Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung eines modularen, steuerbaren Mikrogerätesystems, das für die Langzeitkultivierung und das Monitoring von Meereskorallen eingesetzt werden kann.
Abstract
Korallen sind grundlegende Organismen in Meeres- und Küstenökosystemen. Mit den Fortschritten in der Korallenschutzforschung in den letzten Jahren ist eine präzise Kontrolle der Korallenkulturumgebung für den Schutz und die Erforschung von Korallen sehr gefragt. Hier haben wir ein halbgeschlossenes Korallenkultur-Mikrogerätesystem als multifunktionale Plattform entwickelt, das eine genaue und programmierbare Temperaturregelung, eine sterile Ausgangsumgebung, eine langzeitstabile Wasserqualität, eine einstellbare Konzentration an gelöstem Sauerstoff und ein maßgeschneidertes Lichtspektrum für Korallen bieten kann. Dank des modularen Aufbaus kann das Korallenkultursystem aufgerüstet oder modifiziert werden, indem wünschenswerte neue Module installiert oder bestehende entfernt werden. Derzeit können die Probenkorallen unter geeigneten Bedingungen und bei richtiger Systemwartung mindestens 30 Tage in einem gesunden Zustand überleben. Darüber hinaus kann dieses Korallenkultursystem aufgrund der kontrollierbaren und sterilen Ausgangsumgebung die Erforschung der symbiotischen Beziehung zwischen Korallen und assoziierten Mikroorganismen unterstützen. Daher kann dieses Mikrogerätesystem eingesetzt werden, um Meereskorallen relativ quantitativ zu überwachen und zu untersuchen.
Introduction
Die Verschlechterung der Ökosysteme der Korallenriffe hat sich in den letzten 70 Jahren weltweit vollzogen. Betrachtet man alle wichtigen Korallengebiete in Mittelamerika1, Südostasien 2,3,4,5,6, Australien 7,8 und Ostafrika9, so hat sich die globale Abdeckung von Korallenriffen seit den 1950er Jahren halbiert10. Dieser massenhafte Verlust von Korallenriffen hat zu ökologischen und ökonomischen Problemen geführt. Indem sie beispielsweise das Vorhandensein/Fehlen und die Häufigkeit aller Arten von korallenabhängigen Fischen über einen Zeitraum von 8 Jahren verfolgten, kamen die Forscher zu dem Schluss, dass der Rückgang der Korallen direkt zu einem erheblichen Rückgang der Artenvielfalt und Häufigkeit von Fischen in Papua-Neuguinea geführt hat11. Dieses Ergebnis beweist, dass der Korallenrückgang nicht nur die biologischen Systeme der Korallenriffe untergraben, sondern auch die Einnahmen der Fischerei verringern kann.
In jahrzehntelangen Felduntersuchungen, einschließlich direkter Überwachung, Fernerkundung und Datenvergleich, hat die wissenschaftliche Gemeinschaft mehrere Faktoren identifiziert, die den massenhaften Rückgang der Korallen verursachen. Ein Hauptgrund für den massiven Korallenrückgang ist die Korallenbleiche, die durch hohe Meerwassertemperaturen verursachtwird 12,13. Durch die Kombination von Bleiche und meteorologischen Aufzeichnungen sind die Wissenschaftler zu dem Schluss gekommen, dass die Korallenbleiche häufiger in den Phasen El Niño-Southern Oscillation auftritt14. Ein weiterer Grund für den Korallenrückgang ist die Versauerung der Ozeane. Aufgrund der erhöhten CO2 -Konzentration sowohl in der Atmosphäre als auch im Meerwasser löst sich Kalziumkarbonat schneller als zuvor auf, was zu einer Verkalkung von Korallenriffen führt15. In der Tat wurde der Schluss gezogen, dass, wenn die CO2 -Konzentration in der Atmosphäre über 500 ppm liegt, Dutzende Millionen Menschen darunter leiden werden und die Korallenriffe von einer erheblichen Verschlechterung und Symbiodiniumablösung bedroht sind16,17. Es gibt auch andere Faktoren, die das Überleben der Korallen beeinflussen können, wie z. B. Schadstoffe an der Küste, die den Rückgang der Korallen verursachen oder beschleunigen. Forscher auf Hawaii maßen die Kohlenstoff-, Sauerstoff- und Stickstoffisotope in Korallen zusammen mit dem gelösten anorganischen Karbonat und den verwandten Nährstoffen (NH4+, PO4 3-, NO2− und NO3−) und kamen zu dem Schluss, dass die Verschmutzung durch das Land die Küstenversauerung und Bioerosion der Korallen verstärkt18. Neben der Umweltverschmutzung gefährdet die Urbanisierung auch das Überleben der Korallen und verursacht eine relativ geringe architektonische Komplexität der Korallen, wie eine Studie über den Überlebensstatus von Korallen in Singapur, Jakarta, Hongkong und Okinawa zeigt. So führen die Auswirkungen anthropogener Stressoren und die sich überlagernden Auswirkungen des Klimawandels zu einer weit verbreiteten Verringerung der biologischen Vielfalt an Korallenriffen und einem damit verbundenen Rückgang der ökologischen Funktion und Widerstandsfähigkeit der Korallen19.
Es sollte auch beachtet werden, dass eine große Anzahl von Mikroorganismen an den physiologischen Funktionen von Korallen beteiligt ist, einschließlich der Stickstofffixierung, des Chitinabbaus, der Synthese organischer Verbindungen und der Immunität20, und diese Mikroorganismen sollten daher in Betracht gezogen werden, wenn es um die Verschlechterung der Korallenriffe geht. In natürlichen Umgebungen, wie z. B. Korallenriffen, verursachen viele Faktoren hypoxische oder anoxische Bedingungen, einschließlich unzureichender Wasserzirkulation, Algenexsudat und Algenüberwucherung. Dieses Phänomen wirkt sich negativ auf die Populationsverteilung von Korallen und korallenverwandten Mikroorganismen aus. So fanden vietnamesische Wissenschaftler heraus, dass in Nha Trang, Phu Quoc und Ujung Gelam die bakterielle Zusammensetzung in der Koralle Acropora Formosa an verschiedenen Stellen durch gelösten Sauerstoff beeinflusst werden könnte21. Forscher in den Vereinigten Staaten untersuchten hypoxische oder anoxische Bedingungen in Korallen und fanden heraus, dass Algenexsudate mikrobielle Aktivität vermitteln können, was zu lokalisierten hypoxischen Bedingungen führt, die zu Korallensterben in unmittelbarer Nähe führen können. Sie fanden auch heraus, dass Korallen reduzierte Sauerstoffkonzentrationen tolerieren konnten, aber nur oberhalb eines bestimmten Schwellenwerts, der durch eine Kombination aus Expositionszeit und Sauerstoffkonzentration bestimmt wurde22. Forscher in Indien fanden heraus, dass während der Algenblüte von Noctiluca scintillans der gelöste Sauerstoff auf 2 mg/l sank. Unterhalb dieser Konzentration starben etwa 70 % von Acropora montiporacan aufgrund hypoxischer Bedingungen23.
Alle oben genannten Fakten und Faktoren deuten darauf hin, dass Umweltveränderungen zu einer Verschlechterung der Korallenriffe führen. Um Riffkorallen unter bestimmten Bedingungen zu kultivieren und zu untersuchen, ist es wichtig, eine genau und umfassend kontrollierbare mikroskopische Umgebung aufzubauen, in der Riffkorallen leben können. Normalerweise konzentrieren sich Wissenschaftler auf Temperatur, Licht, Wasserfluss und Nährstoffe. Andere Merkmale, wie die Konzentration an gelöstem Sauerstoff, die Häufigkeit von Mikroorganismen und die Vielfalt der Mikroorganismen im Meerwasser, werden jedoch häufig ignoriert. Zu diesem Zweck hat unsere Gruppe die Möglichkeit untersucht, kleine Geräte zur Kultivierung von Korallenpolypen in einer relativ kontrollierten Umgebung einzusetzen24,25. In dieser Arbeit haben wir ein modulares Mikrogerätesystem für die Korallenkultur entworfen und aufgebaut. Dieses modulare Mikrogerätesystem kann eine kontrollierbare Mikroumgebung in Bezug auf Temperatur, Lichtspektrum, Konzentration von gelöstem Sauerstoff, Nährstoffen und Mikroorganismen usw. bereitstellen und hat die Möglichkeit zur Erweiterung und Aufrüstung.
Module und Funktionen des Gerätes
Das Mikrogerätesystem wurde vom Berliner System26 inspiriert, aber im aktuellen System werden keine lebenden Steine verwendet. Wie in Abbildung 1 dargestellt, besteht das derzeitige System aus sechs Hauptmodulen, zwei bürstenlosen Motorpumpen, einer Gaspumpe, einer Durchfluss-UV-Lampe, einem Netzteil, bestimmten elektronischen Steuerungskomponenten sowie den zugehörigen Drähten und Schrauben. Zu den sechs Hauptmodulen gehören ein Meerwasserspeichermodul (mit Luftpumpe und Temperatursensor), ein Temperaturregelungsmodul, ein Algenreinigungsmodul, ein mikrobielles Reinigungsmodul, ein Aktivkohlereinigungsmodul und ein Korallenkulturmodul.
Geräte-Architektur
Wie in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt, kann das gesamte Mikrogerätesystem horizontal in zwei Kammern mit einem Temperaturregelmodul dazwischen unterteilt werden. Aus Sicherheitsgründen befinden sich alle meerwasserhaltigen Module und Teile im linken Fach, dem sogenannten Kulturfach. Die anderen elektronischen Teile befinden sich im rechten Fach, das als Elektronikfach bezeichnet wird. Beide Fächer sind versiegelt oder in Schalen verpackt. Das Temperiermodul ist in einer dazwischen liegenden Trennplatte fixiert. Die Hülle des Kulturraums besteht aus einer Fußleiste und drei Schraubplatten. Diese Konstruktion gewährleistet die Dichtheit des Fachs und erleichtert die Bedienung des Systems. Darüber hinaus begünstigt die Dichtheit eine genaue Temperaturregelung. Die Hülle des Elektronikfachs besteht aus einer Fußleiste, zwei Schraubbefestigungsplatten und einem Frontbedienfeld.
Wasserkreislauf
Eine innere und äußere Meerwasserzirkulationsschleife, die mit dem Meerwasserspeichermodul verbunden ist, wurde vorkonstruiert. Der innere Zirkulationskreislauf verbindet erfolgreich das Meerwasserspeichermodul, das Temperaturregelungsmodul, die Durchfluss-UV-Lampe, das Algenreinigungsmodul und das mikrobielle Reinigungsmodul. Dieser Kreislauf zielt darauf ab, geeignete physikalisch-chemische und physiologische Meerwasserbedingungen für die Korallen zu schaffen, und es ist keine häufige Wartung erforderlich. Das Algenreinigungsmodul enthält Chaetomorpha-Algen , die die zusätzlichen Nährstoffe (Nitrat und Phosphat) im Wasser aufnehmen. Das mikrobielle Reinigungsmodul enthält das bakterielle Kultursubstrat, das das Mikrobiom kultiviert, um Nitrit und Ammonium in Nitrat für die Wasserreinigung umzuwandeln. All diese Module müssen nur unter kritischen Umständen ausgetauscht werden.
Die äußere Zirkulationsschleife verbindet nacheinander das Meerwasserspeichermodul, das Korallenkulturmodul und das Aktivkohlemodul. Diese Zirkulationsschleife zielt darauf ab, den Korallen Licht, Dichtigkeit, Wasserströmung und eine hohe Meerwasserqualität zu bieten. Das Meerwasser kann durch einen Wassereinlass und einen Wasserauslass aufgefrischt werden. Die Zugabe von Additiven erfolgt über ein Dreiwegeventil, aus dem auch die Meerwasserprobe zur Inspektion entnommen werden kann. Luft kann durch einen Lufteinlass eingepumpt und aus einem Luftauslass abgeführt werden.
Elektronisches Design
Für das gesamte System wird ein 220-V-AC-Netzteil mit einem Schalter und einer Sicherung verwendet. Die Eingangsleistung ist in vier Zweige unterteilt. Der erste Zweig führt zu einem 12-V-DC-Netzteil, das die Heizplatte, das Kühlpanel und den Lüfter direkt mit Strom versorgt. Dieser Zweig versorgt auch indirekt zwei Pumpen und zwei Beleuchtungspaneele über einen vierkanaligen DC-Transformator. Der zweite Zweig führt zu einem PID-Temperaturregler. Der dritte Zweig geht an eine Luftpumpen-Stromversorgung. Der letzte Zweig wird an eine UV-Lampe angeschlossen. Ein Halbleiterrelais verbindet den PID-Temperaturregler und das Kühlpanel im Temperiermodul. Ein normales Relais wird verwendet, um den PID-Temperaturregler und die Heizplatte zu verbinden. Der vierkanalige DC-Transformator wandelt die Spannung in die benötigte um.
Auf der rechten Seite des Systems befinden sich zwei Bedienfelder. Auf der Oberseite befinden sich vier Schalter und ein Controller für die UV-Lampe, darunter ein Hauptschalter, ein Netzschalter für die UV-Lampe, ein Luftpumpenschalter und ein Temperaturregler. Der Hauptnetzschalter steuert die 12-V-Stromversorgung des Systems.
Auf der Vorderseite befinden sich ein PID-Temperaturregler, ein Zyklustimer, ein Vierkanal-DC-Transformator und ein Dreikanal-Timer. Der PID-Temperaturregler passt die Wassertemperatur an, indem er die Heiz- und Kühlpaneele im Temperaturregelmodul steuert. Das Temperiermodul funktioniert nur , wenn die innere Umwälzpumpe arbeitet und das Wasser am Temperiermodul vorbeifließt. Der Zyklus-Timer wird an die Stromleitung der Luftpumpe angeschlossen. Sein Zweck ist es, der Luftpumpe die Arbeitszeit zuzuweisen. Auch im Elektronikfach ist ein Drei-Kanal-Timer installiert. Dieser Timer steuert die Arbeitszeit für die Luftpumpe, das Korallenlicht und das Algenlicht.
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Protocol
Bei den für die vorliegende Studie verwendeten Korallen handelte es sich um Seriatopora caliendrum, die in unserem Labor gezüchtet werden. Alle Korallen wurden freundlicherweise vom Institut für Ozeanologie des Südchinesischen Meeres der Universität der Chinesischen Akademie der Wissenschaften zur Verfügung gestellt.
1. Inspektion und Inbetriebnahme
HINWEIS: Jedes Modul muss vor dem Zusammenbau des Systems einzeln auf Dichtheit und Funktion geprüft werden. Deionisiertes Wasser sollte verwendet werden, um die Dichtheit des Moduls zu testen. Kommerzielle Details zu allen Modulkomponenten finden Sie in der Materialtabelle.
- Dichtheitsprüfung der Verbindung zwischen den Modulen
- Schließen Sie alle Module und Pumpen an (Abbildung 1) und stellen Sie sicher, dass das Wasser mindestens 30 Minuten lang kreisförmig über das System fließt.
- Überprüfen Sie alle Nähte auf mögliche Leckagen. Wenn in einer der Klebenähte Undichtigkeiten auftreten, tragen Sie Klebkleber von außen auf. Wenn in einer der Anschlussnähte Undichtigkeiten auftreten, ziehen Sie die Verbindung wieder fest und prüfen Sie, ob die Dichtung gewechselt werden muss.
- Laden
- Nach der Dichtheitsprüfung das Wasser im Inneren evakuieren und trocknen.
- Laden Sie die entsprechenden Inhalte.
HINWEIS: Zum Beispiel wird das Bakterienkultursubstrat in das mikrobielle Reinigungsmodul und die Chaetomorpha-Algen in das Algenreinigungsmodul geladen.
- Montage und Prüfung des gesamten Systems
- Befestigen Sie die Module nach dem Laden mit den Schrauben auf der Fußleiste.
- Verbinden Sie die inneren Zirkulationsmodule mit den äußeren Zirkulationsmodulen (ohne das Korallenkulturmodul).
- Für die Meerwasserperfusion injizieren Sie das Meerwasser durch den Wassereinlass im Meerwasserspeichermodul. Wenn der Wasserstand 3 cm höher ist als die Wassereinlässe der Pumpen, schalten Sie die Pumpen ein und setzen Sie die Injektion des Meerwassers fort, bis die inneren Zirkulationsmodule mit Meerwasser gefüllt sind, mit Platz für Luft (3 cm hoch) im Meerwasserspeichermodul.
HINWEIS: Das Meerwasser wird mit reinem Wasser und Meersalz aufbereitet (siehe Materialtabelle).
- Systemtest
- Schalten Sie alle Schalter ein und stellen Sie beide Meerwasserpumpenspannungen auf 9 V ein. Stellen Sie die Wassertemperatur auf 25 °C ein.
- Stellen Sie den Zyklus-Timer auf "1 Minute an und 1 Minute aus". Stellen Sie alle drei Kanäle des Drei-Kanal-Timers auf "9:00 Uhr ein" und "17:00 Uhr aus".
- Überwachen Sie das System mindestens 24 Stunden lang auf Fehlfunktionen. Wenn kein Problem gefunden wird, ist das System bereit für den nächsten Schritt des Vorgangs.
HINWEIS: Es ist wichtig, alle Blasen in allen Modulen mit Ausnahme des Meerwasserspeichermoduls zu entfernen. Das gesamte System kann leicht angehoben und geschüttelt werden, um die Blasen vom Moduleinlass zum Auslass zu bewegen.
2. Etablierung des mikrobiellen Milieus
HINWEIS: Vor der Korallentransplantation ist es notwendig, eine korallenfreundliche mikrobielle Umgebung zu schaffen. Um Mikroorganismen im System, insbesondere im mikrobiellen Reinigungsmodul, zu kultivieren, sollte die verdünnte probiotische Lösung als mikrobielle Quelle für das Nitrifikationssystem hinzugefügt werden.
- Hinzufügen der Mikrobiomquelle
- Geben Sie 1 ml der handelsüblichen Mikrobiom-Quelllösung (siehe Materialtabelle) unter Rühren in 500 ml Meerwasser.
- Injizieren Sie 50 ml der oben genannten verdünnten Lösung und 10 μl der handelsüblichen Korallennahrungslösung (siehe Materialtabelle) in das Kreislaufsystem.
- Mikrobiom-Kultur
- Schalten Sie die innere Umwälzpumpe und eine Luftpumpe ein, um das Mikrobiom 21 Tage lang zu kultivieren. Der Sauerstoffgehalt des Mikrobioms bestimmt die Ein- und Ausschaltzeiten der Luftpumpe.
HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, das Mikrobiom für die Meerwasserreinigung zu kultivieren und das Wachstum des korallenfreundlichen Mikrobioms im System zu fördern. Dabei beginnt das Meerwasser vom zweiten bis zum vierten Tag nach der Mikrobiom-Injektion trüb zu werden. Nach diesem Mikrobiom-Kulturprozess sollte die Nährstoffabbaukapazität im System etabliert werden. Es ist zu beachten, dass zur Erfüllung unterschiedlicher experimenteller Anforderungen verschiedene Mikrobiomquellen verwendet werden können, um die Mikrobiomumgebung zu etablieren.
- Schalten Sie die innere Umwälzpumpe und eine Luftpumpe ein, um das Mikrobiom 21 Tage lang zu kultivieren. Der Sauerstoffgehalt des Mikrobioms bestimmt die Ein- und Ausschaltzeiten der Luftpumpe.
3. Korallentransplantation und -wachstum
- Korallentransplantation
- Schneiden Sie die rohen Korallenzweige mit Längenskalen von 3-5 cm ab und kleben Sie diese Korallenzweige dann auf 3D-gedruckte Korallenstützbasen (Supplementary Coding File 1).
- Legen Sie diese Korallenzweigproben für mindestens 7 Tage zurück in das ursprüngliche Meerwasserbecken, um sie zu erholen.
- Befestigen Sie die Korallenstütze mit Kleber an der Rotationseinheit. Bauen Sie das Korallenkulturmodul zusammen und schließen Sie es an den äußeren Kreislauf an.
- Abbildung des Korallenwachstums
HINWEIS: Die Korallenbilder im Laufe der Zeit müssen aufgenommen werden, um das Korallenwachstum zu bewerten. Durch die Verwendung einer demontierbaren Verbindung ist es bequem, das Korallenkulturmodul für die Bildgebung aus dem gesamten System zu entfernen. Dazu wird ein Mini-Fotostudio mit entsprechenden Lichtverhältnissen gebaut. Eine Kamera mit einem Makroobjektiv (siehe Materialtabelle) wird verwendet, um die Morphologien der Korallenoberfläche in verschiedenen Perioden zu erfassen. Die Korallenrotationseinheit im Kulturmodul kann berührungslos außerhalb des Moduls betrieben werden. Durch Drehen des magnetischen Griffs neben dem Modul können Vollwinkel-Korallenbilder aufgenommen werden.- Platzieren Sie die Kamera auf der Oberseite des Studios und nehmen Sie die Bilder aus einer vertikalen Ansicht auf.
- Platzieren Sie das Korallenkulturmodul im Mini-Fotostudio, wobei die Korallen in der Mitte und unten positioniert sind.
- Nehmen Sie die Korallenbilder auf, indem Sie den äußeren Griff drehen.
HINWEIS: Aus Gründen des Überlebens der Korallen sollte die Dauer der Bildgebung auf 15 Minuten begrenzt werden.
4. Routinemäßige Wartung des Systems
HINWEIS: Die routinemäßige Wartung umfasst die Inspektion von Leckagen, die Inspektion von Fehlfunktionen, die Zugabe von Additiven und den Austausch von Meerwasser.
- Inspektion von Leckagen
- Untersuchen Sie die Fußleiste auf Wasserflecken oder Tröpfchen. Da die Abdeckschale des Systems transparent ist, ist die visuelle Inspektion des Wasserlecks einfach und bequem. Diese Inspektion muss täglich durchgeführt werden.
- Inspektion von Fehlfunktionen
- Stellen Sie sicher, dass dieser Schritt die Überprüfung der Wassertemperatur, der Pumpen, der Lichtspannungen, des Luftpumpenstatus und des Timer-Status umfasst, einschließlich der visuellen Überprüfung und Aufzeichnung der eingestellten Wassertemperatur, der Echtzeittemperatur, der Ausgangsspannungen des Transformators, der UV-Lampeneinstellungen und des Timer-Arbeitsstatus. Diese Inspektion sollte täglich durchgeführt werden.
HINWEIS: Bestimmte Systemstörungen können anhand abnormaler Geräusche oder ungewöhnlicher Temperaturen diagnostiziert werden.
- Stellen Sie sicher, dass dieser Schritt die Überprüfung der Wassertemperatur, der Pumpen, der Lichtspannungen, des Luftpumpenstatus und des Timer-Status umfasst, einschließlich der visuellen Überprüfung und Aufzeichnung der eingestellten Wassertemperatur, der Echtzeittemperatur, der Ausgangsspannungen des Transformators, der UV-Lampeneinstellungen und des Timer-Arbeitsstatus. Diese Inspektion sollte täglich durchgeführt werden.
- Additive Zugabe
HINWEIS: Die Zugabe von Additiven ist der Prozess der Zugabe von Nährstoffen und anderen Reagenzien in das System.- Extrahieren Sie beispielsweise 10 ml des Meerwassers mit einer Spritze aus dem Dreiwegeventil zwischen dem Aktivkohlemodul und dem Meerwassermodul.
- Lösen Sie die Zusatzstoffe im extrahierten Meerwasser auf.
- Injizieren Sie die Lösung durch das Dreiwegeventil zurück in das System. In realen Fällen werden die Arten, Mengen und Zugabehäufigkeiten der Additive durch die Meerwasserqualität des Systems unter Berücksichtigung der experimentellen Anforderungen bestimmt.
- Wasseraustausch
HINWEIS: Routinemäßiger Wasseraustausch kann die toxische Konzentration und Eutrophierung im Kultursystem reduzieren. Wenn es die Versuchsbedingungen zulassen, kann der Austausch des Meerwassers ein Routinevorgang sein.- Schalten Sie die Stromversorgung für das gesamte System aus und ziehen Sie aus Sicherheitsgründen das Netzkabel ab.
- Entfernen Sie das Korallenkulturmodul.
- Verbinden Sie die äußere Abwasserleitung mit dem Auslass im Meerwasserspeichermodul.
- Drehen Sie das System, und legen Sie es mit der Vorderseite nach unten auf.
- Schalten Sie die Steckdose ein. Lassen Sie das innere Meerwasser aus dem System abfließen.
HINWEIS: Verwenden Sie keine Pumpe, um das Wasser abzusaugen, da der Unterdruck im Inneren das System beschädigen kann. - Lassen Sie eine angemessene Menge Meerwasser ab und schalten Sie den Auslass aus. Die Menge des eingeleiteten Meerwassers wird durch den physiologischen Zustand der Korallen bestimmt.
- Setzen Sie das System zurück und injizieren Sie das neu aufbereitete Meerwasser durch den Wassereinlass in das System.
- Installieren Sie das Korallenkulturmodul wieder im System.
- Schalten Sie das System ein und warten Sie, bis sich das gesamte System wieder normalisiert.
5. Austausch von Modulen
HINWEIS: Wenn ein Modul aufgrund einer Fehlfunktion oder gemäß der Versuchsanordnung ausgetauscht werden muss, ist es wichtig, das Modul zu wechseln, ohne das Kulturexperiment zu unterbrechen oder negativ zu beeinflussen.
- Schalten Sie für das Meerwasserspeichermodul, das Algenreinigungsmodul, das mikrobielle Reinigungsmodul oder das Aktivkohlereinigungsmodul die innere Umwälzpumpe aus und lösen Sie die Befestigungsschrauben für das Modul.
- Trennen Sie die Rohrleitungen zwischen den beiden verbundenen Modulen und demontieren Sie das zu ersetzende Modul aus dem System. Der letzte Schritt besteht darin, das neue Modul in das System einzubauen, indem die Rohrleitungen angeschlossen und die Befestigungsschrauben nachgezogen werden.
HINWEIS: Der Austausch des Temperiermoduls ist irgendwie anders. Zuerst müssen alle Drähte vom Modul getrennt werden. Anschließend werden die Befestigungsbolzen gelöst und die Rohrleitungen getrennt. Danach wird die Heizplatte demontiert und das Modul aus dem System demontiert. Der Installationsprozess für das Temperiermodul ist der umgekehrte Prozess.
6. Herunterfahren des Systems und Wiederherstellen des ursprünglichen Zustands des Systems
HINWEIS: Das System wird nach dem notwendigen Korallenkulturexperiment schließlich abgeschaltet. Das System muss in seinen ursprünglichen Zustand zurückversetzt werden.
- Herunterfahren des Systems
- Schalten Sie das System aus und ziehen Sie das Netzkabel ab.
- Evakuieren Sie das Meerwasser im Inneren des Systems.
- Zerlegen Sie die Module in der folgenden Reihenfolge: das Korallenkulturmodul, das Aktivkohlereinigungsmodul, das Meerwasserspeichermodul, das Algenreinigungsmodul, das mikrobielle Reinigungsmodul, die UV-Lampe, die beiden Umwälzpumpen und das Temperaturkontrollmodul.
- Wiederherstellung des Systems
- Reinigen Sie alle Module mit reinem Wasser und oberflächenaktiven Mitteln (siehe Materialtabelle).
- Sterilisieren Sie die Module mit 3%iger Wasserstoffperoxidlösung.
HINWEIS: Verwenden Sie keine organischen Lösungsmittel zum Waschen der Module. - Trocknen Sie die Module 12 h bei 40 °C. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Wasser im Inneren des Systems verdunstet ist.
- Reinigen Sie alle Rohrleitungen und Ventile mit den gleichen oberflächenaktiven Mitteln.
7. Modifikation für die kontrollierte Umgebung von Mikroorganismen
HINWEIS: Abgesehen vom Korallenkulturexperiment müssen für bestimmte spezielle Experimente, wie z. B. die Erlangung einer kontrollierten Mikroorganismenumgebung im System, die Mikrobiomarten und die Häufigkeit streng kontrolliert werden. Das innovativste Merkmal unseres Korallenkultursystems ist, dass die physiologische Aktivität der Korallen in einer bestimmten mikrobiellen Umgebung in einem relativ geschlossenen Mikroökosystem erforscht werden kann. Die Ausführung dieser Funktion erfordert ein anderes Arbeitsverfahren.
- Vorsterilisation
- Sterilisieren Sie alle Module, Rohrleitungen und Ventile mit einer 3%igen Wasserstoffperoxidlösung, bevor Sie das System zusammenbauen.
- Sterilisieren Sie das Bakterienkultursubstrat durch Autoklavieren.
- Sterilisieren Sie Chaetomorpha-Algen mit 75%iger Ethanollösung und trocknen Sie sie mit sterilem Papier.
- Systemmodifikation und Sterilisation
- Fügen Sie bei der Montage des Systems einen Luftsterilisationsfilter (siehe Materialtabelle) zwischen der Luftpumpe und dem Meerwasserspeichermodul hinzu.
- Fügen Sie einen Wassersterilisationsfilter zwischen dem Einlass und dem Dreiwegeventil hinzu. Dieser Schritt stellt sicher, dass die in das System injizierte Luft und das Wasser sterilisiert werden.
- Führen Sie Ozon in das System ein, um das verbleibende Mikrobiom zu eliminieren.
- Waschen Sie die restlichen Desinfektionsmittel dreimal mit sterilem Meerwasser ab und injizieren Sie das sterile Meerwasser in das System.
- Um nur die mikrobielle Umgebung zu etablieren, injizieren Sie die Mikrobiom-Quelllösung durch den Wasserauslass.
HINWEIS: Verwenden Sie den Wassereinlass nicht, um die Mikrobiomquelle zu injizieren. Andere Reagenzien und Meerwasser werden weiterhin durch den Wassereinlass injiziert.
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Representative Results
Genauigkeit der Temperaturregelung
Die Systemtemperatur ist in der Regel auf 23-28 °C eingestellt, abhängig von der Korallenart. Als einer der wichtigsten Faktoren können Temperaturschwankungen jedoch das Überleben der Korallen stark beeinflussen. Daher ist die Genauigkeit der Temperaturregelung ein entscheidender Faktor für das Korallenkultursystem. Mit einem Temperatursensor und einem unabhängigen Datensammler mit einem Temperaturbereich von 9 °C bis 32 °C kann die Genauigkeit der Temperaturregelung im Korallenkulturmodul getestet werden. Wir stellten die Meerwassertemperatur des Systems auf 24 °C ein und maßen gleichzeitig die Meerwasser- und Raumtemperatur. Wie in Abbildung 4 dargestellt, stellt die rote Kurve die gemessene Schwankung der Raumtemperatur dar, und die schwarze Kurve stellt die gemessene Schwankung der Meerwassertemperatur im Korallenkulturmodul dar. Über 14 h betrug die gemessene Durchschnittstemperatur 23,8 °C und die Standardabweichung 0,1 °C. Die Meerwassertemperaturregelung des Systems war relativ genau.
Ergebnis der Korallenkultur
Normalerweise strecken gesunde Korallen ihre Tentakel frei aus, wenn die Umweltbedingungen die Überlebensanforderungen der Koralle erfüllen, wie in Abbildung 5 gezeigt. Dieses Kriterium verifiziert im Allgemeinen den Zustand der Korallen und kann verwendet werden, um nach Umweltstressoren zu suchen. Wie in Abbildung 5B gezeigt, erstreckten sich die Tentakel der Probenkoralle über 1 Monat, ohne gestört zu werden. Dies deutet darauf hin, dass das System den Korallen lange Zeit eine geeignete Überlebensumgebung bot. Diese Kulturzeit sollte für die meisten Korallenexperimente und Assays im Labor lang genug sein. Aus Abbildung 5 ist auch ersichtlich, dass es praktikabel ist, die morphologische Analyse durch Abbildung des Korallenwachstumsprozesses durchzuführen.
Abbildung 1: Schaltplan-Modulanschluss für das Mikrogerätesystem. Die abgerundeten Rechtecke stellen Module oder Pumpen dar. Die Pfeillinien stellen Wasser- oder Luftleitungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Frontansicht des Mikrogerätesystems. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Draufsicht auf das Mikrogerätesystem. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Experimentelle Ergebnisse der Meerwassertemperaturregelung. Rote Kurve: Schwankung der Raumtemperatur; Schwarze Kurve: Gemessene Schwankungen der Meerwassertemperatur im System. Die Einstelltemperatur des Systems betrug 24 °C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Korallenkulturmodul mit vergrößertem Korallenbild . (A) Um einen Vergleich anzustellen, wurden vier Korallen auf den entsprechenden Stützbasen mit einer leeren im Korallenkulturmodul platziert. (B) Ein vergrößertes Korallenbild der Koralle Seriatopora caliendrum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Codierungsdatei 1: Entwurf für den 3D-Druck von Korallenstützbasen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Dieses Korallenkultursystem wurde entwickelt, um eine relativ natürliche oder maßgeschneiderte Mikroumgebung zu simulieren und bereitzustellen, in die Korallen verpflanzt werden und überleben können. In der Zwischenzeit muss dieses System als selbst entwickeltes Gerät zuverlässig, benutzerfreundlich und sicher sein. In Bezug auf die Temperaturregelung sollte beispielsweise die Meerwassertemperatur entsprechend den täglichen Umgebungsbedingungen angemessen geregelt werden. Das System wurde getestet, indem die Korallen 1 Monat lang kultiviert wurden, um die Zuverlässigkeit des Systems zu bestätigen.
Im Vergleich zu normalen Seeaquarien oder Aquarien26 beträgt die Zeitspanne für die tägliche Wartung und den Betrieb nach dem Einstellen der Kulturparameter/-bedingungen, einschließlich der Formel für das Additivmittel, des Austauschwasserplans, der Zirkulationsgeschwindigkeit (Pumpenleistung oder -spannung), der Beleuchtungsintensität, der Ein- und Ausschaltzeitverhältnisse der Luftpumpe und der Beleuchtungszeit, weniger als 10 Minuten. Darüber hinaus traten in diesem Zeitraum keine elektrischen Leckagen, Kurzschlüsse, Überlastungen oder andere Vorfälle auf, was die Benutzerfreundlichkeit und Sicherheit des Systems unterstreicht.
Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Systeminspektion, die Inbetriebnahme, die Korallentransplantation/-bildgebung und die routinemäßige Wartung die wesentlichen und kritischen Schritte im Protokoll sind. Das Austreten von Wasser im Inneren des Geräts und die Alterung der Geräteteile können zwei Probleme sein, die über einen relativ langen Zeitraum auftreten können. Zielgruppen, die dieses System replizieren möchten, müssen sich um diese Probleme kümmern.
Aus der Perspektive des künstlichen Mikroökosystems kann diese modulare Plattform mit der Fähigkeit ausgestattet werden, das korallenassoziierte Mikrobiom in einer kontrollierbaren Umgebung im Labor und nicht im Feld zu untersuchen und so seine Skalierbarkeit und Kosteneffizienz unter Beweis zu stellen. Daher wird erwartet, dass dieses Korallenkultursystem korallenbezogene Studien unterstützen und beschleunigen wird.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von den State Key Development Programs for Basic Research of China (2021YFC3100502) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12V DC power supply | Delixi Electric Co., Ltd. | CDKU-S150W | 12V12.5A |
| 3% hydrogen peroxide solution | Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd | NULL | NULL |
| 75% ethanol solution | Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd | NULL | NULL |
| Air pump | Chongyoujia Supply Chain Management Co., Ltd. | NHY-001 | NULL |
| Air sterilizing filter | Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd | S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-A | NULL |
| Camera | SONY | Α7r4-ILCE-76M4A | NULL |
| Coral nutrition solution | Red Sea Aquatics Co., Ltd. | 22101 | Coral nutrition |
| Coral pro salt (sea salt) | Red Sea Aquatics Co., Ltd. | R11231 | NULL |
| Cycle timer | Leqing Shangjin Instrument Equipment Co., Ltd. | CN102A | 220V version |
| Double closed quick connector | JOSOT Co., Ltd | NL4-2103T | NULL |
| Flow-through UV lamp | Zhongshan Xinsheng Electronic technology Co., Ltd. | 211 | NULL |
| Four-channel transformer | Dongguan Shanggushidai Electronic Technology Co., Ltd | LM2596 | NULL |
| Macro lens | SONY | FE 90mm F2.8 Macro G OSS | NULL |
| Microbiome source solution | Guangzhou BIOZYM Microbial Technology Co., Ltd. | 303 | NULL |
| Mini-photo studio | Shaoxing Shangyu Photography Equipment Factory | CM-45 | NULL |
| PID temperature controller | Guangdong Dongqi Electric Co., Ltd. | TE9-SC18W | SSR version |
| Pump (for water) | Zhongxiang Pump Co., Ltd. | ZX43D | Seaswater version |
| Pure water machine | Kemflo (Nanjing) environmental technology Co, ltd | kemflo A600 | NULL |
| Solid-state relay | Delixi Electric Co., Ltd. | DD25A | NULL |
| Surface active agents | Guangzhou Liby Group Co., Ltd. | Libai detergent | NULL |
| Three-channel timer | Leqing Changhong Intelligent Technology Co., Ltd. | CHE325-3 | 220V version |
| Water sterilizing filter | Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd | S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-L | NULL |
References
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