Summary
이 프로토콜은 바다 산호의 장기 재배 및 모니터링에 적용할 수 있는 모듈식 제어 가능한 마이크로 장치 시스템의 개발을 설명합니다.
Abstract
산호는 해양 및 해안 생태계의 기본 유기체입니다. 최근 산호 보호 연구가 고도화됨에 따라 산호 배양 환경의 정밀한 제어는 산호 보전 및 연구에 대한 요구가 높아지고 있습니다. 여기에서 우리는 정확하고 프로그래밍 가능한 온도 제어, 멸균 초기 환경, 장기적으로 안정적인 수질, 조정 가능한 용존 산소 농도 및 산호를 위한 맞춤형 광 스펙트럼을 제공할 수 있는 다기능 플랫폼으로 반폐쇄형 산호 배양 마이크로 장치 시스템을 개발했습니다. 모듈식 설계로 인해 산호 배양 시스템은 원하는 새 모듈을 설치하거나 기존 모듈을 제거하여 업그레이드하거나 수정할 수 있습니다. 현재, 적절한 조건과 적절한 시스템 유지 관리가 이루어지면, 표본 산호는 건강한 상태에서 최소 30일 동안 생존할 수 있습니다. 또한, 제어 가능하고 멸균 가능한 초기 환경으로 인해 이 산호 배양 시스템은 산호와 관련 미생물 간의 공생 관계에 대한 연구를 지원할 수 있습니다. 따라서 이 마이크로 디바이스 시스템은 비교적 정량적인 방식으로 바다 산호를 모니터링하고 조사하는 데 적용될 수 있습니다.
Introduction
산호초 생태계의 악화는 지난 70년 동안 전 세계적으로 발생해 왔습니다. 중앙아메리카1, 동남아시아2,3,4,5,6, 호주7,8, 동아프리카9 전역의 모든 주요 산호 지역을 고려하면, 전 세계 산호초의 면적은 1950년대 이후 절반으로 줄었다10. 이러한 산호초의 대량 손실은 생태학적, 경제적 문제를 초래했습니다. 예를 들어, 8년 동안 모든 종류의 산호에 의존하는 물고기의 존재/부재 및 풍부도를 추적함으로써, 연구자들은 산호 감소가 파푸아뉴기니의 물고기 생물 다양성과 풍부도의 상당한 감소를 직접적으로 초래했다고 결론지었다11. 이 결과는 산호 감소가 산호초에 기반을 둔 생물 시스템을 훼손할 뿐만 아니라 어업 소득을 감소시킬 수 있음을 입증했습니다.
직접 모니터링, 원격 탐사 및 데이터 비교를 포함한 수십 년간의 현장 조사를 통해 과학계는 대규모 산호 감소를 유발하는 몇 가지 요인을 확인했습니다. 산호가 대량으로 감소하는 주요 이유 중 하나는 높은 해수 온도로 인한 산호 백화 현상이다12,13. 과학자들은 백화 현상과 기상 기록을 결합하여 산호 백화 현상이 엘니뇨-남방 진동 단계14에서 더 자주 발생하고 있다는 결론을 내렸습니다. 산호 감소의 또 다른 이유는 해양 산성화입니다. 대기와 해수 모두에서CO2 농도가 증가하기 때문에 탄산칼슘이 이전보다 더 빨리 용해되어 순 산호초 석회화가 감소한다15. 실제로, 대기 중CO2 농도가 500ppm 이상에 도달하면 수천만 명의 사람들이 고통을 겪을 것이며 산호초는 심각한 악화 및 공생 분리의 위험에 처할 것이라고 결론지었습니다16,17. 산호 생존에 영향을 미칠 수 있는 다른 요인들도 있는데, 예를 들어 연안 오염 물질이 산호 감소를 유발하거나 가속화하는 것과 같습니다. 하와이의 연구자들은 산호의 탄소, 산소, 질소 동위원소와 용해된 무기 탄산염 및 관련 영양분(NH4+, PO4 3-, NO2−, NO3−)을 측정한 결과, 육지의 오염이 산호의 해안 산성화와 생물 침식을 확대시켰다는 결론을 내렸다18. 오염 외에도 도시화는 산호의 생존을 위협하고 싱가포르, 자카르타, 홍콩 및 오키나와의 산호 생존 상태에 대한 연구에서 밝혀진 바와 같이 산호의 건축 복잡성을 상대적으로 낮춥니다. 따라서 인위적 스트레스 요인의 영향과 기후 변화의 중첩 효과는 산호초에 대한 생물 다양성의 광범위한 감소와 산호 생태 기능 및 회복력의 감소로 이어지고 있다19.
또한 질소 고정, 키틴 분해, 유기 화합물 합성 및 면역20을 포함한 산호의 생리적 기능에 많은 수의 미생물이 참여하므로 산호초 악화를 고려할 때 이러한 미생물이 포함되어야 한다는 점에 유의해야 합니다. 산호초와 같은 자연 환경에서는 불충분한 물 순환, 조류 삼출물 및 조류 과잉 증식을 포함한 많은 요인이 저산소 또는 무산소 상태를 유발합니다. 이 현상은 산호 및 산호 관련 미생물의 개체군 분포에 부정적인 영향을 미칩니다. 예를 들어, 베트남 과학자들은 나트랑(Nha Trang), 푸꾸옥(Phu Quoc), 우중 겔람(Ujung Gelam)에서 산호 아크로포라 포모사(Acropora Formosa )의 박테리아 조성이 다른 위치에서 용존 산소에 의해 영향을 받을 수 있음을 발견했다21. 미국의 연구원들은 산호의 저산소 또는 무산소증 상태를 조사한 결과 조류 삼출물이 미생물 활동을 매개하여 국소적인 저산소 상태로 이어질 수 있으며, 이는 바로 근처에서 산호 사망을 유발할 수 있음을 발견했습니다. 그들은 또한 산호가 감소된 산소 농도를 견딜 수 있지만, 노출 시간과 산소 농도의 조합에 의해 결정된 주어진 역치 이상에서만 견딜 수 있다는 것을 발견했다22. 인도의 연구자들은 녹틸루카 신틸란스(Noctiluca scintillans ) 조류가 번성할 때 용존 산소가 2mg/L로 감소한다는 것을 발견했다. 이 농도 이하에서는 아크로포라 몬티포라칸(Acropora montiporacan )의 약 70%가 저산소 상태로 인해 사망했다23.
위에서 언급한 모든 사실과 요인은 환경 변화가 산호초의 악화로 이어진다는 것을 시사합니다. 특정 조건에서 산호초를 배양하고 연구하기 위해서는 산호초가 서식할 수 있는 제어 가능한 미세한 환경을 정확하고 포괄적으로 구축하는 것이 중요합니다. 일반적으로 과학자들은 온도, 빛, 물의 흐름 및 영양분에 초점을 맞춥니다. 그러나 해수의 용존 산소 농도, 미생물 풍부도 및 미생물 다양성과 같은 다른 특징은 일반적으로 무시됩니다. 이를 위해, 우리 그룹은 상대적으로 통제된 환경에서 산호 폴립을 배양하기 위해 소형 장비를 적용할 수 있는 가능성을 탐구했다24,25. 이 연구에서 우리는 산호 배양을 위한 모듈식 마이크로 장치 시스템을 설계하고 구축했습니다. 이 모듈식 마이크로 장치 시스템은 온도, 광 스펙트럼, 용존 산소 농도, 영양소 및 미생물 등의 측면에서 제어 가능한 미세 환경을 제공할 수 있으며 확장 및 업그레이드 능력이 있습니다.
장치의 모듈 및 기능
마이크로 장치 시스템은 베를린 시스템26에서 영감을 얻었지만 현재 시스템에서는 살아있는 암석이 사용되지 않습니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 현재 시스템은 6개의 메인 모듈, 2개의 브러시리스 모터 펌프, 1개의 가스 펌프, 1개의 플로우 스루 UV 램프, 1개의 전원 공급 장치, 특정 전자 제어 구성 요소, 관련 전선 및 나사로 구성됩니다. 6개의 주요 모듈에는 해수 저장 모듈(공기 펌프 및 온도 센서 포함), 온도 제어 모듈, 조류 정화 모듈, 미생물 정화 모듈, 활성탄 정화 모듈 및 산호 배양 모듈이 포함됩니다.
장치 아키텍처
그림 2 및 그림 3에서 볼 수 있듯이 전체 마이크로 장치 시스템은 수평으로 두 개의 구획으로 나눌 수 있으며 그 사이에 온도 제어 모듈이 있습니다. 안전상의 이유로 모든 해수 함유 모듈과 부품은 배양 구획이라는 왼쪽 구획에 배치됩니다. 다른 전자 부품은 전자 구획이라고 하는 오른쪽 구획에 배치됩니다. 두 구획 모두 밀봉되거나 쉘 안에 포장되어 있습니다. 온도 제어 모듈은 그 사이의 칸막이 플레이트에 고정되어 있습니다. 배양실의 쉘에는 베이스보드와 3개의 나사 고정 플레이트가 포함되어 있습니다. 이 설계는 구획의 견고성을 보장하고 시스템 작동을 용이하게 합니다. 또한 기밀성은 정확한 온도 제어를 선호합니다. 전자 구획의 쉘에는 베이스보드, 나사 고정 플레이트 2개 및 전면 제어 패널 1개가 포함됩니다.
물 순환
해수 저장 모듈에 연결된 내부 및 외부 해수 순환 루프가 사전 설계되었습니다. 내부 순환 루프는 해수 저장 모듈, 온도 제어 모듈, 플로우 스루 UV 램프, 조류 정화 모듈 및 미생물 정화 모듈을 성공적으로 연결합니다. 이 순환 루프는 산호에 적합한 물리화학적, 생리학적 해수 조건을 제공하는 것을 목표로 하며 빈번한 유지 관리가 필요하지 않습니다. 조류 정화 모듈에는 물의 추가 영양소(질산염 및 인산염)를 흡수하는 Chaetomorpha 조류가 포함되어 있습니다. 미생물 정화 모듈에는 미생물 배양 기질이 포함되어 있어 마이크로바이옴을 배양하여 아질산염과 암모늄을 질산염으로 전환하여 수질 정화를 수행합니다. 이러한 모든 모듈은 중요한 상황에서만 교체해야 합니다.
외부 순환 루프는 해수 저장 모듈, 산호 배양 모듈 및 활성탄 모듈을 연속적으로 연결합니다. 이 순환 루프는 산호에 빛, 기밀성, 수류 및 높은 해수 품질을 제공하는 것을 목표로 합니다. 바닷물은 물 입구와 물 배출구를 통해 상쾌하게 할 수 있습니다. 첨가제는 3방향 밸브를 통해 첨가되며 해수 샘플도 이 밸브에서 추출하여 검사할 수 있습니다. 공기는 공기 흡입구를 통해 펌핑되고 공기 배출구에서 배출될 수 있습니다.
전자 설계
스위치와 퓨즈가 있는 220V AC 전원 공급 장치는 전체 시스템에 사용됩니다. 입력 전력은 4개의 분기로 나뉩니다. 첫 번째 분기는 가열 패널, 냉각 패널 및 냉각 팬에 직접 전원을 공급하는 12V DC 전원 공급 장치로 이동합니다. 이 분기는 또한 4채널 DC 변압기를 통해 2개의 펌프와 2개의 조명 패널에 간접적으로 전력을 공급합니다. 두 번째 분기는 PID 온도 컨트롤러로 이동합니다. 세 번째 분기는 공기 펌프 전원 공급 장치로 이동합니다. 마지막 분기는 UV 램프 전원 공급 장치에 연결됩니다. 솔리드 스테이트 릴레이는 PID 온도 컨트롤러와 온도 제어 모듈의 냉각 패널을 연결합니다. 일반 릴레이는 PID 온도 컨트롤러와 가열 패널을 연결하는 데 사용됩니다. 4채널 DC 변압기는 전압을 필요한 전압으로 변환합니다.
시스템 오른쪽에는 두 개의 제어판이 있습니다. 상단 패널에는 주 전원 스위치, UV 램프 전원 스위치, 공기 펌프 스위치 및 온도 제어 스위치를 포함하여 UV 램프용 스위치 4개와 컨트롤러 1개가 있습니다. 주 전원 스위치는 시스템의 12V 전원 공급 장치를 제어합니다.
PID 온도 컨트롤러, 사이클 타이머, 4채널 DC 변압기 및 3채널 타이머가 전면 패널에 있습니다. PID 온도 컨트롤러는 온도 제어 모듈의 가열 및 냉각 패널을 제어하여 수온을 조정합니다. 온도 제어 모듈은 내부 순환 펌프가 작동 중이고 물이 온도 제어 모듈을 지나 흐를 때만 작동합니다. 사이클 타이머는 공기 펌프 전원 라인에 연결됩니다. 그 목적은 공기 펌프에 작업 시간을 할당하는 것입니다. 전자 구획에도 3채널 타이머가 배치되어 있습니다. 이 타이머는 공기 펌프, 산호 조명 및 조류 조명의 작업 시간을 제어합니다.
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Protocol
본 연구에 사용된 산호는 우리 연구실에서 배양된 Seriatopora caliendrum입니다. 모든 산호는 중국과학원 남중국해 해양학 연구소에서 친절하게 제공했습니다.
1. 검사 및 시동
알림: 시스템을 조립하기 전에 각 모듈의 기밀성 및 기능 테스트를 개별적으로 수행해야 합니다. 모듈의 기밀성을 테스트하려면 탈이온수를 사용해야 합니다. 모든 모듈 구성 요소의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나와 있습니다.
- 모듈 간 연결의 기밀성 테스트
- 모든 모듈과 펌프를 연결하고(그림 1) 물이 시스템 위로 최소 30분 동안 원형으로 흐르도록 합니다.
- 가능한 누출 문제가 있는지 모든 이음새를 확인하십시오. 접착 이음새에 누출이 발생하면 외부에서 접착 접착제를 바르십시오. 연결 이음새에 누출이 발생하면 연결을 다시 조이고 밀봉 개스킷을 교체해야 하는지 확인하십시오.
- 로드
- 기밀 테스트 후 내부의 물을 비우고 말리십시오.
- 적절한 내용을 로드합니다.
참고: 예를 들어, 박테리아 배양 기질은 미생물 정제 모듈에 로드되고 Chaetomorpha 조류는 조류 정제 모듈에 로드됩니다.
- 전체 시스템 조립 및 테스트
- 적재 후 나사를 사용하여 모듈을 베이스보드에 고정합니다.
- 내부 순환 모듈을 외부 순환 모듈과 연결합니다(산호 배양 모듈 제외).
- 해수 관류의 경우 해수 저장 모듈의 물 유입구를 통해 해수를 주입합니다. 수위가 펌프의 급수구보다 3cm 높으면 펌프를 켜고 내부 순환 모듈에 해수가 가득 차고 해수 저장 모듈에 공기(높이 3cm)가 들어갈 공간이 생길 때까지 해수 주입을 계속합니다.
알림: 바닷물은 순수한 물과 바다 소금을 사용하여 준비됩니다( 재료 표 참조).
- 시스템 테스트
- 모든 스위치를 켜고 두 해수 펌프 볼륨을 모두 설정하십시오.tages를 9V로 설정합니다. 수온을 25°C로 설정합니다.
- 사이클 타이머를 "1분 켜기 및 1분 끄기"로 설정합니다. 3채널 타이머의 3개 채널을 모두 "오전 9:00 켜기" 및 "오후 5:00 끄기"로 설정합니다.
- 오작동이 있는지 최소 24시간 동안 시스템을 모니터링하십시오. 문제가 발견되지 않으면 시스템은 작업의 다음 단계를 수행할 준비가 된 것입니다.
알림: 해수 저장 모듈을 제외한 모든 모듈의 모든 기포를 제거하는 것이 중요합니다. 전체 시스템을 약간 들어 올리고 흔들어 기포를 모듈 입구에서 출구로 이동할 수 있습니다.
2. 미생물 환경의 확립
참고: 산호 이식 전에 산호 친화적인 미생물 환경을 구축하는 것이 필요합니다. 시스템, 특히 미생물 정제 모듈에서 미생물을 배양하려면 희석된 프로바이오틱 용액을 질화 시스템의 미생물 공급원으로 추가해야 합니다.
- 마이크로바이옴 소스 추가
- 상업용 마이크로바이옴 소스 용액 1mL( 재료 표 참조)를 500mL의 해수에 넣고 교반합니다.
- 위의 희석된 용액 50mL와 상업용 산호 영양 용액 10μL( 재료 표 참조)를 순환 시스템에 주입합니다.
- 마이크로바이옴 배양
- 내부 순환 펌프와 공기 펌프를 켜서 21일 동안 마이크로바이옴을 배양합니다. 마이크로바이옴 산소 함량 요구 사항에 따라 공기 펌프의 가동 시간 및 비정기 비율이 결정됩니다.
참고: 이 단계는 해수 정화 마이크로바이옴을 배양하고 시스템에서 산호에 유익한 마이크로바이옴 성장을 촉진하는 것을 목표로 합니다. 이 과정에서 마이크로바이옴 주입 후 2일째부터 4일째까지 바닷물이 탁해지기 시작한다. 이 마이크로바이옴 배양 과정이 끝나면 시스템의 영양소 분해 능력이 확립되어야 합니다. 다양한 실험 요구 사항을 충족하기 위해 다양한 마이크로바이옴 소스를 사용하여 마이크로바이옴 환경을 구축할 수 있습니다.
- 내부 순환 펌프와 공기 펌프를 켜서 21일 동안 마이크로바이옴을 배양합니다. 마이크로바이옴 산소 함량 요구 사항에 따라 공기 펌프의 가동 시간 및 비정기 비율이 결정됩니다.
3. 산호 이식과 성장
- 산호 이식
- 3-5cm의 길이 비늘로 생 산호 가지를 자른 다음 이 산호 가지를 3D 프린팅된 산호 지지대에 부착합니다(보충 코딩 파일 1).
- 이 산호 가지 샘플을 회수를 위해 최소 7일 동안 원래 해수 탱크에 다시 넣으십시오.
- 접착제로 산호 지지대를 회전 장치에 고정합니다. 산호 배양 모듈을 조립하고 외부 순환 루프에 연결합니다.
- 산호 성장 이미지
참고: 산호 성장을 평가하기 위해 시간 경과에 따른 산호 이미지를 획득해야 합니다. 분리형 연결을 사용하면 이미징을 위해 전체 시스템에서 산호 배양 모듈을 편리하게 제거할 수 있습니다. 이를 위해 적절한 조명 조건을 갖춘 미니 사진 스튜디오가 구축됩니다. 매크로 렌즈가 장착된 카메라( 재료 표 참조)는 다양한 기간의 산호 표면 형태를 캡처하는 데 사용됩니다. 배양 모듈의 산호 회전 장치는 비접촉 모드를 사용하여 모듈 외부에서 작동할 수 있습니다. 모듈에 인접한 마그네틱 핸들을 회전시켜 전체 각도의 산호 이미지를 캡처할 수 있습니다.- 스튜디오 상단에 카메라를 놓고 수직 뷰에서 이미지를 캡처합니다.
- 산호가 중앙과 하단에 위치하도록 미니 사진 스튜디오에 산호 배양 모듈을 놓습니다.
- 바깥쪽 손잡이를 돌려 산호 이미지를 캡처합니다.
참고: 산호 생존을 위해 이미징 시간은 15분으로 제한되어야 합니다.
4. 시스템 정기 유지 보수
알림: 일상적인 유지 보수에는 누출 검사, 오작동 검사, 첨가제 추가 및 해수 교환이 포함됩니다.
- 누출 검사
- 베이스보드에 물 얼룩이나 물방울이 있는지 검사합니다. 시스템의 커버 쉘이 투명하기 때문에 누수 여부를 육안으로 쉽고 편리하게 검사할 수 있습니다. 이 검사는 매일 수행해야 합니다.
- 오작동 검사
- 이 단계에는 설정된 수온, 실시간 온도, 변압기 출력 전압, UV 램프 설정 및 타이머 작동 상태를 육안으로 확인하고 기록하는 것을 포함하여 수온, 펌프, 광 전압, 공기 펌프 상태 및 타이머 상태 검사가 포함되는지 확인하십시오. 이 검사는 매일 수행해야 합니다.
알림: 특정 시스템 오작동은 비정상적인 소리나 비정상적인 온도를 기반으로 진단할 수 있습니다.
- 이 단계에는 설정된 수온, 실시간 온도, 변압기 출력 전압, UV 램프 설정 및 타이머 작동 상태를 육안으로 확인하고 기록하는 것을 포함하여 수온, 펌프, 광 전압, 공기 펌프 상태 및 타이머 상태 검사가 포함되는지 확인하십시오. 이 검사는 매일 수행해야 합니다.
- 첨가제 첨가
알림: 첨가제 첨가는 영양소 및 기타 시약을 시스템에 추가하는 과정입니다.- 예를 들어, 활성탄 모듈과 해수 모듈 사이의 3방향 밸브에서 주사기를 사용하여 해수 10mL를 추출합니다.
- 추출된 해수에 첨가제를 녹입니다.
- 3방향 밸브를 통해 용액을 시스템에 다시 주입합니다. 실제 경우, 첨가제의 종류, 양 및 첨가 빈도는 실험 요구 사항을 고려하여 시스템 해수 수질에 의해 결정됩니다.
- 물 교환
알림: 일상적인 물 교환은 배양 시스템의 독성 농도와 부영양화를 줄일 수 있습니다. 실험 조건이 허용된다면 해수 교환은 일상적인 작업이 될 수 있습니다.- 안전상의 이유로 전체 시스템의 전원을 끄고 전원 케이블을 뽑습니다.
- 산호 배양 모듈을 제거합니다.
- 외부 폐수 파이프 라인을 해수 저장 모듈의 배출구에 연결합니다.
- 시스템을 회전하고 시스템 앞면이 아래를 향하도록 놓습니다.
- 콘센트를 켭니다. 내부 해수가 시스템 밖으로 흘러 나오도록하십시오.
알림: 내부 음압으로 인해 시스템이 손상될 수 있으므로 펌프를 사용하여 물을 빼내지 마십시오. - 적당량의 바닷물을 배출하고 배출구를 끕니다. 방류되는 바닷물의 양은 산호의 생리적 상태에 따라 결정됩니다.
- 시스템을 재설정하고 새로 준비한 해수를 급수구를 통해 시스템에 주입합니다.
- 산호 배양 모듈을 시스템에 다시 설치합니다.
- 시스템 전원을 켜고 전체 시스템이 정상으로 돌아올 때까지 기다립니다.
5. 모듈 교체
알림: 오작동으로 인해 또는 실험 배열에 따라 모듈을 교체해야 하는 경우 배양 실험을 중단하거나 부정적인 영향을 미치지 않고 모듈을 교체하는 것이 중요합니다.
- 해수 저장 모듈, 조류 정화 모듈, 미생물 정화 모듈 또는 활성탄 정화 모듈의 경우 내부 순환 펌프의 전원을 끄고 모듈의 고정 나사를 풉니다.
- 연결된 두 모듈 사이의 파이프라인을 분리하고 시스템에서 교체할 모듈을 분해합니다. 마지막 단계는 파이프라인을 연결하고 고정 나사를 다시 조여 새 모듈을 시스템에 조립하는 것입니다.
알림: 온도 제어 모듈의 교체는 다소 다릅니다. 먼저 모듈에서 모든 전선을 분리해야 합니다. 그런 다음 고정 볼트를 풀고 파이프 라인을 분리합니다. 그 후, 가열 패널이 분리되고 모듈이 시스템에서 분해됩니다. 온도 제어 모듈의 설치 프로세스는 반대 프로세스입니다.
6. 시스템 종료 및 시스템 초기 상태 복원
참고: 시스템은 필요한 산호 배양 실험 후에 결국 종료됩니다. 시스템을 원래 상태로 복원해야 합니다.
- 시스템 종료
- 시스템 전원을 끄고 전원 케이블을 뽑습니다.
- 시스템 내부의 바닷물을 비우십시오.
- 산호 배양 모듈, 활성탄 정화 모듈, 해수 저장 모듈, 조류 정화 모듈, 미생물 정화 모듈, UV 램프, 두 개의 순환 펌프 및 온도 제어 모듈의 순서로 모듈을 분해합니다.
- 시스템 복원
- 순수한 물과 계면 활성제로 모든 모듈을 청소하십시오( 재료 표 참조).
- 3% 과산화수소 용액으로 모듈을 멸균합니다.
알림: 모듈을 세척할 때 유기 용제를 사용하지 마십시오. - 모듈을 40°C에서 12시간 동안 건조시킵니다. 시스템 내부의 모든 물이 증발했는지 확인하십시오.
- 동일한 표면 활성제를 사용하여 모든 파이프라인과 밸브를 청소하십시오.
7. 통제된 미생물 환경에 대한 수정
참고: 산호 배양 실험을 제외하고, 시스템에서 통제된 미생물 환경을 획득하는 것과 같은 특정 특수 실험의 경우 마이크로바이옴 종과 풍부도를 엄격하게 제어해야 합니다. 산호 배양 시스템의 가장 혁신적인 특징은 상대적으로 폐쇄된 미세 생태계의 특정 미생물 환경에서 산호의 생리적 활동을 탐구할 수 있다는 것입니다. 이 기능을 수행하려면 다른 작동 절차가 필요합니다.
- 사전 멸균
- 시스템을 조립하기 전에 3% 과산화수소 용액을 사용하여 모든 모듈, 파이프라인 및 밸브를 멸균하십시오.
- 오토클레이브를 통해 박테리아 배양 기질을 멸균합니다.
- Chaetomorpha 조류를 75 % 에탄올 용액으로 살균하고 멸균 종이를 사용하여 건조시킵니다.
- 시스템 개조 및 멸균
- 시스템을 조립할 때 공기 펌프와 해수 저장 모듈 사이에 공기 살균 필터( 재료 표 참조)를 추가하십시오.
- 입구와 3방향 밸브 사이에 물 살균 필터를 추가합니다. 이 단계는 시스템에 주입된 공기와 물이 살균되도록 합니다.
- 시스템에 오존을 도입하여 남아 있는 마이크로바이옴을 제거합니다.
- 남은 소독제를 멸균 해수로 세 번 씻어내고 멸균 해수를 시스템에 주입합니다.
- 미생물 환경 구축만을 위해 물 배출구를 통해 마이크로바이옴 소스 용액을 주입합니다.
알림: 마이크로바이옴 소스를 주입하기 위해 물 유입구를 사용하지 마십시오 . 다른 시약과 해수는 여전히 물 유입구를 통해 주입됩니다.
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Representative Results
온도 제어 정확도
시스템 온도는 일반적으로 산호 종에 따라 23-28 °C로 설정됩니다. 그러나 가장 중요한 요인 중 하나인 온도 변화는 산호 생존에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 온도 제어 정확도는 산호 배양 시스템에 결정적인 요소입니다. 9 °C에서 32 °C의 온도 범위를 가진 온도 센서와 독립적인 데이터 수집기를 사용하여 산호 배양 모듈의 온도 제어 정확도를 테스트할 수 있습니다. 시스템 해수 온도를 24°C로 설정하고 해수와 실내 온도를 동시에 측정했습니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 빨간색 곡선은 측정된 실내 온도 변동을 나타내고 검은색 곡선은 산호 배양 모듈에서 측정된 해수 온도 변동을 나타냅니다. 14시간 동안 측정된 평균 온도는 23.8°C이고 표준 편차는 0.1°C였습니다. 시스템 해수 온도 제어는 비교적 정확했습니다.
산호 양식 결과
일반적으로 건강한 산호는 그림 5에서 볼 수 있듯이 환경 조건이 산호의 생존 요구 사항을 충족할 때 촉수를 자유롭게 뻗습니다. 이 기준은 일반적으로 산호의 상태를 확인하며 환경 스트레스 요인을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 5B에서 볼 수 있듯이, 표본 산호의 촉수는 방해받지 않고 1개월 이상 뻗어 있었다. 이것은 시스템이 오랫동안 산호에게 적합한 생존 환경을 제공했음을 나타냅니다. 이 배양 기간은 실험실에서 대부분의 산호 실험과 분석에 충분히 길어야 합니다. 또한 그림 5 에서 산호 성장 과정을 이미징하여 형태학적 분석을 수행하는 것이 실용적임을 알 수 있습니다.
그림 1: 마이크로 장치 시스템의 회로도 모듈 연결. 둥근 사각형은 모듈 또는 펌프를 나타냅니다. 화살표 선은 물 또는 공기 파이프라인을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마이크로 장치 시스템의 앞면 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 마이크로 장치 시스템의 상판 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 해수 온도 제어 실험 결과. 빨간색 곡선: 실내 온도 변동; 검은색 곡선: 측정된 시스템 해수 온도 변동. 시스템 설정 온도는 24°C였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 확대된 산호 이미지가 있는 산호 배양 모듈. (A) 비교를 위해, 4개의 산호가 해당 지지 기반에 위치했고 산호 배양 모듈에는 빈 산호가 있었습니다. (B) 산호 Seriatopora caliendrum의 확대된 산호 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 1: 산호 지지대의 3D 프린팅을 위한 설계. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 산호 배양 시스템은 산호가 이식되고 생존할 수 있도록 비교적 자연적이거나 맞춤화된 미세환경을 시뮬레이션하고 제공하도록 설계되었습니다. 한편, 자체 개발 장비로서 이 시스템은 신뢰할 수 있고 사용자 친화적이며 안전해야 합니다. 예를 들어, 온도 제어 측면에서 해수 온도는 일상적인 환경 상황에 따라 적절하게 제어되어야 합니다. 이 시스템은 1개월 동안 산호를 배양하여 테스트하여 시스템의 신뢰성을 확인했습니다.
일반 수조 또는 수족관26과 비교하여 산호 배양 실험에 따라 첨가제 공식, 교환수 계획, 순환 속도(펌프 전력 또는 전압), 조명 강도, 공기 펌프 켜기 및 끄기 시간 비율 및 조명 시간을 포함한 배양 매개변수/조건을 설정한 후 일일 서비스 및 작동 시간은 10분 미만입니다. 또한 이 기간 동안 누전, 단락, 과부하 또는 기타 사고가 발생하지 않아 시스템의 사용자 친화성과 안전성을 입증했습니다.
그러나 시스템 검사, 시동, 산호 이식/이미징 및 일상적인 유지 관리는 프로토콜에서 필수적이고 중요한 단계라는 점에 유의해야 합니다. 장치 내부의 누수와 장치 부품의 노화는 비교적 오랜 기간 동안 발생할 수 있는 두 가지 문제가 될 수 있습니다. 이 시스템을 복제하려는 대상은 이러한 문제를 처리해야 합니다.
인공 마이크로 생태계의 관점에서 볼 때, 이 모듈식 플랫폼은 현장이 아닌 실험실의 제어 가능한 환경에서 산호 관련 마이크로바이옴을 연구할 수 있는 기능을 부여하여 확장성과 비용 효율성을 입증할 수 있습니다. 따라서 이 산호 양식 시스템은 산호 관련 연구를 돕고 가속화할 것으로 예상됩니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 기초 연구를 위한 국가 핵심 개발 프로그램(2021YFC3100502)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12V DC power supply | Delixi Electric Co., Ltd. | CDKU-S150W | 12V12.5A |
| 3% hydrogen peroxide solution | Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd | NULL | NULL |
| 75% ethanol solution | Shandong ANNJET High tech Disinfection Technology Co., Ltd | NULL | NULL |
| Air pump | Chongyoujia Supply Chain Management Co., Ltd. | NHY-001 | NULL |
| Air sterilizing filter | Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd | S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-A | NULL |
| Camera | SONY | Α7r4-ILCE-76M4A | NULL |
| Coral nutrition solution | Red Sea Aquatics Co., Ltd. | 22101 | Coral nutrition |
| Coral pro salt (sea salt) | Red Sea Aquatics Co., Ltd. | R11231 | NULL |
| Cycle timer | Leqing Shangjin Instrument Equipment Co., Ltd. | CN102A | 220V version |
| Double closed quick connector | JOSOT Co., Ltd | NL4-2103T | NULL |
| Flow-through UV lamp | Zhongshan Xinsheng Electronic technology Co., Ltd. | 211 | NULL |
| Four-channel transformer | Dongguan Shanggushidai Electronic Technology Co., Ltd | LM2596 | NULL |
| Macro lens | SONY | FE 90mm F2.8 Macro G OSS | NULL |
| Microbiome source solution | Guangzhou BIOZYM Microbial Technology Co., Ltd. | 303 | NULL |
| Mini-photo studio | Shaoxing Shangyu Photography Equipment Factory | CM-45 | NULL |
| PID temperature controller | Guangdong Dongqi Electric Co., Ltd. | TE9-SC18W | SSR version |
| Pump (for water) | Zhongxiang Pump Co., Ltd. | ZX43D | Seaswater version |
| Pure water machine | Kemflo (Nanjing) environmental technology Co, ltd | kemflo A600 | NULL |
| Solid-state relay | Delixi Electric Co., Ltd. | DD25A | NULL |
| Surface active agents | Guangzhou Liby Group Co., Ltd. | Libai detergent | NULL |
| Three-channel timer | Leqing Changhong Intelligent Technology Co., Ltd. | CHE325-3 | 220V version |
| Water sterilizing filter | Beijing Capsid Filter Equipment Co., Ltd | S593CSFTR-0.2H83SH83SN8-L | NULL |
References
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