Summary
Bu protokol, deniz mercanlarının uzun süreli kültürlenmesi ve izlenmesi için uygulanabilecek modüler kontrol edilebilir bir mikro cihaz sisteminin geliştirilmesini açıklamaktadır.
Abstract
Mercanlar, deniz ve kıyı ekosistemlerinde temel organizmalardır. Son yıllarda mercan koruma araştırmalarının ilerlemesiyle birlikte, mercan kültürü ortamının hassas kontrolü, mercan koruma ve çalışma için oldukça talep görmektedir. Burada, doğru ve programlanabilir sıcaklık kontrolü, steril bir başlangıç ortamı, uzun vadeli istikrarlı su kalitesi, ayarlanabilir çözünmüş oksijen konsantrasyonu ve mercanlar için özelleştirilmiş bir ışık spektrumu sağlayabilen çok işlevli bir platform olarak yarı kapalı bir mercan kültürü mikro cihaz sistemi geliştirdik. Modüler tasarım sayesinde, mercan kültürü sistemi, istenen yeni modüller takılarak veya mevcut modüller çıkarılarak yükseltilebilir veya değiştirilebilir. Şu anda, uygun koşullar altında ve uygun sistem bakımı ile, örnek mercanlar sağlıklı bir durumda en az 30 gün hayatta kalabilir. Ayrıca, kontrol edilebilir ve steril başlangıç ortamı nedeniyle, bu mercan kültürü sistemi, mercanlar ve ilişkili mikroorganizmalar arasındaki simbiyotik ilişkiye yönelik araştırmaları destekleyebilir. Bu nedenle, bu mikro cihaz sistemi, deniz mercanlarını nispeten nicel bir şekilde izlemek ve araştırmak için uygulanabilir.
Introduction
Mercan resifi ekosistemlerinin bozulması son 70 yılda dünya çapında meydana gelmektedir. Orta Amerika 1, Güneydoğu Asya 2,3,4,5,6, Avustralya 7,8 ve Doğu Afrika9'daki tüm büyük mercan alanları göz önüne alındığında, mercan resiflerinin küresel kapsamı 1950'lerden bu yana yarı yarıya azalmıştır10. Mercan resiflerinin bu kitlesel kaybı, ekolojik ve ekonomik sorunlara neden olmuştur. Örneğin, araştırmacılar 8 yıl boyunca mercanlara bağımlı her türlü balığın varlığını/yokluğunu ve bolluğunu izleyerek, mercan düşüşünün doğrudan Papua Yeni Gine'deki balık biyoçeşitliliğinde ve bolluğunda önemli bir azalmaya neden olduğu sonucuna vardılar11. Bu sonuç, mercanların azalmasının sadece mercan resiflerine dayalı biyolojik sistemleri baltalamakla kalmayıp aynı zamanda balıkçılık gelirlerini de azaltabileceğini kanıtladı.
Doğrudan izleme, uzaktan algılama ve veri karşılaştırması da dahil olmak üzere onlarca yıllık saha araştırmaları, bilim camiası, kitlesel mercan düşüşüne neden olan çeşitli faktörleri belirledi. Kitlesel mercan düşüşünün önemli bir nedeni, yüksek deniz suyu sıcaklıklarının neden olduğu mercan ağarmasıdır12,13. Bilim adamları, ağartma ve meteorolojik kayıtları birleştirerek, mercan ağartmasının El Niño-Güney Salınım fazları14'te daha sık meydana geldiği sonucuna vardılar. Mercan düşüşünün bir başka nedeni de okyanus asitlenmesidir. Hem atmosferde hem de deniz suyunda artanCO2 konsantrasyonu nedeniyle, kalsiyum karbonat eskisinden daha hızlı çözünür ve küçük ölçekli net mercan resifi kalsifikasyonuna neden olur15. Nitekim atmosferdeki CO2 konsantrasyonu 500 ppm'nin üzerine çıktığında on milyonlarca insanın zarar göreceği ve mercan resiflerinin önemli ölçüde bozulma ve simbiyodinyum dekolmanı riski altında olacağı sonucuna varılmıştır16,17. Kıyı kirleticilerinin mercan azalmasına neden olması veya hızlanması gibi mercanların hayatta kalmasını etkileyebilecek başka faktörler de vardır. Hawaii'deki araştırmacılar, çözünmüş inorganik karbonat ve ilgili besin maddeleri (NH 4 +, PO4 3-, NO2 − ve NO3 −) ile birlikte mercanlardaki karbon, oksijen ve azot izotoplarını ölçtüler ve karadan kaynaklanan kirliliğin mercanların kıyı asitlenmesini ve biyolojik erozyonunu büyüttüğü sonucuna vardılar 18. Kirliliğe ek olarak, kentleşme mercanların hayatta kalmasını da tehlikeye atıyor ve Singapur, Jakarta, Hong Kong ve Okinawa'daki mercanların hayatta kalma durumu üzerine yapılan bir çalışmanın ortaya koyduğu gibi mercanlarda nispeten düşük mimari karmaşıklığa neden oluyor. Bu nedenle, antropojenik stres faktörlerinin etkisi ve iklim değişikliğinin üst üste binen etkileri, mercan resifleri üzerindeki biyolojik çeşitliliğin yaygın olarak azalmasına ve buna bağlı olarak mercan ekolojik işlevinde ve esnekliğinde bir düşüşe yol açmaktadır19.
Ayrıca, azot fiksasyonu, kitin ayrışması, organik bileşiklerin sentezi ve bağışıklık20 dahil olmak üzere mercanların fizyolojik işlevlerine çok sayıda mikroorganizmanın katıldığı ve bu mikroorganizmaların mercan resiflerinin bozulması göz önüne alındığında dahil edilmesi gerektiği belirtilmelidir. Mercan resifleri gibi doğal ortamlarda, yetersiz su sirkülasyonu, alg eksüdası ve alg aşırı büyümesi dahil olmak üzere birçok faktör hipoksik veya anoksik koşullara neden olur. Bu fenomen, mercan ve mercanlarla ilgili mikroorganizmaların popülasyon dağılımlarını olumsuz yönde etkilemektedir. Örneğin, Vietnamlı bilim adamları, Nha Trang, Phu Quoc ve Ujung Gelam'da, mercan Acropora Formosa'daki bakteri bileşiminin farklı yerlerde çözünmüş oksijenden etkilenebileceğini buldular21. Amerika Birleşik Devletleri'ndeki araştırmacılar, mercanlardaki hipoksik veya anoksi koşullarını araştırdılar ve alg eksüdalarının mikrobiyal aktiviteye aracılık edebildiğini ve yakın çevrede mercan ölümlerine neden olabilecek lokalize hipoksik koşullara yol açabildiğini buldular. Ayrıca, mercanların azaltılmış oksijen konsantrasyonlarını tolere edebildiğini, ancak yalnızca maruz kalma süresi ve oksijen konsantrasyonunun bir kombinasyonu ile belirlenen belirli bir eşiğin üzerinde22 bulundu. Hindistan'daki araştırmacılar, Noctiluca scintillans algleri çiçek açtığında, çözünmüş oksijenin 2 mg / L'ye düştüğünü buldular. Bu konsantrasyonun altında, Acropora montiporacan'ın yaklaşık% 70'i hipoksik koşullar nedeniyle öldü23.
Yukarıda belirtilen tüm gerçekler ve faktörler, çevresel değişimin mercan resiflerinin bozulmasına yol açtığını göstermektedir. Resif mercanlarını belirli koşullar altında kültürlemek ve incelemek için, resif mercanlarının yaşaması için kontrol edilebilir bir mikroskobik ortamı doğru ve kapsamlı bir şekilde oluşturmak önemlidir. Normalde, bilim adamları sıcaklık, ışık, su akışı ve besinlere odaklanır. Bununla birlikte, deniz suyundaki çözünmüş oksijen konsantrasyonu, mikroorganizma bolluğu ve mikroorganizma çeşitliliği gibi diğer özellikler genellikle göz ardı edilir. Bu amaçla, grubumuz nispeten kontrollü bir ortamda mercan poliplerini kültürlemek için küçük ekipman uygulama olasılığını araştırmıştır24,25. Bu çalışmada, mercan kültürü için modüler bir mikro cihaz sistemi tasarladık ve kurduk. Bu modüler mikro cihaz sistemi, sıcaklık, ışık spektrumu, çözünmüş oksijen konsantrasyonu, besinler ve mikroorganizmalar vb. açısından kontrol edilebilir bir mikro ortam sağlayabilir ve genişletme ve yükseltme kapasitesine sahiptir.
Cihazın modülleri ve işlevleri
Mikro cihaz sistemiBerlin sistemi 26'dan esinlenmiştir, ancak mevcut sistemde canlı kaya kullanılmamaktadır. Şekil 1'de gösterildiği gibi, mevcut sistem altı ana modül, iki fırçasız motor pompası, bir gaz pompası, bir akışlı UV lambası, bir güç kaynağı, belirli elektronik kontrol bileşenleri ve ilgili teller ve vidalardan oluşur. Altı ana modül, bir deniz suyu deposu modülü (bir hava pompası ve sıcaklık sensörü ile), bir sıcaklık kontrol modülü, bir yosun arıtma modülü, bir mikrobiyal arıtma modülü, bir aktif kömür arıtma modülü ve bir mercan kültürü modülü içerir.
Cihaz mimarisi
Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterildiği gibi, genel mikro cihaz sistemi, aralarında bir sıcaklık kontrol modülü bulunan yatay olarak iki bölmeye ayrılabilir. Güvenlik nedeniyle, deniz suyu içeren tüm modüller ve parçalar, kültür bölmesi adı verilen sol bölmeye yerleştirilmiştir. Diğer elektronik parçalar, elektronik bölme adı verilen sağ bölmeye yerleştirilir. Her iki bölme de kabuklar içinde mühürlenir veya paketlenir. Sıcaklık kontrol modülü, aradaki bir bölücü plakaya sabitlenmiştir. Kültür bölmesinin kabuğu bir süpürgelik ve üç vida sabitleme plakası içerir. Bu tasarım, bölme sızdırmazlığını sağlar ve sistemin çalışmasını kolaylaştırır. Ek olarak, sızdırmazlık, doğru sıcaklık kontrolünü destekler. Elektronik bölmenin kabuğu bir süpürgelik, iki vidalama plakası ve bir ön kontrol paneli içerir.
Su sirkülasyonu
Deniz suyu deposu modülüne bağlı bir iç ve dış deniz suyu sirkülasyon döngüsü önceden tasarlanmıştır. İç sirkülasyon döngüsü, deniz suyu deposu modülünü, sıcaklık kontrol modülünü, akışlı UV lambasını, yosun arıtma modülünü ve mikrobiyal arıtma modülünü başarıyla bağlar. Bu sirkülasyon döngüsü, mercanlar için uygun fizyokimyasal ve fizyolojik deniz suyu koşullarını sağlamayı amaçlar ve sık bakım gerektirmez. Yosun arıtma modülü, sudaki ekstra besin maddelerini (nitrat ve fosfat) emen Chaetomorpha yosunu içerir. Mikrobiyal saflaştırma modülü, nitrit ve amonyumun su arıtımı için nitrata aktarılması için mikrobiyomu geliştiren bakteri kültürü substratını içerir. Tüm bu modüllerin yalnızca kritik koşullar altında değiştirilmesi gerekir.
Dış sirkülasyon döngüsü, deniz suyu deposu modülünü, mercan kültürü modülünü ve aktif kömür modülünü art arda birbirine bağlar. Bu sirkülasyon döngüsü, mercanlara ışık, sızdırmazlık, su akımı ve yüksek deniz suyu kalitesi sağlamayı amaçlamaktadır. Deniz suyu, bir su girişi ve bir su çıkışı ile yenilenebilir. Katkı maddeleri üç bir vana aracılığıyla eklenir ve deniz suyu numunesi de inceleme için bu vanadan çıkarılabilir. Hava, bir hava girişinden pompalanabilir ve bir hava çıkışından boşaltılabilir.
Elektronik tasarım
Tüm sistem için anahtarlı ve sigortalı 220 V AC güç kaynağı kullanılır. Giriş gücü dört şubeye ayrılmıştır. İlk dal, ısıtma paneline, soğutma paneline ve soğutma fanına doğrudan güç sağlayan 12 V DC güç kaynağına gider. Bu dal aynı zamanda dört kanallı bir DC transformatör aracılığıyla dolaylı olarak iki pompaya ve iki aydınlatma paneline güç sağlar. İkinci dal bir PID sıcaklık kontrol cihazına gider. Üçüncü şube bir hava pompası güç kaynağına gider. Son dal bir UV lamba güç kaynağına bağlanır. Katı hal rölesi, PID sıcaklık kontrol cihazını ve sıcaklık kontrol modülündeki soğutma panelini birbirine bağlar. PID sıcaklık kontrol cihazını ve ısıtma panelini bağlamak için normal bir röle kullanılır. Dört kanallı DC transformatör, voltajı gerekli olana dönüştürür.
Sistemin sağ tarafında iki adet kontrol paneli bulunmaktadır. Üst panelde UV lambası için bir ana güç anahtarı, bir UV lambası güç anahtarı, bir hava pompası anahtarı ve bir sıcaklık kontrol anahtarı dahil olmak üzere dört anahtar ve bir kontrolör vardır. Ana güç anahtarı, sistemin 12 V güç kaynağını kontrol eder.
Ön panelde bir PID sıcaklık kontrolörü, bir döngü zamanlayıcısı, dört kanallı bir DC transformatörü ve üç kanallı bir zamanlayıcı bulunur. PID sıcaklık kontrol cihazı, sıcaklık kontrol modülündeki ısıtma ve soğutma panellerini kontrol ederek su sıcaklığını ayarlar. Sıcaklık kontrol modülü yalnızca iç sirkülasyon pompası çalışırken ve su sıcaklık kontrol modülünden geçerken çalışır. Döngü zamanlayıcısı, hava pompası güç hattına bağlanır. Amacı, çalışma süresini hava pompasına atamaktır. Elektronik bölmede de üç kanallı bir zamanlayıcı var. Bu zamanlayıcı, hava pompası, mercan ışığı ve yosun ışığı için çalışma süresini kontrol eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma için kullanılan mercanlar, laboratuvarımızda kültürlenen Seriatopora caliendrum idi. Tüm mercanlar, Çin Bilimler Akademisi Üniversitesi, Güney Çin Denizi Oşinoloji Enstitüsü tarafından sağlandı.
1. Muayene ve devreye alma
NOT: Sistemi monte etmeden önce her modülün sızdırmazlığı ve işlevi ayrı ayrı test edilmelidir. Modülün sızdırmazlığını test etmek için deiyonize su kullanılmalıdır. Tüm modül bileşenlerinin ticari detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.
- Modüller arası bağlantının sızdırmazlık testi
- Tüm modülleri ve pompaları bağlayın (Şekil 1) ve suyun en az 30 dakika boyunca sistem üzerinde dairesel olarak akmasını sağlayın.
- Olası sızıntı sorunları için tüm dikişleri kontrol edin. Yapıştırma dikişlerinden herhangi birinde herhangi bir sızıntı meydana gelirse, dışarıdan yapıştırma yapıştırıcısı uygulayın. Bağlantı dikişlerinden herhangi birinde herhangi bir sızıntı meydana gelirse, bağlantıyı tekrar sıkın ve sızdırmazlık contasının değiştirilmesi gerekip gerekmediğini kontrol edin.
- Yükleme
- Sızdırmazlık testinden sonra içindeki suyu boşaltın ve kurutun.
- Uygun içerikleri yükleyin.
NOT: Örneğin, bakteri kültürü substratı mikrobiyal saflaştırma modülüne yüklenir ve Chaetomorpha Algleri alg saflaştırma modülüne yüklenir.
- Tüm sistemin montajı ve test edilmesi
- Yükledikten sonra, vidaları kullanarak modülleri süpürgeye sabitleyin.
- İç sirkülasyon modüllerini dış sirkülasyon modüllerine bağlayın (mercan kültürü modülü olmadan).
- Deniz suyu perfüzyonu için, deniz suyunu deniz suyu deposu modülündeki su girişinden enjekte edin. Su seviyesi, pompaların su girişlerinden 3 cm daha yüksek olduğunda, pompaları çalıştırın ve iç sirkülasyon modülleri deniz suyuyla dolana kadar deniz suyu enjeksiyonuna devam edin, deniz suyu deposu modülünde hava için yer (3 cm yüksekliğinde).
NOT: Deniz suyu saf su ve deniz tuzu kullanılarak hazırlanır ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Sistem testi
- Tüm anahtarları açın ve her iki deniz suyu pompası voltajını 9 V'a ayarlayın. Su sıcaklığını 25 °C'ye ayarlayın.
- Döngü zamanlayıcısını "1 dakika açık ve 1 dakika kapalı" olarak ayarlayın. Üç kanallı zamanlayıcının üç kanalını da "9:00 açık" ve "5:00 kapalı" olarak ayarlayın.
- Herhangi bir arıza için sistemi en az 24 saat izleyin. Herhangi bir sorun bulunmazsa, sistem işlemin bir sonraki adımına hazırdır.
NOT: Deniz suyu deposu modülü hariç tüm modüllerdeki tüm kabarcıkların temizlenmesi önemlidir. Kabarcıkları modül girişinden çıkışa taşımak için tüm sistem hafifçe kaldırılabilir ve sallanabilir.
2. Mikrobiyal ortamın kurulması
NOT: Mercan naklinden önce mercan dostu bir mikrobiyal ortam oluşturulması gereklidir. Sistemdeki mikroorganizmaların kültüre edilebilmesi için, özellikle mikrobiyal saflaştırma modülünde, seyreltilmiş probiyotik çözeltisi nitrifikasyon sistemi için mikrobiyal kaynak olarak eklenmelidir.
- Mikrobiyom kaynağının eklenmesi
- Karıştırarak 500 mL deniz suyuna 1 mL ticari mikrobiyom kaynak çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
- Yukarıdaki seyreltilmiş çözeltiden 50 mL ve ticari mercan besleme çözeltisinden 10 μL ( Malzeme Tablosuna bakınız) sirkülasyon sistemine enjekte edin.
- Mikrobiyom kültürü
- Mikrobiyomu 21 gün boyunca kültürlemek için iç sirkülasyon pompasını ve bir hava pompasını açın. Mikrobiyom oksijen içeriği gereksinimleri, hava pompasının açık ve kapalı zaman oranlarını belirler.
NOT: Bu adım, deniz suyu arıtma mikrobiyomunu kültürlemeyi ve sistemde mercan açısından faydalı mikrobiyom büyümesini teşvik etmeyi amaçlamaktadır. Bu süreçte mikrobiyom enjeksiyonundan sonraki ikinci günden dördüncü güne kadar deniz suyu çamurlaşmaya başlar. Bu mikrobiyom kültürü işleminden sonra sistemdeki besin parçalama kapasitesi oluşturulmalıdır. Farklı deneysel gereksinimleri karşılamak için, mikrobiyom ortamını oluşturmak için farklı mikrobiyom kaynaklarının kullanılabileceği unutulmamalıdır.
- Mikrobiyomu 21 gün boyunca kültürlemek için iç sirkülasyon pompasını ve bir hava pompasını açın. Mikrobiyom oksijen içeriği gereksinimleri, hava pompasının açık ve kapalı zaman oranlarını belirler.
3. Mercan nakli ve büyümesi
- Mercan nakli
- Ham mercan dallarını 3-5 cm uzunluk ölçekleriyle kesin ve ardından bu mercan dallarını 3D baskılı mercan destek tabanlarına yapıştırın (Ek Kodlama Dosyası 1).
- Bu mercan dalı örneklerini geri kazanım için en az 7 gün boyunca orijinal deniz suyu tankına geri koyun.
- Mercan destek tabanını yapıştırıcı ile döndürme ünitesine sabitleyin. Mercan kültürü modülünü monte edin ve dış sirkülasyon döngüsüne bağlayın.
- Mercan büyümesinin görüntülenmesi
NOT: Mercan büyümesini değerlendirmek için zaman içindeki mercan görüntülerinin elde edilmesi gerekir. Sökülebilir bir bağlantı kullanmak, mercan kültürü modülünü görüntüleme için tüm sistemden çıkarmayı kolaylaştırır. Bu amaçla, uygun aydınlatma koşullarına sahip bir mini fotoğraf stüdyosu inşa edilir. Farklı dönemlerde mercan yüzey morfolojilerini yakalamak için makro lensli bir kamera ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılır. Kültür modülündeki mercan rotasyon ünitesi, temassız mod kullanılarak modülün dışında çalıştırılabilir. Modülün bitişiğindeki manyetik kolu döndürerek tam açılı mercan görüntüleri yakalanabilir.- Kamerayı stüdyonun üst kısmına yerleştirin ve görüntüleri dikey görünümden yakalayın.
- Mercan kültürü modülünü, mercan ortada ve altta olacak şekilde mini fotoğraf stüdyosuna yerleştirin.
- Dış tutamacı döndürerek mercan görüntülerini yakalayın.
NOT: Mercan sağkalımı nedeniyle, görüntüleme süresi 15 dakika ile sınırlandırılmalıdır.
4. Sistem rutin bakımı
NOT: Rutin bakım, sızıntı denetimi, arıza denetimi, katkı maddesi ilavesi ve deniz suyu değişimini içerir.
- Sızıntı muayenesi
- Süpürgelikte su lekeleri veya damlacıklar olup olmadığını kontrol edin. Sistemin kapak kabuğu şeffaf olduğundan, su sızıntısını görsel olarak incelemek kolay ve rahattır. Bu muayene her gün yapılmalıdır.
- Arıza muayenesi
- Bu adımın, ayarlanan su sıcaklığının, gerçek zamanlı sıcaklığın, trafo çıkış voltajlarının, UV lamba ayarlarının ve zamanlayıcı çalışma durumunun görsel olarak kontrol edilmesi ve kaydedilmesi dahil olmak üzere su sıcaklığının, pompaların, ışık voltajlarının, hava pompası durumunun ve zamanlayıcı durumunun incelenmesini içerdiğinden emin olun. Bu muayene her gün yapılmalıdır.
NOT: Bazı sistem arızaları, anormal seslere veya olağandışı sıcaklıklara bağlı olarak teşhis edilebilir.
- Bu adımın, ayarlanan su sıcaklığının, gerçek zamanlı sıcaklığın, trafo çıkış voltajlarının, UV lamba ayarlarının ve zamanlayıcı çalışma durumunun görsel olarak kontrol edilmesi ve kaydedilmesi dahil olmak üzere su sıcaklığının, pompaların, ışık voltajlarının, hava pompası durumunun ve zamanlayıcı durumunun incelenmesini içerdiğinden emin olun. Bu muayene her gün yapılmalıdır.
- Katkı maddesi ilavesi
NOT: Katkı maddesi ilavesi, sisteme besin maddeleri ve diğer reaktiflerin eklenmesi işlemidir.- Örneğin, aktif kömür modülü ile deniz suyu modülü arasındaki üç vanadan bir şırınga kullanarak 10 mL deniz suyu çıkarın.
- Ekstrakte edilen deniz suyundaki katkı maddelerini çözün.
- Çözeltiyi üç vana aracılığıyla sisteme geri enjekte edin. Gerçek durumlarda, katkı maddelerinin türleri, miktarları ve ekleme sıklıkları, deneysel gereksinimler göz önünde bulundurularak sistem deniz suyu kalitesine göre belirlenir.
- Su değişimi
NOT: Rutin su değişimi, kültür sistemindeki toksik konsantrasyonu ve ötrofikasyonu azaltabilir. Deney koşulları izin veriyorsa, deniz suyunun değişimi rutin bir işlem olabilir.- Tüm sistemin gücünü kapatın ve güvenlik nedeniyle güç kablosunu çıkarın.
- Mercan kültürü modülünü çıkarın.
- Dış atık su boru hattını deniz suyu deposu modülündeki çıkışa bağlayın.
- Sistemi döndürün ve sistemi ön tarafı aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
- Prizi açın. İçerideki deniz suyunun sistemden dışarı akmasına izin verin.
NOT: İçerideki negatif basınç sisteme zarar verebileceğinden suyu dışarı çekmek için herhangi bir pompa kullanmayın. - Uygun miktarda deniz suyu boşaltın ve prizi kapatın. Tahliye edilen deniz suyu miktarına mercanların fizyolojik durumuna göre karar verilir.
- Sistemi sıfırlayın ve yeni hazırlanan deniz suyunu su girişinden sisteme enjekte edin.
- Mercan kültürü modülünü sisteme geri takın.
- Sistem gücünü açın ve tüm sistem normale dönene kadar bekleyin.
5. Modül değişimi
NOT: Herhangi bir modülün arıza nedeniyle veya deney düzenlemesine göre değiştirilmesi gerekiyorsa, kültür deneyini askıya almadan veya olumsuz etkilemeden modülün değiştirilmesi önemlidir.
- Deniz suyu deposu modülü, yosun arıtma modülü, mikrobiyal arıtma modülü veya aktif karbon arıtma modülü için iç sirkülasyon pompasını kapatın ve modülün sabitleme vidalarını gevşetin.
- Birleştirilen iki modül arasındaki boru hatlarını ayırın ve değiştirilecek modülü sistemden sökün. Son adım, boru hatlarını bağlayarak ve sabitleme vidalarını yeniden sıkarak yeni modülü sisteme monte etmektir.
NOT: Sıcaklık kontrol modülünün değiştirilmesi bir şekilde farklıdır. İlk olarak, tüm kabloların modülden ayrılması gerekir. Sabitleme cıvataları daha sonra sökülür ve boru hatlarının bağlantısı kesilir. Daha sonra ısıtma paneli sökülür ve modül sistemden sökülür. Sıcaklık kontrol modülünün kurulum süreci ters işlemdir.
6. Sistemin kapatılması ve sistemin ilk durumuna geri yüklenmesi
NOT: Gerekli mercan kültürü deneyinden sonra sistem eninde sonunda kapatılacaktır. Sistemin orijinal durumuna geri yüklenmesi gerekiyor.
- Sistemin kapatılması
- Sistem gücünü kapatın ve güç kablosunu çıkarın.
- Sistemin içindeki deniz suyunu tahliye edin.
- Modülleri şu sırayla sökün: mercan kültürü modülü, aktif kömür arıtma modülü, deniz suyu deposu modülü, yosun arıtma modülü, mikrobiyal arıtma modülü, UV lambası, iki sirkülasyon pompası ve sıcaklık kontrol modülü.
- Sistem geri yüklemesi
- Tüm modülleri saf su ve yüzey aktif maddelerle temizleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
- Modülleri% 3 hidrojen peroksit çözeltisi ile sterilize edin.
NOT: Modülleri yıkamak için herhangi bir organik çözücü kullanmayın. - Modülleri 40 °C'de 12 saat kurutun. Sistemin içindeki tüm suyun buharlaştığından emin olun.
- Tüm boru hatlarını ve vanaları aynı yüzey aktif maddeleri kullanarak temizleyin.
7. Kontrollü mikroorganizma ortamı için modifikasyon
NOT: Mercan kültürü deneyinin yanı sıra, sistemde kontrollü bir mikroorganizma ortamı elde etmek gibi bazı özel deneyler için, mikrobiyom türleri ve bolluğu sıkı bir şekilde kontrol edilmelidir. Mercan kültürü sistemimizin en yenilikçi özelliği, mercanın fizyolojik aktivitesinin nispeten kapalı bir mikro ekosistemde belirli bir mikrobiyal ortamda keşfedilebilmesidir. Bu işlevin gerçekleştirilmesi farklı bir çalıştırma prosedürü gerektirir.
- Ön sterilizasyon
- Sistemi monte etmeden önce tüm modülleri, boru hatlarını ve vanaları %3 hidrojen peroksit solüsyonu kullanarak sterilize edin.
- Bakteri kültürü substratını otoklavlama yoluyla sterilize edin.
- Chaetomorpha alglerini %75 etanol çözeltisi ile sterilize edin ve steril kağıt kullanarak kurutun.
- Sistem modifikasyonu ve sterilizasyon
- Sistemi monte ederken, hava pompası ile deniz suyu deposu modülü arasına bir hava sterilizasyon filtresi ( Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin.
- Giriş ve üç vana arasına bir su sterilizasyon filtresi ekleyin. Bu adım, sisteme enjekte edilen hava ve suyun sterilize edilmesini sağlar.
- Kalan mikrobiyomu ortadan kaldırmak için sisteme ozon ekleyin.
- Kalan dezenfektan maddelerini üç kez steril deniz suyuyla yıkayın ve steril deniz suyunu sisteme enjekte edin.
- Sadece mikrobiyal ortamın kurulması için, mikrobiyom kaynak solüsyonunu su çıkışından enjekte edin.
NOT: Mikrobiyom kaynağını enjekte etmek için su girişini kullanmayın. Diğer reaktifler ve deniz suyu hala su girişinden enjekte edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sıcaklık kontrol doğruluğu
Sistem sıcaklığı normalde mercan türüne bağlı olarak 23-28 °C'ye ayarlanır. Bununla birlikte, en önemli faktörlerden biri olarak, sıcaklık dalgalanması mercanların hayatta kalmasını güçlü bir şekilde etkileyebilir. Bu nedenle, sıcaklık kontrol doğruluğu mercan kültürü sistemi için belirleyici bir faktördür. Mercan kültürü modülündeki sıcaklık kontrol doğruluğunu test etmek için bir sıcaklık sensörü ve 9 °C ila 32 °C sıcaklık aralığına sahip bağımsız bir veri toplayıcı kullanılabilir. Sistem deniz suyu sıcaklığını 24 °C'ye ayarladık ve deniz suyu ile oda sıcaklığını aynı anda ölçtük. Şekil 4'te gösterildiği gibi, kırmızı eğri ölçülen oda sıcaklığı dalgalanmasını temsil eder ve siyah eğri mercan kültürü modülünde ölçülen deniz suyu sıcaklığı dalgalanmasını temsil eder. 14 saat boyunca, ölçülen ortalama sıcaklık 23.8 °C ve standart sapma 0.1 °C idi. Sistem deniz suyu sıcaklık kontrolü nispeten doğruydu.
Mercan kültürü sonucu
Normalde, sağlıklı mercan, Şekil 5'te gösterildiği gibi, çevresel koşullar mercanın hayatta kalma gereksinimlerini karşıladığında dokunaçlarını serbestçe uzatır. Bu kriter genellikle mercanın durumunu doğrular ve çevresel stres faktörlerini kontrol etmek için kullanılabilir. Şekil 5B'de gösterildiği gibi, örnek mercanın dokunaçları rahatsız edilmeden 1 aydan fazla uzadı. Bu, sistemin uzun süre mercan için uygun bir hayatta kalma ortamı sağladığını gösterir. Bu kültür süresi, laboratuvardaki çoğu mercan deneyi ve tahlili için yeterince uzun olmalıdır. Şekil 5'ten , mercan büyüme sürecini görüntüleyerek morfolojik analizi gerçekleştirmenin uygulanabilir olduğu da görülebilir.
Şekil 1: Mikro cihaz sistemi için şematik modül bağlantısı. Yuvarlatılmış dikdörtgenler modülleri veya pompaları temsil eder; Ok çizgileri su veya hava boru hatlarını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikro cihaz sisteminin önden görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mikro cihaz sisteminin üstten görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Deniz suyu sıcaklık kontrolü deney sonuçları. Kırmızı eğri: oda sıcaklığı dalgalanması; Siyah eğri: ölçülen sistem deniz suyu sıcaklığı dalgalanması. Sistem ayar sıcaklığı 24 °C idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yakınlaştırılmış mercan görüntüsüne sahip mercan kültürü modülü . (A) Bir karşılaştırma yapmak için, mercan kültürü modülünde boş bir tane ile karşılık gelen destek tabanlarına dört mercan yerleştirildi. (B) Mercan Seriatopora caliendrum'un yakınlaştırılmış bir mercan görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 1: Mercan destek tabanlarının 3D baskısı için tasarım. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu mercan kültürü sistemi, mercanların nakledilmesi ve hayatta kalması için nispeten doğal veya özelleştirilmiş bir mikro ortamı simüle etmek ve sağlamak üzere tasarlanmıştır. Bu arada, kendi geliştirdiği bir ekipman olarak bu sistemin güvenilir, kullanıcı dostu ve güvenli olması gerekir. Örneğin, sıcaklık kontrolü açısından, deniz suyu sıcaklığının günlük çevre koşullarına göre uygun şekilde kontrol edilmesi gerekir. Sistem, mercanların 1 ay boyunca kültürlenmesiyle test edildi ve sistemin güvenilirliği doğrulandı.
Normal deniz tankları veya akvaryumlar26 ile karşılaştırıldığında, mercan kültürü deneyimize dayanarak, katkı maddesi formülü, değişim suyu planı, sirkülasyon hızı (pompa gücü veya voltajı), aydınlatma yoğunluğu, hava pompası açma ve kapama süresi oranları ve aydınlatma süresi dahil olmak üzere kültür parametrelerini/koşullarını ayarladıktan sonra, günlük servis ve çalıştırma süresi 10 dakikadan azdır. Ek olarak, bu süre zarfında herhangi bir elektrik kaçağı, kısa devre, aşırı yük veya başka bir olay meydana gelmedi, bu da sistemin kullanım kolaylığını ve güvenliğini gösterdi.
Bununla birlikte, sistem denetimi, devreye alma, mercan nakli/görüntüleme ve rutin bakımın protokoldeki temel ve kritik adımlar olduğu unutulmamalıdır. Cihazın içindeki su sızıntısı ve cihaz parçalarının eskimesi, nispeten uzun bir süre boyunca ortaya çıkabilecek iki sorun olabilir. Bu sistemi çoğaltmak isteyen izleyiciler bu konulara dikkat etmelidir.
Yapay mikro ekosistem perspektifinden bakıldığında, bu modüler platform, mercanlarla ilişkili mikrobiyomu sahadan ziyade laboratuvarda kontrol edilebilir bir ortamda inceleme kabiliyetine sahip olabilir, böylece ölçeklenebilirliğini ve maliyet etkinliğini kanıtlayabilir. Bu nedenle, bu mercan kültürü sisteminin mercanlarla ilgili çalışmalara yardımcı olması ve hızlandırması beklenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rekabet eden herhangi bir finansal çıkar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin'in Temel Araştırmaları için Devlet Anahtar Geliştirme Programları (2021YFC3100502) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12V DC power supply | Delixi Electric Co., Ltd. | CDKU-S150W | 12V12.5A |
| 3% hydrogen peroxide solution | Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd | NULL | NULL |
| 75% ethanol solution | Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd | NULL | NULL |
| Air pump | Chongyoujia Supply Chain Management Co., Ltd. | NHY-001 | NULL |
| Air sterilizing filter | Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd | S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-A | NULL |
| Camera | SONY | Α7r4-ILCE-76M4A | NULL |
| Coral nutrition solution | Red Sea Aquatics Co., Ltd. | 22101 | Coral nutrition |
| Coral pro salt (sea salt) | Red Sea Aquatics Co., Ltd. | R11231 | NULL |
| Cycle timer | Leqing Shangjin Instrument Equipment Co., Ltd. | CN102A | 220V version |
| Double closed quick connector | JOSOT Co., Ltd | NL4-2103T | NULL |
| Flow-through UV lamp | Zhongshan Xinsheng Electronic technology Co., Ltd. | 211 | NULL |
| Four-channel transformer | Dongguan Shanggushidai Electronic Technology Co., Ltd | LM2596 | NULL |
| Macro lens | SONY | FE 90mm F2.8 Macro G OSS | NULL |
| Microbiome source solution | Guangzhou BIOZYM Microbial Technology Co., Ltd. | 303 | NULL |
| Mini-photo studio | Shaoxing Shangyu Photography Equipment Factory | CM-45 | NULL |
| PID temperature controller | Guangdong Dongqi Electric Co., Ltd. | TE9-SC18W | SSR version |
| Pump (for water) | Zhongxiang Pump Co., Ltd. | ZX43D | Seaswater version |
| Pure water machine | Kemflo (Nanjing) environmental technology Co, ltd | kemflo A600 | NULL |
| Solid-state relay | Delixi Electric Co., Ltd. | DD25A | NULL |
| Surface active agents | Guangzhou Liby Group Co., Ltd. | Libai detergent | NULL |
| Three-channel timer | Leqing Changhong Intelligent Technology Co., Ltd. | CHE325-3 | 220V version |
| Water sterilizing filter | Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd | S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-L | NULL |
References
- Gardner, T. A., Côté, I. M., Gill, J. A., Grant, A., Watkinson, A. R. Long-term region-wide declines in Caribbean corals. Science. 301 (5635), 958-960 (2003).
- Kennedy, E. V., et al. Coral reef community changes in Karimunjawa national park, Indonesia: assessing the efficacy of management in the face of local and global stressors. Journal of Marine science and Engineering. 8 (10), 760-787 (2020).
- Cleary, D. F., et al. Coral reefs next to a major conurbation: a study of temporal change (1985−2011) in coral cover and composition in the reefs of Jakarta, Indonesia. Marine Ecology Progress Series. 501, 89-98 (2014).
- Sun, Y. F., Huang, L. T., McCook, L. J., Huang, H. Joint protection of a crucial reef ecosystem. Science. 337 (6611), 1163-1163 (2022).
- Huang, D. W., et al. Conservation of reef corals in the South China Sea based on species and evolutionary diversity. Biodiversity and Conservation. 25 (2), 331-344 (2016).
- Jiang, L., et al. Impacts of elevated temperature and pCO2 on the brooded larvae of Pocillopora damicornis from Luhuitou Reef, China: Evidence for local acclimatization. Coral Reefs. 39 (2), 331-344 (2020).
- Babcock, R. C., et al. Recurrent coral bleaching in north-western Australia and associated declines in coral cover. Marine and Freshwater Research. 72 (5), 620-632 (2021).
- Sweatman, H., Delean, S., Syms, C. Assessing loss of coral cover on Australia's Great Barrier Reef over two decades, with implications for longer-term trends. Coral Reefs. 30 (2), 521-531 (2011).
- Elliott, J. A., Patterson, M. R., Staub, C. G., Koonjul, M., Elliott, S. M. Decline in coral cover and flattening of the reefs around Mauritius (1998-2010). PeerJ. 6, e6014 (2018).
- Eddy, T. D., et al. Global decline in capacity of coral reefs to provide ecosystem services. One Earth. 4 (9), 1278-1285 (2021).
- Jones, G. P., McCormick, M. I., Srinivasan, M., Eagle, J. V. Coral decline threatens fish biodiversity in marine reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (21), 8251-8253 (2004).
- Hughes, T. P., et al. Global warming and recurrent mass bleaching of corals. Nature. 543 (7645), 373-377 (2017).
- Carpenter, K. E., et al. One-third of reef-building corals face elevated extinction risk from climate change and local impacts. Science. 321 (5888), 560-563 (2008).
- Hughes, T. P., et al. Spatial and temporal patterns of mass bleaching of corals in the Anthropocene. Science. 359 (6371), 80-83 (2018).
- Albright, R., et al. Reversal of ocean acidification enhances net coral reef calcification. Nature. 531 (7594), 362-365 (2016).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Mason, R. A. Decline in symbiont densities of tropical and subtropical scleractinian corals under ocean acidification. Coral Reefs. 37 (3), 945-953 (2018).
- Prouty, N. G., et al. Vulnerability of Coral reefs to bioerosion from land-based sources of pollution. Journal of Geophysical Research: Oceans. 122 (12), 9319-9331 (2017).
- Heery, E. C., et al. Urban coral reefs: Degradation and resilience of hard coral assemblages in coastal cities of East and Southeast Asia. Marine Pollution Bulletin. 135, 654-681 (2018).
- Rosenberg, E., Koren, O., Reshef, L., Efrony, R., Zilber-Rosenberg, I. The role of microorganisms in coral health, disease and evolution. Nature Reviews: Microbiology. 5 (5), 355-362 (2007).
- Bui, V. N., et al. Diversity and biogeography of coral mucus-associated bacterial communities: The case of Acropora formosa. Journal of Marine Science and Engineering. 11 (1), 74 (2023).
- Hass, A. F., Smith, J. E., Thompson, M., Deheyn, D. D. Effects of reduced dissolved oxygen concentrations on physiology and fluorescence of hermatypic corals and benthic algae. PeerJ. 2, 235 (2014).
- Raj, K. D., et al. Low oxygen levels caused by Noctiluca scintillans bloom kills corals in Gulf of Mannar, India. Scientific Reports. 10 (1), 22133 (2020).
- Luo, Y. S., Zhao, J. L., He, C. P., Lu, Z. H., Lu, X. L. Miniaturized platform for individual coral polyps culture and monitoring. Micromachines. 11 (2), 127 (2020).
- Pang, A. P., Luo, Y. S., He, C. P., Lu, Z. H., Lu, X. L. A polyp-on-chip for coral long-term culture. Scientific Reports. 10 (1), 6964 (2020).
- Yan, L. I., et al. Effects of live rock removal of dissolved inorganic nitrogen in coral aquaria. Acta Oceanologica Sinica. 36 (12), 87-94 (2017).
