶水将珊瑚支撑底座固定在旋转装置上。组装珊瑚养殖模块，并将其连接到外循环回路。
- 对珊瑚生长进行成像
注意：需要获取随时间变化的珊瑚图像以评估珊瑚的生长。使用可拆卸的连接可以方便地从整个系统中取出珊瑚养殖模块进行成像。为此，建造了一个具有适当照明条件的迷你照相馆。带有微距镜头的相机（见 材料表）用于捕捉不同时期的珊瑚表面形态。养殖模块中的珊瑚旋转单元可以使用非接触模式在模块外操作。通过旋转模块附近的磁性手柄，可以捕捉到全角度的珊瑚图像。- 将相机放在工作室的顶部，然后从垂直角度拍摄图像。
- 将珊瑚养殖模块放在迷你照相馆中，珊瑚位于中心和底部。
- 通过旋转外部手柄来捕捉珊瑚图像。
注意：出于珊瑚生存的原因，成像的时间段应限制在 15 分钟。
4.系统日常维护
注意： 日常维护包括泄漏检查、故障检查、添加剂添加和海水交换。
- 泄漏检测
- 检查踢脚线是否有水渍或水滴。由于系统的盖壳是透明的，因此目视检查漏水既简单又方便。这种检查必须每天进行。
- 故障检查
- 确保此步骤包括检查水温、泵、光电压、气泵状态和定时器状态，包括目视检查和记录设定的水温、实时温度、变压器输出电压tage、紫外线灯设置、定时器工作状态。这种检查应该每天进行。
注意： 某些系统故障可以根据异常声音或异常温度进行诊断。
- 确保此步骤包括检查水温、泵、光电压、气泵状态和定时器状态，包括目视检查和记录设定的水温、实时温度、变压器输出电压tage、紫外线灯设置、定时器工作状态。这种检查应该每天进行。
- 添加剂添加
注：添加剂添加是将营养物质和其他试剂添加到系统中的过程。- 例如，使用注射器从活性炭模块和海水模块之间的三通阀中提取 10 mL 海水。
- 将添加剂溶解在提取的海水中。
- 通过三通阀将溶液注入系统。在实际案例中，添加剂的种类、数量和添加频率由系统海水水质决定，并考虑实验要求。
- 水交换
注：常规换水可以减少培养系统中的毒性浓度和富营养化。如果实验条件允许，交换海水可以是常规操作。- 出于安全原因，请关闭整个系统的电源，并拔下电源线。
- 取下珊瑚养殖模块。
- 将外部废水管道连接到海水储存模块中的出口。
- 旋转系统，然后将系统正面朝下放置。
- 打开插座。让内部海水流出系统。
注意： 请勿使用任何泵将水抽出，因为内部负压可能会损坏系统。 - 排出适量海水，并关闭出水口。排出的海水量由珊瑚的生理状态决定。
- 重置系统，将新制备的海水通过进水口注入系统。
- 将珊瑚养殖模块安装回系统中。
- 打开系统电源，等待整个系统恢复正常。
5. 模块更换
注意：如果由于故障或根据实验安排需要更换任何模块，请务必在不暂停或对培养实验产生负面影响的情况下更换模块。
- 对于海水储存模块、藻类净化模块、微生物净化模块或活性炭净化模块，关闭内循环泵，松开模块的固定螺丝。
- 断开两个连接模块之间的管道，并将要更换的模块从系统中拆卸。最后一步是通过连接管道并重新拧紧固定螺钉将新模块组装到系统中。
注意： 温度控制模块的更换在某种程度上有所不同。首先，需要将所有电线从模块上断开。然后拧下固定螺栓，断开管道。然后，拆卸加热面板，并将模块从系统中拆卸。温度控制模块的安装过程是相反的过程。
6. 关闭系统并将系统恢复到初始状态
注意：在必要的珊瑚养殖实验后，系统最终将关闭。系统需要恢复到其原始状态。
- 关闭系统
- 关闭系统电源，然后拔下电源线。
- 排空系统内的海水。
- 按以下顺序拆卸模块：珊瑚养殖模块、活性炭净化模块、海水储存模块、藻类净化模块、微生物净化模块、紫外线灯、两个循环泵、温控模块。
- 系统恢复
- 用纯水和表面活性剂清洁所有模块（参见 材料表）。
- 用 3% 过氧化氢溶液对模块进行灭菌。
注意： 请勿使用任何有机溶剂清洗模块。 - 将模块在40°C下干燥12小时。确保系统内的所有水都蒸发掉。
- 使用相同的表面活性剂清洁所有管道和阀门。
7. 微生物环境受控改造
注：除了珊瑚培养实验外，对于某些特殊实验，例如在系统中获取受控的微生物环境，必须严格控制微生物组的种类和丰度。我们的珊瑚养殖系统最具创新性的特点是，珊瑚的生理活动可以在相对封闭的微生态系统中的特定微生物环境中进行探索。执行此功能需要不同的操作程序。
- 预灭菌
- 在组装系统之前，使用 3% 的过氧化氢溶液对所有模块、管道和阀门进行消毒。
- 通过高压灭菌对细菌培养基质进行灭菌。
- 用75%乙醇溶液灭菌 Chaetomorpha 藻类，并用无菌纸干燥。
- 系统改造和灭菌
- 组装系统时，在气泵和海水储存模块之间添加空气消毒过滤器（参见 材料表）。
- 在进水口和三通阀之间加一个水杀菌过滤器。此步骤可确保注入系统的空气和水得到消毒。
- 将臭氧引入系统以消除残留的微生物组。
- 用无菌海水洗掉剩余的消毒剂三次，将无菌海水注入系统。
- 仅为了建立微生物环境，通过出水口注入微生物组源溶液。
注意： 请勿 使用进水口注入微生物组源。其他试剂和海水仍通过进水口注入。
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Representative Results
温度控制精度
系统温度通常设置为 23-28 °C，具体取决于珊瑚种类。然而，作为最重要的因素之一，温度波动会强烈影响珊瑚的生存。因此，温度控制精度是珊瑚养殖系统的决定性因素。温度传感器和独立数据采集器的温度范围为9°C至32°C，可用于测试珊瑚养殖模块中的温度控制精度。我们将系统海水温度设置为24°C，并同时测量海水和室温。 如图4所示，红色曲线代表测得的室温波动，黑色曲线代表珊瑚养殖模块中测得的海水温度波动。在14 h内，测得的平均温度为23.8 °C，标准差为0.1 °C。 系统海水温度控制比较准确。
珊瑚养殖结果
通常，当环境条件满足珊瑚的生存要求时，健康的珊瑚会自由伸出触手， 如图5所示。该标准通常验证珊瑚的状态，并可用于检查环境压力源。 如图5B所示，样本珊瑚的触手延伸了1个月以上而没有受到干扰。这表明该系统在很长一段时间内为珊瑚提供了合适的生存环境。这个培养时间段应该足够长，可以进行实验室中的大多数珊瑚实验和化验。从 图5 中也可以看出，通过对珊瑚生长过程进行成像进行形态学分析是可行的。
图 1：微器件系统的模块连接原理图。圆角矩形表示模块或泵;箭头线表示水或空气管道。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：微型设备系统的前视图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：微型设备系统的顶视图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：海水温度控制实验结果。 红色曲线：室温波动;黑色曲线：测量系统海水温度波动。系统设定温度为24°C。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：带有放大珊瑚图像的珊瑚养殖模块。 （A） 为了进行比较，四个珊瑚位于相应的支撑底座上，珊瑚养殖模块中有一个空的珊瑚。（B） 珊瑚 Seriatopora caliendrum 的放大珊瑚图像。请点击这里查看此图的较大版本.
补充编码文件1：珊瑚支撑底座的3D打印设计。请点击这里下载此文件。
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Discussion
该珊瑚养殖系统旨在模拟和提供相对自然或定制的微环境，供珊瑚移植和生存。同时，作为自主研发的设备，该系统需要可靠、人性化、安全。例如，在温度控制方面，应根据日常环境情况适当控制海水温度。该系统通过培养珊瑚 1 个月进行了测试，证实了系统的可靠性。
与普通的海水缸或水族箱26相比，根据我们的珊瑚养殖实验，在设置了养殖参数/条件后，包括添加剂配方、换水计划、循环速度（泵功率或电压）、照明强度、气泵开关时间比例和照明时间，日常服务和操作的时间少于10分钟。此外，在此期间没有发生漏电、短路、过载或其他事故，证明了系统的用户友好性和安全性。
但是，应该注意的是，系统检查、启动、珊瑚移植/成像和日常维护是协议中必不可少的关键步骤。设备内部漏水和设备部件老化可能是在相对较长的时间内可能发生的两个问题。想要复制此系统的受众必须注意这些问题。
从人工微生态系统的角度来看，这个模块化平台可以被赋予在实验室而不是野外的可控环境中研究珊瑚相关微生物组的能力，从而证明其可扩展性和成本效益。因此，预计这种珊瑚养殖系统将有助于和加速与珊瑚相关的研究。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
本研究得到国家重点发展的基础研究计划（2021YFC3100502）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12V DC power supply | Delixi Electric Co., Ltd. | CDKU-S150W | 12V12.5A |
| 3% hydrogen peroxide solution | Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd | NULL | NULL |
| 75% ethanol solution | Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd | NULL | NULL |
| Air pump | Chongyoujia Supply Chain Management Co., Ltd. | NHY-001 | NULL |
| Air sterilizing filter | Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd | S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-A | NULL |
| Camera | SONY | Α7r4-ILCE-76M4A | NULL |
| Coral nutrition solution | Red Sea Aquatics Co., Ltd. | 22101 | Coral nutrition |
| Coral pro salt (sea salt) | Red Sea Aquatics Co., Ltd. | R11231 | NULL |
| Cycle timer | Leqing Shangjin Instrument Equipment Co., Ltd. | CN102A | 220V version |
| Double closed quick connector | JOSOT Co., Ltd | NL4-2103T | NULL |
| Flow-through UV lamp | Zhongshan Xinsheng Electronic technology Co., Ltd. | 211 | NULL |
| Four-channel transformer | Dongguan Shanggushidai Electronic Technology Co., Ltd | LM2596 | NULL |
| Macro lens | SONY | FE 90mm F2.8 Macro G OSS | NULL |
| Microbiome source solution | Guangzhou BIOZYM Microbial Technology Co., Ltd. | 303 | NULL |
| Mini-photo studio | Shaoxing Shangyu Photography Equipment Factory | CM-45 | NULL |
| PID temperature controller | Guangdong Dongqi Electric Co., Ltd. | TE9-SC18W | SSR version |
| Pump (for water) | Zhongxiang Pump Co., Ltd. | ZX43D | Seaswater version |
| Pure water machine | Kemflo (Nanjing) environmental technology Co, ltd | kemflo A600 | NULL |
| Solid-state relay | Delixi Electric Co., Ltd. | DD25A | NULL |
| Surface active agents | Guangzhou Liby Group Co., Ltd. | Libai detergent | NULL |
| Three-channel timer | Leqing Changhong Intelligent Technology Co., Ltd. | CHE325-3 | 220V version |
| Water sterilizing filter | Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd | S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-L | NULL |
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