Summary
Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een modulair bestuurbaar micro-device systeem dat kan worden toegepast voor het langdurig kweken en monitoren van zeekoralen.
Abstract
Koralen zijn fundamentele organismen in mariene en kustecosystemen. Met de vooruitgang van het onderzoek naar koraalbescherming in de afgelopen jaren, is er veel vraag naar nauwkeurige controle van de koraalkweekomgeving voor het behoud en de studie van koraal. Hier hebben we een semi-gesloten micro-apparaatsysteem voor koraalkweek ontwikkeld als een multifunctioneel platform, dat nauwkeurige en programmeerbare temperatuurregeling, een steriele beginomgeving, langdurige stabiele waterkwaliteit, een instelbare opgeloste zuurstofconcentratie en een aangepast lichtspectrum voor koralen kan bieden. Dankzij het modulaire ontwerp kan het koraalkweeksysteem worden geüpgraded of aangepast door gewenste nieuwe modules te installeren of bestaande te verwijderen. Momenteel kunnen de koralen in het monster, onder de juiste omstandigheden en met het juiste systeemonderhoud, minstens 30 dagen in een gezonde toestand overleven. Bovendien kan dit koraalkweeksysteem, vanwege de controleerbare en steriele uitgangsomgeving, onderzoek naar de symbiotische relatie tussen koralen en bijbehorende micro-organismen ondersteunen. Daarom kan dit micro-device systeem worden toegepast om zeekoralen op een relatief kwantitatieve manier te monitoren en te onderzoeken.
Introduction
De achteruitgang van ecosystemen van koraalriffen heeft zich de afgelopen 70 jaar wereldwijd voorgedaan. Rekening houdend met alle grote koraalgebieden in Midden-Amerika1, Zuidoost-Azië 2,3,4,5,6, Australië 7,8 en Oost-Afrika9, is de wereldwijde dekking van koraalriffen sinds de jaren 1950 gehalveerd10. Dit massale verlies van koraalriffen heeft geleid tot ecologische en economische problemen. Door bijvoorbeeld de aan-/afwezigheid en abundantie van allerlei soorten koraalafhankelijke vissen gedurende 8 jaar te traceren, concludeerden onderzoekers dat de achteruitgang van het koraal direct heeft geleid tot een substantiële afname van de visbiodiversiteit en -overvloed in Papoea-Nieuw-Guinea11. Dit resultaat bewees dat de achteruitgang van koraal niet alleen de op koraalriffen gebaseerde biologische systemen kan ondermijnen, maar ook de visserij-inkomsten kan verminderen.
Gedurende tientallen jaren van veldonderzoeken, waaronder directe monitoring, teledetectie en gegevensvergelijking, heeft de wetenschappelijke gemeenschap verschillende factoren geïdentificeerd die de massale achteruitgang van het koraal veroorzaken. Een belangrijke reden voor de massale achteruitgang van koraal is koraalverbleking veroorzaakt door hoge zeewatertemperaturen12,13. Door verbleking en meteorologische gegevens te combineren, hebben wetenschappers geconcludeerd dat koraalverbleking vaker voorkomt in El Niño-Southern Oscillation-fasen14. Een andere reden voor de achteruitgang van het koraal is de verzuring van de oceaan. Door de verhoogde CO2 -concentratie in zowel de atmosfeer als het zeewater lost calciumcarbonaat sneller op dan voorheen, waardoor netto koraalrifverkalking ontstaat15. Er is inderdaad geconcludeerd dat wanneer de CO2 -concentratie in de atmosfeer boven de 500 ppm komt, tientallen miljoenen mensen zullen lijden en de koraalriffen het risico lopen aanzienlijk te verslechteren en symbiodinium los te laten16,17. Er zijn ook andere factoren die de overleving van koraal kunnen beïnvloeden, zoals verontreinigende stoffen aan de kust die de achteruitgang van koraal veroorzaken of versnellen. Onderzoekers in Hawaï maten de koolstof-, zuurstof- en stikstofisotopen in koralen, samen met het opgeloste anorganische carbonaat en de gerelateerde voedingsstoffen (NH4+, PO4 3-, NO2− en NO3−), en concludeerden dat vervuiling van het land de kustverzuring en bio-erosie van koralenvergrootte 18. Naast vervuiling brengt verstedelijking ook de overleving van koraal in gevaar en veroorzaakt het een relatief lage architecturale complexiteit in koralen, zoals blijkt uit een onderzoek naar de overlevingsstatus van koraal in Singapore, Jakarta, Hong Kong en Okinawa. De impact van antropogene stressoren en de gesuperponeerde effecten van klimaatverandering leiden dus tot een wijdverbreide verminderde biodiversiteit op koraalriffen en een daarmee gepaard gaande achteruitgang van de ecologische functie en veerkracht van koraal19.
Er moet ook worden opgemerkt dat een groot aantal micro-organismen deelnemen aan de fysiologische functies van koralen, waaronder stikstoffixatie, chitine-afbraak, de synthese van organische verbindingen en immuniteit20, en deze micro-organismen moeten dus worden opgenomen bij het overwegen van de achteruitgang van koraalriffen. In natuurlijke omgevingen, zoals koraalriffen, veroorzaken veel factoren hypoxische of anoxische omstandigheden, waaronder onvoldoende watercirculatie, algenexsudaat en algenovergroei. Dit fenomeen heeft een negatieve invloed op de populatieverspreiding van koraal en koraalgerelateerde micro-organismen. Vietnamese wetenschappers ontdekten bijvoorbeeld dat in Nha Trang, Phu Quoc en Ujung Gelam, de bacteriële samenstelling in het koraal Acropora Formosa op verschillende locaties kan worden beïnvloed door opgeloste zuurstof. Onderzoekers in de Verenigde Staten onderzochten hypoxische of anoxie-omstandigheden in koralen en ontdekten dat algenexsudaten microbiële activiteit kunnen mediëren, wat leidt tot gelokaliseerde hypoxische omstandigheden, die koraalsterfte in de directe omgeving kunnen veroorzaken. Ze ontdekten ook dat koralen verlaagde zuurstofconcentraties konden verdragen, maar alleen boven een bepaalde drempel die werd bepaald door een combinatie van de blootstellingstijd en dezuurstofconcentratie22. Onderzoekers in India ontdekten dat wanneer Noctiluca scintillans-algen bloeiden, de opgeloste zuurstof daalde tot 2 mg/L. Onder deze concentratie stierf ongeveer 70% van de Acropora montiporacan als gevolg van hypoxische aandoeningen.
Alle bovengenoemde feiten en factoren suggereren dat veranderingen in het milieu leiden tot de achteruitgang van koraalriffen. Om rifkoralen onder bepaalde omstandigheden te kweken en te bestuderen, is het belangrijk om nauwkeurig en uitgebreid een controleerbare microscopische omgeving op te bouwen waarin rifkoralen kunnen leven. Normaal gesproken richten wetenschappers zich op temperatuur, licht, waterstroom en voedingsstoffen. Andere kenmerken, zoals de concentratie van opgeloste zuurstof, de overvloed aan micro-organismen en de diversiteit van micro-organismen in het zeewater, worden echter vaak genegeerd. Daartoe heeft onze groep de mogelijkheid onderzocht om kleine apparatuur toe te passen om koraalpoliepen te kweken in een relatief gecontroleerde omgeving24,25. In dit werk hebben we een modulair micro-apparaatsysteem voor koraalkweek ontworpen en gebouwd. Dit modulaire micro-apparaatsysteem kan een controleerbare micro-omgeving bieden in termen van temperatuur, lichtspectrum, opgeloste zuurstofconcentratie, voedingsstoffen en micro-organismen, enz., en heeft de capaciteit voor uitbreiding en upgrade.
Modules en functies van het apparaat
Het micro-device systeem is geïnspireerd op het Berlijnse systeem26, maar in het huidige systeem worden geen levende stenen gebruikt. Zoals te zien is in figuur 1, bestaat het huidige systeem uit zes hoofdmodules, twee borstelloze motorpompen, een gaspomp, een doorstroom-UV-lamp, een voeding, bepaalde elektronische regelcomponenten en de bijbehorende draden en schroeven. De zes hoofdmodules omvatten een zeewateropslagmodule (met een luchtpomp en temperatuursensor), een temperatuurregelmodule, een algenzuiveringsmodule, een microbiële zuiveringsmodule, een actieve koolzuiveringsmodule en een koraalkweekmodule.
Architectuur van het apparaat
Zoals te zien is in afbeelding 2 en afbeelding 3, kan het totale micro-apparaatsysteem horizontaal worden verdeeld in twee compartimenten met een temperatuurregelmodule ertussen. Om veiligheidsredenen zijn alle zeewaterhoudende modules en onderdelen in het linkercompartiment geplaatst, het zogenaamde kweekcompartiment. De andere elektronische onderdelen worden in het rechter compartiment geplaatst, het elektronische compartiment genaamd. Beide compartimenten zijn verzegeld of verpakt in schelpen. De temperatuurregelmodule is bevestigd in een tussenliggende scheidingsplaat. De schaal van het kweekcompartiment bestaat uit een plint en drie schroefplaten. Dit ontwerp zorgt voor een dichte behuizing en vergemakkelijkt de werking van het systeem. Bovendien bevordert de dichtheid een nauwkeurige temperatuurregeling. De behuizing van het elektronische compartiment bevat een plint, twee schroefbevestigingsplaten en een bedieningspaneel aan de voorkant.
Watercirculatie
Een binnen- en buitencirculatielus voor zeewater die is aangesloten op de zeewateropslagmodule is vooraf ontworpen. De binnenste circulatielus verbindt met succes de zeewateropslagmodule, de temperatuurregelmodule, de doorstroom-UV-lamp, de algenzuiveringsmodule en de microbiële zuiveringsmodule. Deze circulatielus heeft tot doel de koralen geschikte fysiochemische en fysiologische zeewatercondities te bieden, en er is geen frequent onderhoud nodig. De algenzuiveringsmodule bevat Chaetomorpha-algen , die de extra voedingsstoffen (nitraat en fosfaat) in het water opnemen. De microbiële zuiveringsmodule bevat het bacteriecultuursubstraat, dat het microbioom cultiveert om nitriet en ammonium om te zetten in nitraat voor waterzuivering. Al deze modules hoeven alleen onder kritieke omstandigheden te worden vervangen.
De buitenste circulatielus verbindt achtereenvolgens de zeewateropslagmodule, de koraalkweekmodule en de actieve koolmodule. Deze circulatielus heeft tot doel de koralen licht, dichtheid, waterstroming en een hoge zeewaterkwaliteit te bieden. Het zeewater kan worden ververst via een waterinlaat en een wateruitlaat. Additieven worden toegevoegd via een driewegklep en het zeewatermonster kan ook uit deze klep worden gehaald voor inspectie. Lucht kan via een luchtinlaat naar binnen worden gepompt en via een luchtuitlaat worden afgevoerd.
Elektronisch ontwerp
Een 220 V AC-voeding met een schakelaar en een zekering wordt gebruikt voor het hele systeem. Het ingangsvermogen is verdeeld in vier takken. De eerste tak gaat naar een 12 V DC-voeding, die het verwarmingspaneel, het koelpaneel en de koelventilator rechtstreeks van stroom voorziet. Deze tak voedt ook indirect twee pompen en twee verlichtingspanelen via een vierkanaals DC-transformator. De tweede tak gaat naar een PID-temperatuurregelaar. De derde tak gaat naar de voeding van een luchtpomp. De laatste tak wordt aangesloten op een UV-lampvoeding. Een solid-state relais verbindt de PID-temperatuurregelaar en het koelpaneel in de temperatuurregelmodule. Een gewoon relais wordt gebruikt om de PID-temperatuurregelaar en het verwarmingspaneel aan te sluiten. De vierkanaals DC-transformator zet de spanning om in de benodigde spanning.
Er zijn twee bedieningspanelen aan de rechterkant van het systeem. Er zijn vier schakelaars en een controller voor de UV-lamp op het bovenpaneel, waaronder een hoofdschakelaar, een UV-lampschakelaar, een luchtpompschakelaar en een temperatuurregelingsschakelaar. De hoofdschakelaar regelt de 12 V-voeding van het systeem.
Een PID-temperatuurregelaar, een cyclustimer, een vierkanaals DC-transformator en een driekanaals timer bevinden zich op het voorpaneel. De PID-temperatuurregelaar past de watertemperatuur aan door de verwarmings- en koelpanelen in de temperatuurregelmodule aan te sturen. De temperatuurregelmodule werkt alleen als de binnencirculatiepomp werkt en het water langs de temperatuurregelmodule stroomt. De cyclustimer is aangesloten op de voedingskabel van de luchtpomp. Het doel is om de werktijdperiode aan de luchtpomp toe te wijzen. Er is ook een driekanaals timer in het elektronische compartiment. Deze timer regelt de werktijdperiode voor de luchtpomp, koraallicht en algenlicht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De koralen die voor dit onderzoek werden gebruikt, waren Seriatopora caliendrum, die in ons laboratorium worden gekweekt. Alle koralen werden vriendelijk ter beschikking gesteld door het South China Sea Institute of Oceanology, University of Chinese Academy of Sciences.
1. Inspectie en opstarten
NOTITIE: Elke module moet afzonderlijk worden getest op dichtheid en werking voordat het systeem wordt gemonteerd. Gedeïoniseerd water moet worden gebruikt om de dichtheid van de module te testen. Commerciële details van alle modulecomponenten zijn te vinden in de materiaaltabel.
- Dichtheidstest van de verbinding tussen de modules
- Sluit alle modules en de pompen aan (Figuur 1) en zorg ervoor dat het water gedurende ten minste 30 minuten cirkelvormig over het systeem stroomt.
- Controleer alle naden op mogelijke lekkageproblemen. Als er lekkage optreedt in een van de hechtnaden, breng dan lijm van buitenaf aan. Als er lekkage optreedt in een van de verbindingsnaden, draai de verbinding dan weer vast en controleer of de afdichtingspakking moet worden vervangen.
- Laden
- Na de dichtheidstest het water binnenin evacueren en drogen.
- Laad de juiste inhoud.
OPMERKING: Het bacteriekweeksubstraat wordt bijvoorbeeld in de microbiële zuiveringsmodule geladen en de Chaetomorpha-algen worden in de algenzuiveringsmodule geladen.
- Assembleren en testen van het hele systeem
- Bevestig de modules na het laden op de plint met behulp van de schroeven.
- Verbind de binnenste circulatiemodules met de buitenste circulatiemodules (zonder de koraalkweekmodule).
- Voor de zeewaterperfusie injecteert u het zeewater via de waterinlaat in de zeewateropslagmodule. Wanneer het waterpeil 3 cm hoger is dan de waterinlaten van de pompen, schakelt u de pompen in en gaat u door met het injecteren van het zeewater totdat de binnenste circulatiemodules vol zijn met het zeewater, met ruimte voor lucht (3 cm hoog) in de zeewateropslagmodule.
OPMERKING: Het zeewater wordt bereid met zuiver water en zeezout (zie de materiaaltabel).
- Systeem test
- Zet alle schakelaars aan en stel beide zeewaterpompspanningen in op 9 V. Stel de watertemperatuur in op 25 °C.
- Stel de cyclustimer in op "1 minuut aan en 1 minuut uit". Stel alle drie de kanalen van de driekanaals timer in op "9:00 uur aan" en "17:00 uur uit".
- Bewaak het systeem minimaal 24 uur op eventuele storingen. Als er geen probleem wordt gevonden, is het systeem klaar voor de volgende stap van de operatie.
OPMERKING: Het is belangrijk om alle luchtbellen in alle modules te verwijderen, behalve de zeewateropslagmodule. Het hele systeem kan iets worden opgetild en geschud om de luchtbellen van de module-inlaat naar de uitlaat te verplaatsen.
2. Totstandbrenging van de microbiële omgeving
OPMERKING: Het opzetten van een koraalvriendelijke microbiële omgeving is noodzakelijk vóór koraaltransplantatie. Om micro-organismen in het systeem te kweken, met name in de microbiële zuiveringsmodule, moet de verdunde probiotische oplossing worden toegevoegd als microbiële bron voor het nitrificatiesysteem.
- De bron van het microbioom toevoegen
- Voeg al roerend 1 ml van de commerciële microbioombronoplossing (zie de materiaaltabel) toe aan 500 ml zeewater.
- Injecteer 50 ml van de bovenstaande verdunde oplossing en 10 μl van de commerciële koraalvoedingsoplossing (zie de materiaaltabel) in het circulatiesysteem.
- Microbioom kweek
- Schakel de binnenste circulatiepomp en een luchtpomp in om het microbioom gedurende 21 dagen te kweken. De vereisten voor het zuurstofgehalte van het microbioom bepalen de on-time en off-time verhoudingen van de luchtpomp.
OPMERKING: Deze stap is bedoeld om het microbioom van de zeewaterzuivering te kweken en de groei van het microbioom dat gunstig is voor koraal in het systeem te bevorderen. In dit proces begint het zeewater van de tweede dag tot de vierde dag na de microbioominjectie modderig te worden. Na dit microbioomkweekproces moet de afbraakcapaciteit van voedingsstoffen in het systeem worden vastgesteld. Opgemerkt moet worden dat om aan verschillende experimentele vereisten te voldoen, verschillende microbioombronnen kunnen worden gebruikt om de microbioomomgeving vast te stellen.
- Schakel de binnenste circulatiepomp en een luchtpomp in om het microbioom gedurende 21 dagen te kweken. De vereisten voor het zuurstofgehalte van het microbioom bepalen de on-time en off-time verhoudingen van de luchtpomp.
3. Koraaltransplantatie en -groei
- Koraal transplantatie
- Snijd de ruwe koraaltakken af met lengteschubben van 3-5 cm en plak deze koraaltakken vervolgens op 3D-geprinte koraalsteunvoeten (Supplementary Coding File 1).
- Plaats deze monsters van koraaltakken minimaal 7 dagen terug in de originele zeewatertank voor herstel.
- Bevestig de koraalsteunbasis met lijm op de rotatie-eenheid. Monteer de koraalkweekmodule en sluit deze aan op de buitenste circulatielus.
- Beeldvorming van de koraalgroei
OPMERKING: De koraalbeelden in de loop van de tijd moeten worden verkregen om de koraalgroei te evalueren. Het gebruik van een demontabele verbinding maakt het gemakkelijk om de koraalkweekmodule uit het hele systeem te verwijderen voor beeldvorming. Daartoe wordt een mini-fotostudio gebouwd met passende lichtomstandigheden. Een camera met een macrolens (zie de Materiaaltabel) wordt gebruikt om de morfologieën van het koraaloppervlak in verschillende perioden vast te leggen. De koraalrotatie-eenheid in de kweekmodule kan buiten de module worden bediend met behulp van de contactloze modus. Door aan de magnetische hendel naast de module te draaien, kunnen koraalbeelden vanuit een volledige hoek worden vastgelegd.- Plaats de camera op de bovenkant van de studio en leg de beelden vast vanuit een verticaal beeld.
- Plaats de koraalkweekmodule in de mini-fotostudio met het koraal in het midden en aan de onderkant.
- Leg de koraalfoto's vast door aan de buitenste handgreep te draaien.
OPMERKING: Om redenen van overleving van koraal moet de tijdsperiode van beeldvorming worden beperkt tot 15 minuten.
4. Routineonderhoud van het systeem
NOTITIE: Het routineonderhoud omvat lekkage-inspectie, storingsinspectie, toevoeging van additieven en zeewaterverversing.
- Lekkage inspectie
- Inspecteer de plint op watervlekken of druppels. Omdat de afdekmantel van het systeem transparant is, is het visueel inspecteren van de waterlekkage eenvoudig en handig. Deze inspectie moet elke dag worden uitgevoerd.
- Controle van storingen
- Zorg ervoor dat deze stap de inspectie van de watertemperatuur, pompen, lichtspanningen, luchtpompstatus en timerstatus omvat, inclusief het visueel controleren en registreren van de ingestelde watertemperatuur, real-time temperatuur, transformatoruitgangsspanningen, UV-lampinstellingen en timerwerkstatus. Deze inspectie moet elke dag worden uitgevoerd.
NOTITIE: Bepaalde systeemstoringen kunnen worden gediagnosticeerd op basis van abnormale geluiden of ongebruikelijke temperaturen.
- Zorg ervoor dat deze stap de inspectie van de watertemperatuur, pompen, lichtspanningen, luchtpompstatus en timerstatus omvat, inclusief het visueel controleren en registreren van de ingestelde watertemperatuur, real-time temperatuur, transformatoruitgangsspanningen, UV-lampinstellingen en timerwerkstatus. Deze inspectie moet elke dag worden uitgevoerd.
- Additieve toevoeging
OPMERKING: Additieve toevoeging is het proces waarbij voedingsstoffen en andere reagentia aan het systeem worden toegevoegd.- Zuig bijvoorbeeld 10 ml van het zeewater af met behulp van een spuit uit de driewegklep tussen de actieve koolmodule en de zeewatermodule.
- Los de additieven op in het geëxtraheerde zeewater.
- Injecteer de oplossing terug in het systeem via de driewegklep. In reële gevallen worden de soorten, hoeveelheden en toevoegingsfrequenties van de additieven bepaald door de kwaliteit van het zeewater van het systeem, rekening houdend met de experimentele vereisten.
- Water verversen
OPMERKING: Routinematige waterverversing kan de toxische concentratie en eutrofiëring in het kweeksysteem verminderen. Als de experimentele omstandigheden het toelaten, kan het verversen van het zeewater een routineoperatie zijn.- Schakel de stroom voor het hele systeem uit en trek om veiligheidsredenen de stekker uit het stopcontact.
- Verwijder de koraalkweekmodule.
- Sluit de buitenleiding van het afvalwater aan op de afvoer in de zeewateropslagmodule.
- Draai het systeem en plaats het systeem met de voorkant naar beneden.
- Schakel het stopcontact in. Laat het binnenste zeewater uit het systeem stromen.
NOTITIE: Gebruik geen pomp om het water eruit te zuigen, aangezien de onderdruk aan de binnenkant het systeem kan beschadigen. - Laat een geschikte hoeveelheid zeewater ontsnappen en schakel de uitlaat uit. De hoeveelheid geloosd zeewater wordt bepaald door de fysiologische toestand van de koralen.
- Reset het systeem en injecteer het nieuw bereide zeewater via de waterinlaat in het systeem.
- Installeer de koraalkweekmodule terug in het systeem.
- Schakel de systeemstroom in en wacht tot het hele systeem weer normaal is.
5. Vervanging van de module
NOTITIE: Als een module moet worden vervangen vanwege een storing of volgens de experimentele regeling, is het belangrijk om de module te vervangen zonder het kweekexperiment op te schorten of negatief te beïnvloeden.
- Schakel voor de zeewateropslagmodule, algenzuiveringsmodule, microbiële zuiveringsmodule of actieve koolzuiveringsmodule de binnencirculatiepomp uit en draai de bevestigingsschroeven voor de module los.
- Koppel de leidingen tussen de twee samengevoegde modules los en demonteer de te vervangen module van het systeem. De laatste stap is het monteren van de nieuwe module in het systeem door de pijpleidingen aan te sluiten en de bevestigingsschroeven weer vast te draaien.
NOTITIE: De vervanging van de temperatuurregelmodule is op de een of andere manier anders. Eerst moeten alle draden worden losgekoppeld van de module. Vervolgens worden de bevestigingsbouten losgedraaid en worden de leidingen losgekoppeld. Daarna wordt het verwarmingspaneel gedemonteerd en wordt de module uit het systeem gedemonteerd. Het installatieproces voor de temperatuurregelmodule is het omgekeerde proces.
6. Het systeem afsluiten en het systeem in de oorspronkelijke staat herstellen
OPMERKING: Het systeem zal uiteindelijk worden uitgeschakeld na het noodzakelijke koraalkweekexperiment. Het systeem moet in de oorspronkelijke staat worden hersteld.
- Het systeem afsluiten
- Schakel de systeemstroom uit en trek de stekker uit het stopcontact.
- Evacueer het zeewater in het systeem.
- Demonteer de modules in de volgende volgorde: de koraalkweekmodule, de actieve koolzuiveringsmodule, de zeewateropslagmodule, de algenzuiveringsmodule, de microbiële zuiveringsmodule, de UV-lamp, de twee circulatiepompen en de temperatuurregelmodule.
- Herstel van het systeem
- Reinig alle modules met zuiver water en oppervlakteactieve stoffen (zie de tabel met materialen).
- Steriliseer de modules met 3% waterstofperoxide-oplossing.
NOTITIE: Gebruik geen organisch oplosmiddel om de modules te wassen. - Droog de modules gedurende 12 uur bij 40 °C. Zorg ervoor dat al het water in het systeem is verdampt.
- Reinig alle pijpleidingen en kleppen met dezelfde oppervlakteactieve stoffen.
7. Modificatie voor de gecontroleerde omgeving van micro-organismen
OPMERKING: Afgezien van het koraalkweekexperiment, moeten voor bepaalde speciale experimenten, zoals het verwerven van een gecontroleerde omgeving met micro-organismen in het systeem, de microbioomsoort en -overvloed strikt worden gecontroleerd. Het meest innovatieve kenmerk van ons koraalkweeksysteem is dat de fysiologische activiteit van het koraal kan worden onderzocht in een specifieke microbiële omgeving in een relatief gesloten micro-ecosysteem. Het uitvoeren van deze functie vereist een andere bedieningsprocedure.
- Pre-sterilisatie
- Steriliseer alle modules, pijpleidingen en kleppen met een 3% waterstofperoxide-oplossing voordat u het systeem monteert.
- Steriliseer het bacteriekweeksubstraat via autoclaveren.
- Steriliseer Chaetomorpha-algen met 75% ethanoloplossing en droog ze af met steriel papier.
- Systeemmodificatie en sterilisatie
- Voeg bij het monteren van het systeem een luchtsterilisatiefilter (zie de materiaaltabel) toe tussen de luchtpomp en de zeewateropslagmodule.
- Voeg een watersteriliseerfilter toe tussen de inlaat en de driewegklep. Deze stap zorgt ervoor dat de lucht en het water die in het systeem worden geïnjecteerd, worden gesteriliseerd.
- Introduceer ozon in het systeem om het resterende microbioom te elimineren.
- Spoel de resterende ontsmettingsmiddelen drie keer af met steriel zeewater en injecteer het steriele zeewater in het systeem.
- Voor alleen de totstandbrenging van de microbiële omgeving, injecteert u de microbioombronoplossing via de wateruitlaat.
NOTITIE: Gebruik de waterinlaat niet om de microbioombron te injecteren. Andere reagentia en zeewater worden nog steeds via de waterinlaat geïnjecteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nauwkeurigheid temperatuurregeling
De systeemtemperatuur is normaal ingesteld op 23-28 °C, afhankelijk van de koraalsoort. Als een van de belangrijkste factoren kan temperatuurschommeling echter een sterke invloed hebben op de overleving van koraal. Daarom is de nauwkeurigheid van de temperatuurregeling een doorslaggevende factor voor het koraalkweeksysteem. Een temperatuursensor en een onafhankelijke datacollector met een temperatuurbereik van 9 °C tot 32 °C kunnen worden gebruikt om de nauwkeurigheid van de temperatuurregeling in de koraalkweekmodule te testen. We stelden de zeewatertemperatuur van het systeem in op 24 °C en maten tegelijkertijd de zeewater- en kamertemperatuur. Zoals te zien is in figuur 4, vertegenwoordigt de rode curve de gemeten fluctuatie van de kamertemperatuur en de zwarte curve de gemeten fluctuatie van de zeewatertemperatuur in de koraalkweekmodule. Over 14 uur bedroeg de gemeten gemiddelde temperatuur 23,8 °C en de standaarddeviatie 0,1 °C. De temperatuurregeling van het zeewater in het systeem was relatief nauwkeurig.
Resultaat koraalcultuur
Normaal gesproken strekt gezond koraal zijn tentakels vrij uit wanneer de omgevingsomstandigheden voldoen aan de overlevingsvereisten van het koraal, zoals weergegeven in figuur 5. Dit criterium verifieert over het algemeen de status van het koraal en kan worden gebruikt om te controleren op omgevingsstressoren. Zoals te zien is in figuur 5B, strekten de tentakels van het monsterkoraal zich meer dan 1 maand uit zonder te worden verstoord. Dit geeft aan dat het systeem lange tijd een geschikte overlevingsomgeving voor het koraal bood. Deze kweekperiode zou lang genoeg moeten zijn voor de meeste koraalexperimenten en -analyses in het laboratorium. Uit figuur 5 blijkt ook dat het praktisch haalbaar is om de morfologische analyse uit te voeren door het koraalgroeiproces in beeld te brengen.
Afbeelding 1: Schematische module-aansluiting voor het micro-device-systeem. De afgeronde rechthoeken stellen modules of pompen voor; De pijllijnen stellen water- of luchtleidingen voor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 2: Vooraanzicht van het micro-device systeem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bovenaanzicht van het micro-device systeem. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Experimentele resultaten van de controle van de zeewatertemperatuur. Rode curve: fluctuatie van de kamertemperatuur; Zwarte curve: gemeten temperatuurfluctuatie van het zeewater in het systeem. De ingestelde temperatuur van het systeem was 24 °C. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Koraalkweekmodule met een ingezoomd koraalbeeld . (A) Om een vergelijking te maken, werden vier koralen op de corresponderende steunvoeten geplaatst met een lege in de koraalkweekmodule. (B) Een ingezoomde koraalopname van het koraal Seriatopora caliendrum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend coderingsbestand 1: Ontwerp voor het 3D-printen van koraalsteunvoeten. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit koraalkweeksysteem is ontworpen om een relatief natuurlijke of aangepaste micro-omgeving te simuleren en te bieden waarin koralen kunnen worden getransplanteerd en overleven. Ondertussen moet dit systeem, als zelf ontwikkelde apparatuur, betrouwbaar, gebruiksvriendelijk en veilig zijn. In termen van temperatuurregeling moet de zeewatertemperatuur bijvoorbeeld op de juiste manier worden geregeld op basis van de dagelijkse omgevingsomstandigheden. Het systeem werd getest door het koraal gedurende 1 maand te kweken, wat de betrouwbaarheid van het systeem bevestigde.
In vergelijking met normale zeetanks of aquaria26, gebaseerd op ons koraalkweekexperiment, na het instellen van de kweekparameters/omstandigheden, inclusief de formule van het additief middel, het uitwisselingswaterplan, de circulatiesnelheid (pompvermogen of -spanning), de verlichtingsintensiteit, de aan- en uitschakeltijdverhoudingen van de luchtpomp en de verlichtingstijd, is de tijdsperiode voor de dagelijkse service en werking minder dan 10 minuten. Bovendien hebben zich in deze periode geen elektrische lekkages, kortsluitingen, overbelasting of andere incidenten voorgedaan, wat de gebruiksvriendelijkheid en veiligheid van het systeem aantoont.
Er moet echter worden opgemerkt dat de systeeminspectie, het opstarten, koraaltransplantatie/beeldvorming en routineonderhoud de essentiële en kritieke stappen in het protocol zijn. Het lekken van water in het apparaat en de veroudering van de onderdelen van het apparaat kunnen twee problemen zijn die zich over een relatief lange periode kunnen voordoen. Het publiek dat dit systeem wil repliceren, moet voor deze problemen zorgen.
Vanuit het perspectief van het kunstmatige micro-ecosysteem kan dit modulaire platform worden begiftigd met de mogelijkheid om het koraal-geassocieerde microbioom te bestuderen in een controleerbare omgeving in het laboratorium in plaats van in het veld, waardoor de schaalbaarheid en kosteneffectiviteit worden aangetoond. Daarom wordt verwacht dat dit koraalkweeksysteem koraalgerelateerde studies zal helpen en versnellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerend financieel belang te hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de State Key Development Programs for Basic Research of China (2021YFC3100502).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12V DC power supply | Delixi Electric Co., Ltd. | CDKU-S150W | 12V12.5A |
| 3% hydrogen peroxide solution | Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd | NULL | NULL |
| 75% ethanol solution | Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd | NULL | NULL |
| Air pump | Chongyoujia Supply Chain Management Co., Ltd. | NHY-001 | NULL |
| Air sterilizing filter | Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd | S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-A | NULL |
| Camera | SONY | Α7r4-ILCE-76M4A | NULL |
| Coral nutrition solution | Red Sea Aquatics Co., Ltd. | 22101 | Coral nutrition |
| Coral pro salt (sea salt) | Red Sea Aquatics Co., Ltd. | R11231 | NULL |
| Cycle timer | Leqing Shangjin Instrument Equipment Co., Ltd. | CN102A | 220V version |
| Double closed quick connector | JOSOT Co., Ltd | NL4-2103T | NULL |
| Flow-through UV lamp | Zhongshan Xinsheng Electronic technology Co., Ltd. | 211 | NULL |
| Four-channel transformer | Dongguan Shanggushidai Electronic Technology Co., Ltd | LM2596 | NULL |
| Macro lens | SONY | FE 90mm F2.8 Macro G OSS | NULL |
| Microbiome source solution | Guangzhou BIOZYM Microbial Technology Co., Ltd. | 303 | NULL |
| Mini-photo studio | Shaoxing Shangyu Photography Equipment Factory | CM-45 | NULL |
| PID temperature controller | Guangdong Dongqi Electric Co., Ltd. | TE9-SC18W | SSR version |
| Pump (for water) | Zhongxiang Pump Co., Ltd. | ZX43D | Seaswater version |
| Pure water machine | Kemflo (Nanjing) environmental technology Co, ltd | kemflo A600 | NULL |
| Solid-state relay | Delixi Electric Co., Ltd. | DD25A | NULL |
| Surface active agents | Guangzhou Liby Group Co., Ltd. | Libai detergent | NULL |
| Three-channel timer | Leqing Changhong Intelligent Technology Co., Ltd. | CHE325-3 | 220V version |
| Water sterilizing filter | Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd | S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-L | NULL |
References
- Gardner, T. A., Côté, I. M., Gill, J. A., Grant, A., Watkinson, A. R. Long-term region-wide declines in Caribbean corals. Science. 301 (5635), 958-960 (2003).
- Kennedy, E. V., et al. Coral reef community changes in Karimunjawa national park, Indonesia: assessing the efficacy of management in the face of local and global stressors. Journal of Marine science and Engineering. 8 (10), 760-787 (2020).
- Cleary, D. F., et al. Coral reefs next to a major conurbation: a study of temporal change (1985−2011) in coral cover and composition in the reefs of Jakarta, Indonesia. Marine Ecology Progress Series. 501, 89-98 (2014).
- Sun, Y. F., Huang, L. T., McCook, L. J., Huang, H. Joint protection of a crucial reef ecosystem. Science. 337 (6611), 1163-1163 (2022).
- Huang, D. W., et al. Conservation of reef corals in the South China Sea based on species and evolutionary diversity. Biodiversity and Conservation. 25 (2), 331-344 (2016).
- Jiang, L., et al. Impacts of elevated temperature and pCO2 on the brooded larvae of Pocillopora damicornis from Luhuitou Reef, China: Evidence for local acclimatization. Coral Reefs. 39 (2), 331-344 (2020).
- Babcock, R. C., et al. Recurrent coral bleaching in north-western Australia and associated declines in coral cover. Marine and Freshwater Research. 72 (5), 620-632 (2021).
- Sweatman, H., Delean, S., Syms, C. Assessing loss of coral cover on Australia's Great Barrier Reef over two decades, with implications for longer-term trends. Coral Reefs. 30 (2), 521-531 (2011).
- Elliott, J. A., Patterson, M. R., Staub, C. G., Koonjul, M., Elliott, S. M. Decline in coral cover and flattening of the reefs around Mauritius (1998-2010). PeerJ. 6, e6014 (2018).
- Eddy, T. D., et al. Global decline in capacity of coral reefs to provide ecosystem services. One Earth. 4 (9), 1278-1285 (2021).
- Jones, G. P., McCormick, M. I., Srinivasan, M., Eagle, J. V. Coral decline threatens fish biodiversity in marine reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (21), 8251-8253 (2004).
- Hughes, T. P., et al. Global warming and recurrent mass bleaching of corals. Nature. 543 (7645), 373-377 (2017).
- Carpenter, K. E., et al. One-third of reef-building corals face elevated extinction risk from climate change and local impacts. Science. 321 (5888), 560-563 (2008).
- Hughes, T. P., et al. Spatial and temporal patterns of mass bleaching of corals in the Anthropocene. Science. 359 (6371), 80-83 (2018).
- Albright, R., et al. Reversal of ocean acidification enhances net coral reef calcification. Nature. 531 (7594), 362-365 (2016).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Mason, R. A. Decline in symbiont densities of tropical and subtropical scleractinian corals under ocean acidification. Coral Reefs. 37 (3), 945-953 (2018).
- Prouty, N. G., et al. Vulnerability of Coral reefs to bioerosion from land-based sources of pollution. Journal of Geophysical Research: Oceans. 122 (12), 9319-9331 (2017).
- Heery, E. C., et al. Urban coral reefs: Degradation and resilience of hard coral assemblages in coastal cities of East and Southeast Asia. Marine Pollution Bulletin. 135, 654-681 (2018).
- Rosenberg, E., Koren, O., Reshef, L., Efrony, R., Zilber-Rosenberg, I. The role of microorganisms in coral health, disease and evolution. Nature Reviews: Microbiology. 5 (5), 355-362 (2007).
- Bui, V. N., et al. Diversity and biogeography of coral mucus-associated bacterial communities: The case of Acropora formosa. Journal of Marine Science and Engineering. 11 (1), 74 (2023).
- Hass, A. F., Smith, J. E., Thompson, M., Deheyn, D. D. Effects of reduced dissolved oxygen concentrations on physiology and fluorescence of hermatypic corals and benthic algae. PeerJ. 2, 235 (2014).
- Raj, K. D., et al. Low oxygen levels caused by Noctiluca scintillans bloom kills corals in Gulf of Mannar, India. Scientific Reports. 10 (1), 22133 (2020).
- Luo, Y. S., Zhao, J. L., He, C. P., Lu, Z. H., Lu, X. L. Miniaturized platform for individual coral polyps culture and monitoring. Micromachines. 11 (2), 127 (2020).
- Pang, A. P., Luo, Y. S., He, C. P., Lu, Z. H., Lu, X. L. A polyp-on-chip for coral long-term culture. Scientific Reports. 10 (1), 6964 (2020).
- Yan, L. I., et al. Effects of live rock removal of dissolved inorganic nitrogen in coral aquaria. Acta Oceanologica Sinica. 36 (12), 87-94 (2017).
