Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מערכת מיקרו-מכשירים משולבת לגדילה וניטור של אלמוגים

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65651
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1State Key Laboratory of Digital Medical Engineering, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 2Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Marine Biology, South China Sea Institute of Oceanology, University of Chinese Academy of Sciences

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של מערכת מיקרו-התקנים מודולרית הניתנת לשליטה, שניתן ליישם לצורך טיפוח וניטור ארוכי טווח של אלמוגי ים.

Abstract

אלמוגים הם אורגניזמים בסיסיים במערכות אקולוגיות ימיות וחופיות. עם התקדמות המחקר להגנה על אלמוגים בשנים האחרונות, בקרה מדויקת של סביבת גידול האלמוגים מבוקשת מאוד לשימור ומחקר אלמוגים. כאן, פיתחנו מערכת מיקרו-מכשירים סגורה למחצה של תרבית אלמוגים כפלטפורמה רב-תפקודית, שיכולה לספק בקרת טמפרטורה מדויקת וניתנת לתכנות, סביבה התחלתית סטרילית, איכות מים יציבה לטווח ארוך, ריכוז חמצן מומס מתכוונן וספקטרום אור מותאם אישית לאלמוגים. בשל העיצוב המודולרי, ניתן לשדרג או לשנות את מערכת תרביות האלמוגים על ידי התקנת מודולים חדשים רצויים או הסרת מודולים קיימים. כיום, בתנאים מתאימים ועם תחזוקה נאותה של המערכת, אלמוגי הדגימה יכולים לשרוד לפחות 30 יום במצב בריא. יתר על כן, בשל הסביבה הראשונית הניתנת לשליטה וסטרילית, מערכת תרביות אלמוגים זו יכולה לתמוך במחקר על הקשר הסימביוטי בין אלמוגים למיקרואורגניזמים הקשורים אליהם. לכן, ניתן ליישם את מערכת המיקרו-התקנים הזו כדי לנטר ולחקור אלמוגי ים באופן כמותי יחסית.

Introduction

הידרדרות המערכות האקולוגיות של שוניות האלמוגים מתרחשת ברחבי העולם ב-70 השנים האחרונות. בהתחשב בכל אזורי האלמוגים העיקריים ברחבי מרכז אמריקה1, דרום מזרח אסיה 2,3,4,5,6, אוסטרליה 7,8 ומזרח אפריקה9, הכיסוי העולמי של שוניות האלמוגים הצטמצם בחצי מאז1950 10. אובדן המוני זה של שוניות אלמוגים גרם לבעיות אקולוגיות וכלכליות. לדוגמה, על ידי מעקב אחר נוכחות/היעדר ושפע של כל מיני דגים תלויי אלמוגים במשך 8 שנים, החוקרים הגיעו למסקנה כי ירידת האלמוגים גרמה ישירות לירידה משמעותית במגוון הביולוגי ובשפע של דגים בפפואה גינאה החדשה11. תוצאה זו הוכיחה כי הידלדלות האלמוגים יכולה לא רק לערער את המערכות הביולוגיות המבוססות על שוניות האלמוגים, אלא גם להפחית את הכנסות הדגה.

במשך עשרות שנים של סקרי שטח, כולל ניטור ישיר, חישה מרחוק והשוואת נתונים, הקהילה המדעית זיהתה מספר גורמים לירידה ההמונית באלמוגים. אחת הסיבות העיקריות לירידה ההמונית באלמוגים היא הלבנת אלמוגים הנגרמת על ידי טמפרטורות גבוהות של מי ים12,13. על ידי שילוב של הלבנה ורשומות מטאורולוגיות, מדענים הגיעו למסקנה כי הלבנת אלמוגים מתרחשת בתדירות גבוהה יותר בשלבי תנודה אל-ניניו-דרום14. סיבה נוספת לדעיכת האלמוגים היא החמצת האוקיינוסים. בשל ריכוזCO2 מוגבר הן באטמוספרה והן במי הים, סידן פחמתי מתמוסס מהר יותר מבעבר, מה שגורם להסתיידות שונית אלמוגים נטו15. ואכן, המסקנה היא שכאשר ריכוז ה-CO2 באטמוספירה יגיע ליותר מ-500 ppm, עשרות מיליוני אנשים יסבלו, ושוניות האלמוגים יהיו בסיכון להידרדרות משמעותית ולניתוק סימביודיניום 16,17. ישנם גורמים אחרים שיכולים גם הם להשפיע על הישרדות אלמוגים, כגון מזהמים בחופים הגורמים או מאיצים את הידרדרות האלמוגים. חוקרים בהוואי מדדו את איזוטופי הפחמן, החמצן והחנקן באלמוגים, יחד עם הקרבונט האנאורגני המומס וחומרי המזון הקשורים אליו (NH4+, PO4 3-, NO2− ו-NO3-), והגיעו למסקנה שהזיהום מהיבשה הגביר את ההחמצה והשחיקה הביולוגית של אלמוגיםלאורך החוף 18. בהמשך לזיהום, העיור גם מסכן את הישרדות האלמוגים וגורם למורכבות אדריכלית נמוכה יחסית באלמוגים, כפי שעולה ממחקר על מצב הישרדות האלמוגים בסינגפור, ג'קרטה, הונג קונג ואוקינאווה. לפיכך, ההשפעה של גורמי עקה אנתרופוגניים וההשפעות של שינויי האקלים מובילים לצמצום נרחב במגוון הביולוגי על שוניות האלמוגים ולירידה נלווית בתפקוד האקולוגי של האלמוגים ובחוסנם19.

כמו כן יש לציין כי מספר רב של מיקרואורגניזמים משתתפים בתפקודים הפיזיולוגיים של אלמוגים, כולל קיבוע חנקן, פירוק כיטין, סינתזה של תרכובות אורגניות וחסינות20, ולכן מיקרואורגניזמים אלה צריכים להיכלל כאשר בוחנים את הידרדרות שוניות האלמוגים. בסביבות טבעיות, כגון שוניות אלמוגים, גורמים רבים גורמים לתנאים היפוקסיים או אנוקסיים, כולל זרימת מים לא מספקת, הפרשה של אצות וצמיחת יתר של אצות. תופעה זו משפיעה לרעה על התפלגות האוכלוסייה של מיקרואורגניזמים הקשורים לאלמוגים ואלמוגים. לדוגמה, מדענים וייטנאמים מצאו כי ב Nha Trang, Phu Quoc, ו Ujung Gelam, הרכב חיידקים באלמוג Acropora Formosa יכול להיות מושפע על ידי חמצן מומס במקומות שונים21. חוקרים בארצות הברית חקרו מצבים היפוקסיים או אנוקסיה באלמוגים ומצאו כי הפרשה של אצות יכולה לתווך פעילות מיקרוביאלית, מה שמוביל לתנאים היפוקסיים מקומיים, שעלולים לגרום לתמותת אלמוגים בסביבה הקרובה. הם גם מצאו כי אלמוגים יכולים לסבול ריכוזי חמצן מופחתים, אך רק מעל סף נתון שנקבע על ידי שילוב של זמן החשיפה וריכוז החמצן22. חוקרים בהודו מצאו כי כאשר אצות Noctiluca scintillans פרחו, החמצן המומס ירד ל -2 מ"ג / ליטר. מתחת לריכוז זה, כ -70% של Acropora montiporacan מתו בגלל תנאים היפוקסיים23.

כל העובדות והגורמים הנ"ל מצביעים על כך ששינוי סביבתי מוביל להידרדרות שוניות האלמוגים. כדי לגדל ולחקור אלמוגי שוניות בתנאים מסוימים, חשוב לבנות באופן מדויק ומקיף סביבה מיקרוסקופית נשלטת עבור אלמוגי שוניות להתגורר בה. בדרך כלל, מדענים מתמקדים בטמפרטורה, אור, זרימת מים וחומרי מזון. עם זאת, בדרך כלל מתעלמים ממאפיינים אחרים, כגון ריכוז החמצן המומס, שפע המיקרואורגניזמים ומגוון המיקרואורגניזמים במי הים. לשם כך, הקבוצה שלנו בחנה את האפשרות ליישם ציוד קטן על פוליפים אלמוגים בתרבית בסביבה מבוקרת יחסית24,25. בעבודה זו תכננו ובנינו מערכת מיקרו-מכשירים מודולרית לתרביות אלמוגים. מערכת מיקרו-מכשירים מודולרית זו יכולה לספק מיקרו-סביבה נשלטת במונחים של טמפרטורה, ספקטרום אור, ריכוז חמצן מומס, חומרים מזינים, מיקרואורגניזמים וכו ', ויש לה את היכולת להתרחב ולשדרג.

מודולים ופונקציות של המכשיר
מערכת המיקרו-מכשירים נוצרה בהשראת מערכת ברלין26, אך לא נעשה שימוש בסלעים חיים במערכת הנוכחית. כפי שניתן לראות באיור 1, המערכת הנוכחית כוללת שישה מודולים עיקריים, שתי משאבות מנוע ללא מברשות, משאבת דלק אחת, מנורת UV אחת זורמת, ספק כוח אחד, רכיבי בקרה אלקטרוניים מסוימים והחוטים והברגים הקשורים. ששת המודולים העיקריים כוללים מודול אחסון מי ים (עם משאבת אוויר וחיישן טמפרטורה), מודול בקרת טמפרטורה, מודול טיהור אצות, מודול טיהור מיקרוביאלי, מודול טיהור פחם פעיל ומודול תרבית אלמוגים.

ארכיטקטורת התקן
כפי שניתן לראות באיור 2 ובאיור 3, ניתן לחלק אופקית את מערכת המיקרו-התקנים הכוללת לשני תאים עם מודול בקרת טמפרטורה ביניהם. מטעמי בטיחות, כל המודולים והחלקים המכילים מי ים ממוקמים בתא השמאלי, הנקרא תא התרבית. שאר החלקים האלקטרוניים ממוקמים בתא הימני, הנקרא התא האלקטרוני. שני התאים אטומים או ארוזים בתוך פגזים. מודול בקרת הטמפרטורה קבוע בלוח חוצץ ביניהם. מעטפת תא התרבות כוללת לוח בסיס ושלושה לוחות קיבוע ברגים. עיצוב זה מבטיח אטימות לתא ומקל על פעולת המערכת. בנוסף, ההידוק מעדיף בקרת טמפרטורה מדויקת. מעטפת התא האלקטרוני כוללת לוח בסיס, שני לוחות קיבוע ברגים ולוח בקרה קדמי אחד.

סירקולציית מים
לולאת סירקולציית מי ים פנימית וחיצונית המחוברת למודול אחסון מי הים תוכננה מראש. לולאת הסירקולציה הפנימית מחברת בהצלחה את מודול אחסון מי הים, מודול בקרת הטמפרטורה, מנורת UV זורמת, מודול טיהור אצות ומודול טיהור מיקרוביאלי. לולאת סירקולציה זו נועדה לספק תנאי מי ים פיסיוכימיים ופיזיולוגיים מתאימים לאלמוגים, ואין צורך בתחזוקה תכופה. מודול טיהור האצות מכיל אצות Chaetomorpha , אשר סופגות את חומרי המזון הנוספים (חנקות ופוספט) במים. מודול הטיהור המיקרוביאלי מכיל את מצע תרבית החיידקים, אשר מטפח את המיקרוביום כדי להעביר ניטריט ואמוניום לחנקות לטיהור מים. כל המודולים האלה צריכים להיות מוחלפים רק בנסיבות קריטיות.

לולאת הסירקולציה החיצונית מחברת ברציפות את מודול מאגר מי הים, מודול תרבית האלמוגים ומודול הפחם הפעיל. לולאת סירקולציה זו נועדה לספק אור, לחץ, זרם מים ואיכות מי ים גבוהה לאלמוגים. ניתן לרענן את מי הים דרך כניסת מים ושקע מים. תוספים מתווספים דרך שסתום משולש, וניתן גם לחלץ את דגימת מי הים משסתום זה לבדיקה. ניתן לשאוב אוויר דרך כניסת אוויר ולפרוק אותו משקע אוויר.

עיצוב אלקטרוני
ספק כוח AC של 220 וולט עם מתג ונתיך משמש לכל המערכת. כוח הקלט מחולק לארבעה ענפים. הענף הראשון הולך לספק כוח DC 12 V, אשר מפעיל ישירות את לוח החימום, לוח הקירור ומאוורר הקירור. ענף זה גם מפעיל בעקיפין שתי משאבות ושני לוחות תאורה באמצעות שנאי DC בעל ארבעה ערוצים. הענף השני הולך לבקר טמפרטורה PID. הענף השלישי הולך לספק כוח משאבת אוויר. הענף האחרון מתחבר לספק כוח של מנורת UV. ממסר מצב מוצק מחבר את בקר הטמפרטורה PID ואת לוח הקירור במודול בקרת הטמפרטורה. ממסר רגיל משמש לחיבור בקר הטמפרטורה PID ולוח החימום. שנאי DC בעל ארבעה ערוצים ממיר את המתח לנדרש.

ישנם שני לוחות בקרה בחלק הימני של המערכת. ישנם ארבעה מתגים ובקר אחד עבור מנורת UV בלוח העליון, כולל מתג הפעלה ראשי, מתג הפעלה של מנורת UV, מתג משאבת אוויר ומתג בקרת טמפרטורה. מתג ההפעלה הראשי שולט בספק הכוח של 12 V של המערכת.

בקר טמפרטורה PID, טיימר מחזור, שנאי DC בעל ארבעה ערוצים וטיימר תלת-ערוצי נמצאים בלוח הקדמי. בקר הטמפרטורה PID מתאים את טמפרטורת המים על ידי שליטה בלוחות החימום והקירור במודול בקרת הטמפרטורה. מודול בקרת הטמפרטורה פועל רק כאשר משאבת הסירקולציה הפנימית פועלת והמים זורמים מעבר למודול בקרת הטמפרטורה. טיימר המחזור מחובר לקו החשמל של משאבת האוויר. מטרתו היא להקצות את תקופת העבודה למשאבת האוויר. יש גם טיימר תלת ערוצי הפרוס בתא האלקטרוני. טיימר זה שולט על משך זמן העבודה של משאבת האוויר, אור האלמוגים ואור האצות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

האלמוגים ששימשו למחקר הנוכחי היו Seriatopora caliendrum, אשר מתורבתים במעבדה שלנו. כל האלמוגים סופקו באדיבות על ידי המכון לאוקיאנולוגיה של ים סין הדרומי, אוניברסיטת האקדמיה הסינית למדעים.

1. בדיקה והפעלה

הערה: כל מודול חייב להיבדק לאטימות ולתפקד בנפרד לפני הרכבת המערכת. יש להשתמש במים שעברו דה-יוניזציה כדי לבדוק את ההידוק של המודול. פרטים מסחריים של כל רכיבי המודול מופיעים בטבלת החומרים.

  1. בדיקת הידוק של החיבור בין המודולים
    1. חברו את כל המודולים והמשאבות (איור 1), וודאו שהמים זורמים בצורה מעגלית על פני המערכת במשך 30 דקות לפחות.
    2. בדוק את כל התפרים עבור בעיות נזילה אפשריות. אם מתרחשת דליפה כלשהי באחד מתפרי ההדבקה, יש למרוח דבק הדבקה מבחוץ. אם מתרחשת דליפה באחד מתפרי החיבור, הדקו שוב את החיבור ובדקו אם יש צורך להחליף את אטם האיטום.
  2. טעינת
    1. לאחר בדיקת האטימות, יש לפנות ולייבש את המים שבפנים.
    2. טען את התוכן המתאים.
      הערה: לדוגמה, מצע תרבית החיידקים נטען לתוך מודול הטיהור המיקרוביאלי, ואצות Chaetomorpha נטענות לתוך מודול טיהור האצות.
  3. הרכבה ובדיקה של כל המערכת
    1. לאחר הטעינה, קבע את המודולים על לוח הבסיס באמצעות הברגים.
    2. חבר את מודולי הסירקולציה הפנימית עם מודולי הסירקולציה החיצוניים (ללא מודול תרבית האלמוגים).
    3. עבור זילוח מי הים, הזריקו את מי הים דרך כניסת המים במודול אחסון מי הים. כאשר מפלס המים גבוה ב-3 ס"מ מפתחי המים של המשאבות, הפעילו את המשאבות והמשיכו בהזרקת מי הים עד שמודולי הסירקולציה הפנימיים יתמלאו במי הים, עם מקום לאוויר (בגובה 3 ס"מ) במודול אגירת מי הים.
      הערה: מי הים מוכנים באמצעות מים טהורים ומלח ים (ראה טבלת חומרים).
  4. בדיקת מערכת
    1. הפעל את כל המתגים והגדר את שני מתחי משאבת מי הים ל- 9 V. הגדר את טמפרטורת המים ל- 25 ° C.
    2. הגדר את טיימר המחזור ל"דקה אחת דולקת ודקה כבויה". הגדר את כל שלושת הערוצים של טיימר שלושת הערוצים ל- "9:00 בבוקר מופעל" ו- "5:00 אחר הצהריים כבוי".
    3. נטר את המערכת לפחות 24 שעות עבור כל תקלה. אם לא נמצאה בעיה, המערכת מוכנה לשלב הבא של הפעולה.
      הערה: חשוב לנקות את כל הבועות בכל המודולים למעט מודול מאגר מי הים. ניתן להרים ולנער מעט את המערכת כולה כדי להעביר את הבועות מכניסת המודול לשקע.

2. הקמת הסביבה המיקרוביאלית

הערה: יצירת סביבה מיקרוביאלית ידידותית לאלמוגים נחוצה לפני השתלת אלמוגים. על מנת לגדל מיקרואורגניזמים במערכת, במיוחד במודול הטיהור המיקרוביאלי, יש להוסיף את התמיסה הפרוביוטית המדוללת כמקור מיקרוביאלי למערכת הניטריפיקציה.

  1. הוספת מקור המיקרוביום
    1. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת מקור המיקרוביום המסחרית (ראו טבלת חומרים) ל-500 מ"ל מי ים תוך ערבוב.
    2. הזריקו 50 מ"ל של התמיסה המדוללת לעיל ו-10 מיקרוליטר של תמיסת תזונת האלמוגים המסחרית (ראו טבלת חומרים) למערכת הסירקולציה.
  2. תרבית מיקרוביום
    1. הפעילו את משאבת הסירקולציה הפנימית ומשאבת אוויר לתרבית המיקרוביום למשך 21 יום. דרישות תכולת החמצן במיקרוביום קובעות את הפרופורציות בזמן ומחוץ לזמן של משאבת האוויר.
      הערה: צעד זה נועד לגדל את מיקרוביום טיהור מי הים ולקדם צמיחת מיקרוביום מועיל לאלמוגים במערכת. בתהליך זה, מי הים מתחילים להיות בוציים מהיום השני עד היום הרביעי לאחר הזרקת המיקרוביום. לאחר תהליך זה של תרבית מיקרוביום, יש לקבוע את יכולת פירוק החומרים המזינים במערכת. יש לציין כי כדי לעמוד בדרישות ניסוי שונות, ניתן להשתמש במקורות מיקרוביום שונים כדי לבסס את סביבת המיקרוביום.

3. השתלת אלמוגים וצמיחה

  1. השתלת אלמוגים
    1. חתכו את ענפי האלמוגים הגולמיים עם קשקשי אורך של 3-5 ס"מ, ואז הדביקו את ענפי האלמוגים האלה על בסיסי תמיכה באלמוגים מודפסים בתלת-ממד (קובץ קידוד משלים 1).
    2. החזירו את דגימות ענף האלמוגים האלה למיכל מי הים המקורי למשך 7 ימים לפחות להתאוששות.
    3. מקבעים את בסיס התמיכה באלמוגים על יחידת הסיבוב בעזרת דבק. הרכיבו את מודול תרבית האלמוגים, וחברו אותו ללולאת הסירקולציה החיצונית.
  2. הדמיה של גדילת האלמוגים
    הערה: יש לרכוש את תמונות האלמוגים לאורך זמן כדי להעריך את גדילת האלמוגים. שימוש בחיבור מתפרק מקל על הסרת מודול תרבית האלמוגים מכל המערכת לצורך הדמיה. לשם כך נבנה סטודיו מיני צילום עם תנאי תאורה מתאימים. מצלמה עם עדשת מאקרו (ראו טבלת חומרים) משמשת ללכידת מורפולוגיות פני השטח של האלמוגים בתקופות שונות. ניתן להפעיל את יחידת סיבוב האלמוגים במודול התרבית מחוץ למודול באמצעות מצב ללא מגע. על ידי סיבוב הידית המגנטית הסמוכה למודול, ניתן לצלם תמונות אלמוגים בזווית מלאה.
    1. מקם את המצלמה בחלק העליון של הסטודיו וצלם את התמונות מתצוגה אנכית.
    2. מקמו את מודול תרבית האלמוגים בסטודיו המיני פוטו כשהאלמוג ממוקם במרכז ובתחתית.
    3. צלם את תמונות האלמוגים על-ידי סיבוב הידית החיצונית.
      הערה: מסיבות הישרדות אלמוגים, יש להגביל את זמן ההדמיה ל-15 דקות.

4. תחזוקה שוטפת של המערכת

הערה: התחזוקה השוטפת כוללת בדיקת נזילות, בדיקת תקלות, הוספת תוספים והחלפת מי ים.

  1. בדיקת נזילות
    1. בדוק את לוח הבסיס עבור כתמי מים או טיפות. מכיוון שמעטפת הכיסוי של המערכת שקופה, בדיקה ויזואלית של נזילת המים היא קלה ונוחה. בדיקה זו חייבת להתבצע מדי יום.
  2. בדיקת תקלות
    1. ודא ששלב זה כולל בדיקה של טמפרטורת המים, משאבות, מתחי אור, מצב משאבת האוויר ומצב הטיימר, כולל בדיקה חזותית ורישום טמפרטורת המים שנקבעה, טמפרטורה בזמן אמת, מתחי יציאת שנאי, הגדרות מנורת UV וסטטוס פעולת הטיימר. בדיקה זו צריכה להתבצע מדי יום.
      הערה: ניתן לאבחן תקלות מסוימות במערכת על סמך צלילים חריגים או טמפרטורות חריגות.
  3. תוספת תוספתית
    הערה: תוספת היא תהליך של הוספת חומרים מזינים וריאגנטים אחרים למערכת.
    1. לדוגמה, לחלץ 10 מ"ל של מי הים באמצעות מזרק מן השסתום המשולש בין מודול פחם פעיל מודול מי ים.
    2. ממיסים את התוספים במי הים המופקים.
    3. הזריקו את התמיסה חזרה למערכת דרך השסתום התלת-כיווני. במקרים אמיתיים, הסוגים, הכמויות ותדרי התוספות של התוספים נקבעים על ידי איכות מי הים של המערכת, בהתחשב בדרישות הניסוי.
  4. החלפת מים
    הערה: חילופי מים שגרתיים יכולים להפחית ריכוז רעיל ואטרופיקציה במערכת התרבית. אם תנאי הניסוי מאפשרים זאת, החלפת מי הים יכולה להיות פעולה שגרתית.
    1. כבה את החשמל עבור המערכת כולה ונתק את כבל החשמל מטעמי בטיחות.
    2. הסר את מודול תרבית האלמוגים.
    3. חבר את צינור השפכים החיצוני לשקע במודול מאגר מי הים.
    4. סובב את המערכת והנח את המערכת בחזית כלפי מטה.
    5. הפעל את השקע. תנו למי הים הפנימיים לזרום החוצה מהמערכת.
      הערה: אין להשתמש במשאבה כלשהי כדי לשאוב את המים החוצה מכיוון שהלחץ השלילי הפנימי עלול לגרום נזק למערכת.
    6. יש לפרוק כמות מתאימה של מי ים ולכבות את השקע. כמות מי הים המוזרמים נקבעת על ידי המצב הפיזיולוגי של האלמוגים.
    7. אפסו את המערכת, והזריקו את מי הים החדשים שהוכנו למערכת דרך כניסת המים.
    8. התקן את מודול תרבית האלמוגים בחזרה למערכת.
    9. הפעל את הפעלת המערכת, והמתן עד שכל המערכת תחזור לקדמותה.

5. החלפת מודול

הערה: אם יש צורך להחליף מודול כלשהו עקב תקלה או בהתאם לסידור הניסוי, חשוב לשנות את המודול מבלי להשהות או להשפיע לרעה על ניסוי התרבית.

  1. עבור מודול אחסון מי ים, מודול טיהור אצות, מודול טיהור מיקרוביאלי או מודול טיהור פחם פעיל, כבה את משאבת הסירקולציה הפנימית ושחרר את ברגי הקיבוע למודול.
  2. נתק את הצינורות בין שני המודולים המחוברים, ופרק את המודול שיוחלף מהמערכת. השלב האחרון הוא הרכבת המודול החדש למערכת על ידי חיבור הצינורות והידוק מחדש של ברגי הקיבוע.
    הערה: החלפת מודול בקרת הטמפרטורה שונה איכשהו. ראשית, יש לנתק את כל החוטים מהמודול. לאחר מכן משחררים את ברגי הקיבוע, והצינורות מנותקים. לאחר מכן, לוח החימום מפורק, והמודול מפורק מהמערכת. תהליך ההתקנה של מודול בקרת הטמפרטורה הוא התהליך ההפוך.

6. כיבוי המערכת והחזרת המערכת למצבה ההתחלתי

הערה: המערכת תיסגר בסופו של דבר לאחר ניסוי תרבית האלמוגים הדרוש. יש להחזיר את המערכת למצבה המקורי.

  1. כיבוי המערכת
    1. כבה את מתח המערכת ונתק את כבל החשמל.
    2. לפנות את מי הים בתוך המערכת.
    3. פרק את המודולים בסדר הבא: מודול תרבית האלמוגים, מודול טיהור הפחם הפעיל, מודול אחסון מי הים, מודול טיהור האצות, מודול הטיהור המיקרוביאלי, מנורת UV, שתי משאבות הסירקולציה ומודול בקרת הטמפרטורה.
  2. שחזור המערכת
    1. נקו את כל המודולים עם מים טהורים וחומרים פעילים על פני השטח (ראו טבלת חומרים).
    2. לעקר את המודולים עם תמיסת מי חמצן 3%.
      הערה: אין להשתמש בממס אורגני כלשהו כדי לשטוף את המודולים.
    3. יבש את המודולים ב 40 ° C במשך 12 שעות. ודא שכל המים בתוך המערכת מתאדים.
    4. נקו את כל הצינורות והשסתומים באמצעות אותם חומרים פעילים על פני השטח.

7. שינוי עבור הסביבה מיקרואורגניזם מבוקר

הערה: מלבד ניסוי תרבית האלמוגים, עבור ניסויים מיוחדים מסוימים, כגון רכישת סביבת מיקרואורגניזמים מבוקרת במערכת, יש לשלוט בקפדנות על מיני המיקרוביום והשפע. התכונה החדשנית ביותר של מערכת תרביות האלמוגים שלנו היא שניתן לחקור את הפעילות הפיזיולוגית של האלמוגים בסביבה מיקרוביאלית ספציפית במיקרו-מערכת אקולוגית סגורה יחסית. ביצוע פונקציה זו דורש הליך הפעלה שונה.

  1. טרום עיקור
    1. יש לעקר את כל המודולים, הצינורות והשסתומים באמצעות תמיסת מי חמצן 3% לפני הרכבת המערכת.
    2. לעקר את מצע תרבית החיידקים באמצעות autoclaving.
    3. יש לעקר אצות Chaetomorpha בתמיסת אתנול 75% ולייבש אותן באמצעות נייר סטרילי.
  2. שינוי מערכת ועיקור
    1. בהרכבת המערכת, הוסף מסנן חיטוי אוויר (ראה טבלת חומרים) בין משאבת האוויר לבין מודול אחסון מי הים.
    2. הוסף מסנן חיטוי מים בין הכניסה לשסתום התלת-כיווני. שלב זה מבטיח שהאוויר והמים המוזרקים למערכת מעוקרים.
    3. הכניסו אוזון למערכת כדי לסלק את שאריות המיקרוביום.
    4. יש לשטוף את חומרי החיטוי הנותרים במי ים סטריליים שלוש פעמים, ולהזריק את מי הים הסטריליים למערכת.
    5. רק לביסוס הסביבה המיקרוביאלית, הזריקו את תמיסת מקור המיקרוביום דרך מוצא המים.
      הערה: אין להשתמש בכניסת המים כדי להזריק את מקור המיקרוביום. ריאגנטים אחרים ומי ים עדיין מוזרקים דרך מפרצון המים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דיוק בקרת טמפרטורה
טמפרטורת המערכת מוגדרת בדרך כלל ל 23-28 מעלות צלזיוס בהתאם למיני האלמוגים. אולם כאחד הגורמים החשובים ביותר, תנודות הטמפרטורה יכולות להשפיע מאוד על הישרדות האלמוגים. לפיכך, דיוק בקרת הטמפרטורה הוא גורם מכריע עבור מערכת תרביות האלמוגים. חיישן טמפרטורה ואספן נתונים עצמאי עם טווח טמפרטורות בין 9 ° C ל 32 ° C יכולים לשמש כדי לבדוק את דיוק בקרת הטמפרטורה במודול תרבית האלמוגים. קבענו את טמפרטורת מי הים במערכת ל-24°C ומדדנו בו זמנית את מי הים וטמפרטורת החדר. כפי שניתן לראות באיור 4, העקומה האדומה מייצגת את התנודות הנמדדות בטמפרטורת החדר, והעקומה השחורה מייצגת את התנודות שנמדדו בטמפרטורת מי הים במודול תרבית האלמוגים. במשך 14 שעות, הטמפרטורה הממוצעת שנמדדה הייתה 23 °C (75 °F), וסטיית התקן הייתה 0.1 °C (75 °F). בקרת טמפרטורת מי הים של המערכת הייתה מדויקת יחסית.

תוצאת תרבית אלמוגים
בדרך כלל, אלמוגים בריאים מרחיבים את זרועותיהם בחופשיות כאשר התנאים הסביבתיים עומדים בדרישות ההישרדות של האלמוגים, כפי שמוצג באיור 5. קריטריון זה בדרך כלל מאמת את מצב האלמוגים וניתן להשתמש בו כדי לבדוק גורמי עקה סביבתיים. כפי שניתן לראות באיור 5B, זרועות הציד של אלמוגי הדגימה נמתחו במשך חודש אחד מבלי שיפריעו להן. זה מצביע על כך שהמערכת סיפקה סביבת הישרדות מתאימה לאלמוגים במשך זמן רב. פרק הזמן הזה של תרבית אמור להיות ארוך מספיק עבור רוב הניסויים והבדיקות באלמוגים במעבדה. ניתן גם לראות מאיור 5 שזה מעשי לבצע את הניתוח המורפולוגי באמצעות הדמיה של תהליך גדילת האלמוגים.

Figure 1
איור 1: חיבור מודול סכמטי עבור מערכת המיקרו-התקנים. המלבנים המעוגלים מייצגים מודולים או משאבות; קווי החצים מייצגים צינורות מים או אוויר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מבט קדמי על מערכת המיקרו-התקנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מבט מלמעלה על מערכת המיקרו-מכשירים. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות ניסוי של בקרת טמפרטורת מי ים. עקומה אדומה: תנודות בטמפרטורת החדר; עקומה שחורה: נמדדה תנודות טמפרטורת מי הים של המערכת. טמפרטורת הגדרת המערכת הייתה 24 ° C. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מודול תרבית אלמוגים עם תמונת אלמוגים מוגדלת. (A) לשם השוואה, ארבעה אלמוגים היו ממוקמים בבסיסי התמיכה המתאימים עם אחד ריק במודול תרבית האלמוגים. (B) תמונת אלמוג מוגדלת של האלמוג Seriatopora caliendrum. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ קידוד משלים 1: תכנון להדפסה תלת-ממדית של בסיסי תמיכה באלמוגים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת תרביות אלמוגים זו מתוכננת לדמות ולספק מיקרו-סביבה טבעית יחסית או מותאמת אישית עבור אלמוגים להשתלה ולשרוד. בינתיים, כציוד שפותח בעצמו, מערכת זו צריכה להיות אמינה, ידידותית למשתמש ובטוחה. לדוגמה, במונחים של בקרת טמפרטורה, טמפרטורת מי הים צריכה להיות מבוקרת כראוי בהתבסס על הנסיבות הסביבתיות היומיומיות. המערכת נבדקה על ידי תרבית האלמוגים במשך חודש אחד, מה שאישר את אמינות המערכת.

בהשוואה למכלי ים רגילים או אקווריומים26, בהתבסס על ניסוי תרביות האלמוגים שלנו, לאחר קביעת הפרמטרים/התנאים של התרבית, כולל נוסחת החומר התוסף, תוכנית החלפת המים, מהירות הסירקולציה (כוח או מתח המשאבה ), עוצמת התאורה, פרופורציות זמן ההפעלה והכיבוי של משאבת האוויר וזמן התאורה, פרק הזמן לשירות ולתפעול היומי הוא פחות מ-10 דקות. בנוסף, לא התרחשו דליפות חשמל, קצר חשמלי, עומס יתר או תקריות אחרות במהלך תקופה זו, מה שממחיש את הידידותיות למשתמש והבטיחות של המערכת.

עם זאת, יש לציין כי בדיקת המערכת, הפעלה, השתלת אלמוגים/הדמיה ותחזוקה שוטפת הם השלבים החיוניים והקריטיים בפרוטוקול. דליפת מים בתוך המכשיר והתיישנות חלקי המכשיר יכולות להיות שתי בעיות שעלולות להתרחש לאורך תקופת זמן ארוכה יחסית. קהלים שרוצים לשכפל את המערכת הזאת חייבים לטפל בנושאים האלה.

מנקודת המבט של המיקרו-אקוסיסטם המלאכותי, פלטפורמה מודולרית זו יכולה להיות ניחנה ביכולת לחקור את המיקרוביום הקשור לאלמוגים בסביבה נשלטת במעבדה ולא בשטח, ובכך להוכיח את יכולת ההרחבה והחסכוניות שלו. לכן, מערכת תרביות אלמוגים זו צפויה לסייע ולהאיץ מחקרים הקשורים לאלמוגים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרס כלכלי מתחרה.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי תוכניות פיתוח מפתח המדינה למחקר בסיסי של סין (2021YFC3100502).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12V DC power supply Delixi Electric Co., Ltd. CDKU-S150W 12V12.5A
3% hydrogen peroxide solution Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd NULL NULL
75% ethanol solution Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd NULL NULL
Air pump Chongyoujia Supply Chain Management Co., Ltd. NHY-001 NULL
Air sterilizing filter Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-A NULL
Camera SONY Α7r4-ILCE-76M4A NULL
Coral nutrition solution Red Sea Aquatics Co., Ltd. 22101 Coral nutrition
Coral pro salt (sea salt) Red Sea Aquatics Co., Ltd. R11231 NULL
Cycle timer Leqing Shangjin Instrument Equipment Co., Ltd. CN102A 220V version
Double closed quick connector JOSOT Co., Ltd NL4-2103T NULL
Flow-through UV lamp Zhongshan Xinsheng Electronic technology Co., Ltd. 211 NULL
Four-channel transformer Dongguan Shanggushidai Electronic Technology Co., Ltd LM2596 NULL
Macro lens SONY FE 90mm F2.8 Macro G OSS NULL
Microbiome source solution Guangzhou BIOZYM Microbial Technology Co., Ltd. 303 NULL
Mini-photo studio Shaoxing Shangyu Photography Equipment Factory CM-45 NULL
PID temperature controller Guangdong Dongqi  Electric Co., Ltd. TE9-SC18W SSR version
Pump (for water) Zhongxiang Pump Co., Ltd. ZX43D Seaswater version
Pure water machine Kemflo (Nanjing) environmental technology Co, ltd kemflo A600 NULL
Solid-state relay Delixi Electric Co., Ltd. DD25A NULL
Surface active agents Guangzhou Liby Group Co., Ltd. Libai detergent NULL
Three-channel timer Leqing Changhong Intelligent Technology Co., Ltd. CHE325-3 220V version
Water sterilizing filter Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-L NULL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gardner, T. A., Côté, I. M., Gill, J. A., Grant, A., Watkinson, A. R. Long-term region-wide declines in Caribbean corals. Science. 301 (5635), 958-960 (2003).
  2. Kennedy, E. V., et al. Coral reef community changes in Karimunjawa national park, Indonesia: assessing the efficacy of management in the face of local and global stressors. Journal of Marine science and Engineering. 8 (10), 760-787 (2020).
  3. Cleary, D. F., et al. Coral reefs next to a major conurbation: a study of temporal change (1985−2011) in coral cover and composition in the reefs of Jakarta, Indonesia. Marine Ecology Progress Series. 501, 89-98 (2014).
  4. Sun, Y. F., Huang, L. T., McCook, L. J., Huang, H. Joint protection of a crucial reef ecosystem. Science. 337 (6611), 1163-1163 (2022).
  5. Huang, D. W., et al. Conservation of reef corals in the South China Sea based on species and evolutionary diversity. Biodiversity and Conservation. 25 (2), 331-344 (2016).
  6. Jiang, L., et al. Impacts of elevated temperature and pCO2 on the brooded larvae of Pocillopora damicornis from Luhuitou Reef, China: Evidence for local acclimatization. Coral Reefs. 39 (2), 331-344 (2020).
  7. Babcock, R. C., et al. Recurrent coral bleaching in north-western Australia and associated declines in coral cover. Marine and Freshwater Research. 72 (5), 620-632 (2021).
  8. Sweatman, H., Delean, S., Syms, C. Assessing loss of coral cover on Australia's Great Barrier Reef over two decades, with implications for longer-term trends. Coral Reefs. 30 (2), 521-531 (2011).
  9. Elliott, J. A., Patterson, M. R., Staub, C. G., Koonjul, M., Elliott, S. M. Decline in coral cover and flattening of the reefs around Mauritius (1998-2010). PeerJ. 6, e6014 (2018).
  10. Eddy, T. D., et al. Global decline in capacity of coral reefs to provide ecosystem services. One Earth. 4 (9), 1278-1285 (2021).
  11. Jones, G. P., McCormick, M. I., Srinivasan, M., Eagle, J. V. Coral decline threatens fish biodiversity in marine reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (21), 8251-8253 (2004).
  12. Hughes, T. P., et al. Global warming and recurrent mass bleaching of corals. Nature. 543 (7645), 373-377 (2017).
  13. Carpenter, K. E., et al. One-third of reef-building corals face elevated extinction risk from climate change and local impacts. Science. 321 (5888), 560-563 (2008).
  14. Hughes, T. P., et al. Spatial and temporal patterns of mass bleaching of corals in the Anthropocene. Science. 359 (6371), 80-83 (2018).
  15. Albright, R., et al. Reversal of ocean acidification enhances net coral reef calcification. Nature. 531 (7594), 362-365 (2016).
  16. Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
  17. Mason, R. A. Decline in symbiont densities of tropical and subtropical scleractinian corals under ocean acidification. Coral Reefs. 37 (3), 945-953 (2018).
  18. Prouty, N. G., et al. Vulnerability of Coral reefs to bioerosion from land-based sources of pollution. Journal of Geophysical Research: Oceans. 122 (12), 9319-9331 (2017).
  19. Heery, E. C., et al. Urban coral reefs: Degradation and resilience of hard coral assemblages in coastal cities of East and Southeast Asia. Marine Pollution Bulletin. 135, 654-681 (2018).
  20. Rosenberg, E., Koren, O., Reshef, L., Efrony, R., Zilber-Rosenberg, I. The role of microorganisms in coral health, disease and evolution. Nature Reviews: Microbiology. 5 (5), 355-362 (2007).
  21. Bui, V. N., et al. Diversity and biogeography of coral mucus-associated bacterial communities: The case of Acropora formosa. Journal of Marine Science and Engineering. 11 (1), 74 (2023).
  22. Hass, A. F., Smith, J. E., Thompson, M., Deheyn, D. D. Effects of reduced dissolved oxygen concentrations on physiology and fluorescence of hermatypic corals and benthic algae. PeerJ. 2, 235 (2014).
  23. Raj, K. D., et al. Low oxygen levels caused by Noctiluca scintillans bloom kills corals in Gulf of Mannar, India. Scientific Reports. 10 (1), 22133 (2020).
  24. Luo, Y. S., Zhao, J. L., He, C. P., Lu, Z. H., Lu, X. L. Miniaturized platform for individual coral polyps culture and monitoring. Micromachines. 11 (2), 127 (2020).
  25. Pang, A. P., Luo, Y. S., He, C. P., Lu, Z. H., Lu, X. L. A polyp-on-chip for coral long-term culture. Scientific Reports. 10 (1), 6964 (2020).
  26. Yan, L. I., et al. Effects of live rock removal of dissolved inorganic nitrogen in coral aquaria. Acta Oceanologica Sinica. 36 (12), 87-94 (2017).

Tags

מערכת מיקרו-מכשירים משולבת גידול אלמוגים ניטור אלמוגים סביבת תרבית אלמוגים בקרה מדויקת שימור אלמוגים מחקר הגנה על אלמוגים בקרת טמפרטורה איכות מים ריכוז חמצן מומס ספקטרום אור תכנון מודולרי תחזוקת מערכות יחסים סימביוטיים מיקרואורגניזמים ניטור כמותי
מערכת מיקרו-מכשירים משולבת לגדילה וניטור של אלמוגים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Yuan, T., Huang, H., Lu,… More

Zhao, J., Yuan, T., Huang, H., Lu, X. An Integrated Micro-Device System for Coral Growth and Monitoring. J. Vis. Exp. (197), e65651, doi:10.3791/65651 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter