Summary
यहां, हम मिश्रित पौधों का उत्पादन करने के लिए एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसिएन्स द्वारा मध्यस्थता की गई एक-चरण यी परिवर्तन विधि का विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
Abstract
एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेनेस-मध्यस्थता वाले बालों वाली जड़ परिवर्तन का उपयोग करके ट्रांसजेनिक जड़ों और गैर-ट्रांसजेनिक तनों और कलियों के साथ मिश्रित पौधों का उत्पादन करना जड़ से संबंधित जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। बालों की जड़ परिवर्तन डिकोटाइलडोन की एक विस्तृत श्रृंखला में और कई मोनोकोटाइलडॉन प्रजातियों में स्थापित किया गया है और यह जीनोटाइप से लगभग स्वतंत्र है। मिश्रित पौधों को प्राप्त करने के लिए ए राइजोजेन्स के साथ हाइपोकोटिल इंजेक्शन की पारंपरिक विधि अक्षम, समय लेने वाली, श्रमसाध्य है, और अक्सर निविदा और छोटे हाइपोकोटिल पौधों की मृत्यु का कारण बनती है। राइजोजेनेस द्वारा मध्यस्थता में एक अत्यधिक कुशल, एक-चरण यी बालों वाली जड़ परिवर्तन पहले स्थापित किया गया था, जो बालों की जड़ों के उत्पादन के बाद प्रत्यारोपण की आवश्यकता को समाप्त करता है। इस अध्ययन में, एक आंशिक हाइपोकोटिल और प्राथमिक जड़ को हटा दिया गया था, हाइपोकोटिल चीरा साइट को ए राइजोजेन्स के साथ लेपित किया गया था, और फिर हाइपोकोटिल को बाँझ वर्मीक्यूलाइट में लगाया गया था। 12 दिनों की खेती के बाद, हाइपोकोटिल चीरा का विस्तार हुआ और नई बालों वाली जड़ें प्रेरित हुईं। यह लेख ए राइजोजेनेस द्वारा मध्यस्थता में एक-चरण परिवर्तन विधि का विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, जिसमें जंगली सोयाबीन, सोलनम अमेरिकनम और कद्दू के मिश्रित पौधों का उत्पादन करके इसकी प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया जाता है।
Introduction
एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेनेस राइजोबियासी परिवार से एक ग्राम-नकारात्मक मिट्टी जीवाणु है। राइजोजीन घावों के माध्यम से लगभग सभी डिकोटाइलडोन, कुछ मोनोकोटाइलडोन और व्यक्तिगत जिम्नोस्पर्म को संक्रमित कर सकते हैं, जिससे संक्रमित पौधों में बालों की जड़ें पैदा होती हैं। जीवाणु में री (जड़-उत्प्रेरण) प्लास्मिड होता है, और री प्लास्मिड का टी-डीएनए ओपिन संश्लेषण जीन और रोल जीन (रूट लोकस जीन) को वहन करता है। री प्लास्मिड का टी-डीएनए एक पौधे की कोशिका में प्रवेश करने और एक मेजबान गुणसूत्र में एकीकृत होने के बाद, रोल जीन की अभिव्यक्ति बालोंवाली जड़ों के उत्पादन को प्रेरित करती है। एक लक्ष्य जीन को ले जाने वाले एक पौधे बाइनरी अभिव्यक्ति वेक्टर को ए राइजोजीन में बदल दिया जाता है, और रूपांतरित ए राइजोजीन का उपयोग पौधे को संक्रमित करने के लिए किया जाता है। ट्रांसजेनिक जड़ों को संक्रमित पौधों में प्रेरित किया जा सकता है, जिससे ट्रांसजेनिक जड़ों और गैर-ट्रांसजेनिक तनों और कलियों वाले मिश्रित पौधों का उत्पादन होता है। आम तौर पर, एक समग्र संयंत्र 14-20 दिनों के भीतर प्राप्त किया जा सकता है। राइजोजेनेस-मध्यस्थता वाले बालों की जड़ परिवर्तन आम तौर पर डाइकोटाइलडोनसपौधों में जीनोटाइप द्वारा सीमित नहीं है2. राइजोजेनेस-संक्रमित पौधों द्वारा उत्पादित बालों वाली जड़ों को तेज विकास दर, स्थिर विरासत और आसान संचालन की विशेषता है। राइजोजेनेस द्वारा मध्यस्थ बालों की जड़ परिवर्तन वर्तमान में जड़ से संबंधित जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, बालों की जड़ों के परिवर्तन का उपयोग CRISPR / Cas9 सिस्टम 3,4,5 और प्रोटीन उपकोशिकीय स्थानीयकरण की लक्ष्य-संपादन दक्षता को मान्य और अनुकूलित करने के लिए भी किया जा सकता है। इसलिए, बालों वाली जड़ परिवर्तन पौधे जीन फ़ंक्शन, चयापचय इंजीनियरिंग, और जड़ों और राइजोस्फीयर सूक्ष्मजीवों के बीच बातचीत 6,7,8 पर शोध में एक महत्वपूर्ण उपकरण है।
बालों की जड़ परिवर्तन के माध्यम से प्राप्त ट्रांसजेनिक जड़ों वाले मिश्रित पौधों का व्यापक रूप से डाइकोटाइलडोनस पौधों में उत्पादन किया गया है, खासकर फलियों में। राइजोजेनेस के साथ हाइपोकोटिल को इंजेक्ट करने की पारंपरिक विधि का उपयोग मिश्रित लोटस कॉर्निकुलटस9, सोयाबीन10, टमाटर 11, शकरकंद12, और कईअन्य पौधों 5,8 का उत्पादन करने के लिए किया गया है। हाइपोकोटिल-इंजेक्शन विधि अक्षम है और युवा या छोटे हाइपोकोटिल पौधों की मृत्यु का कारण बनने की संभावना है। इसलिए, भ्रूण की जड़ों को काटकर, ए राइजोजीन के साथ अंकुर चीरा को कोटिंग करके, और फिर जड़ से खेती के लिए बाँझ संस्कृति माध्यम पर हाइपोकोटिल को रखकर विधि में सुधार किया गया था। हालांकि, उन चरणों को बाँझ वातावरण में किया जाता है, और ऑपरेशन चरण अपेक्षाकृत बोझिल होते हैं। विशेष रूप से, परिणामी मिश्रित पौधों को प्रत्यारोपित करने की आवश्यकता होती है, जिससे काम की मात्रा बढ़ जाती है। पिछले काम में, ककड़ी, सोयाबीन, लोटस जैपोनिकस, मेडिकागो ट्रंकाटुला और टमाटर 2,14,15,16,17 में एक-चरण ए राइजोजेनेस-मध्यस्थता (एआरएम) बालों की जड़ परिवर्तन स्थापित किया गया था। प्राथमिक जड़ और आंशिक हाइपोकोटिल को हटा दिया गया था, शेष हाइपोकोटिल के चीरा स्थल को रूपांतरित ए राइजोजीन के साथ लेपित किया गया था, और अंकुर को तब नम बाँझ वर्मीक्यूलाइट में लगाया गया था। 12 दिनों की खेती के बाद, चीरा स्थल पर बालों वाली जड़ें पैदा हुईं। एक-चरण एआरएम विधि अत्यधिक कुशल है और बालों की जड़ों का उत्पादन करने के लिए कम समय की आवश्यकता होती है। बालों वाली जड़ें बनाने के बाद रोपाई भी आवश्यक नहीं है। क्योंकि प्रत्यारोपण के बिना माइक्रोबियल संदूषण से बचा जा सकता है, पौधों और सूक्ष्मजीवों के बीच बातचीत का अध्ययन करते समय एक-चरण एआरएम विधि विशेष रूप से उपयोगी हो सकती है, जैसे कि फलीदार पौधों और राइजोबिया के बीच सहजीवी नाइट्रोजन निर्धारण, और पौधों और आर्बसकुलर माइकोराइजाल कवक के बीच सहजीवन। इस पेपर में, जंगली सोयाबीन, सोलनम अमेरिकनम और कद्दू में उत्पादित मिश्रित पौधों के उदाहरणों के साथ एक विस्तृत एक-चरण ए राइजोजेनेस-मध्यस्थता बालों वाली जड़ परिवर्तन प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। प्रोटोकॉल के साथ, शोधकर्ता आसानी से एक-चरण एआरएम परिवर्तन कर सकते हैं।
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Protocol
1. पौधे की वृद्धि की स्थिति और ए राइजोजेनेस संस्कृति।
- बीज की बुवाई
नोट: जंगली सोयाबीन के बीज यांगगु काउंटी, लियाओचेंग, चीन में एकत्र किए गए थे; एस. अमेरिकनम और कद्दू की स्थानीय किस्म यिनसू के बीज एक बाजार से खरीदे गए थे।- जंगली सोयाबीन, एस अमेरिकनम, और कद्दू की स्थानीय किस्म के बीज इकट्ठा करें, उन्हें 1 सेमी की गहराई पर वर्मीक्यूलाइट में बोएं, और उन्हें अच्छी तरह से पानी दें। 8 सेमी x 11 सेमी x 9 सेमी प्लास्टिक के बक्से में 20 बीज लगाएं। पौधों को लगभग 70% सापेक्ष आर्द्रता पर 16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे के अंधेरे चक्र के साथ 24 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर एक विकास कक्ष में खेती करें।
नोट: जंगली सोयाबीन के बीज के कोट को बुवाई से पहले तोड़ा जाना चाहिए। यदि शोध प्रश्न पौधों और सूक्ष्मजीवों के बीच बातचीत पर केंद्रित है, तो बीज, वर्मीक्यूलाइट, प्लास्टिक के बक्से, और पानी को उपयोग से पहले निष्फल किया जाना चाहिए। - राइजोजेनेस K599 की सक्रियता और संस्कृति।
रिजोजेनेस K599 स्ट्रेन में एक द्विआधारी वेक्टर pRed13052 था जिसमें एक लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन DSRed2 था।- राइजोजेनेस स्ट्रेन K599 को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से हटा दें, और ठोस एलबी माध्यम (50 मिलीग्राम / एल कनामाइसिन और 50 मिलीग्राम / एल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ) पर बैक्टीरिया को 48 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर सक्रिय करें।
- स्ट्रेन K599 का एक क्लोन चुनें और इसे 12 घंटे के लिए तरल एंटीबायोटिक युक्त एलबी माध्यम के 1 मिलीलीटर में कल्चर करें।
- ठोस एंटीबायोटिक युक्त एलबी माध्यम पर बैक्टीरिया निलंबन के 500 μL को समान रूप से फैलाएं, इसके बाद 24 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन करें।
- जंगली सोयाबीन, एस अमेरिकनम, और कद्दू की स्थानीय किस्म के बीज इकट्ठा करें, उन्हें 1 सेमी की गहराई पर वर्मीक्यूलाइट में बोएं, और उन्हें अच्छी तरह से पानी दें। 8 सेमी x 11 सेमी x 9 सेमी प्लास्टिक के बक्से में 20 बीज लगाएं। पौधों को लगभग 70% सापेक्ष आर्द्रता पर 16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे के अंधेरे चक्र के साथ 24 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर एक विकास कक्ष में खेती करें।
राइजोजेनेस-मध्यस्थता बालों वाली जड़ परिवर्तन विधि।
- हाइपोकोटाइल चीरा
- 7 दिनों के बाद (बीज की बुवाई को दिन 0 के रूप में परिभाषित करें), अंकुर कोटिलेडोन अभी सामने आए हैं (चित्रा 1 ए), हाइपोकोटिल के लगभग 0.5-1 सेमी को काटने के लिए एक निष्फल, तेज स्केलपेल का उपयोग करें (चित्रा 1 बी)। प्राथमिक जड़ और कुछ आंशिक हाइपोकोटिल को छोड़ दें।
नोट: देखभाल के साथ स्केलपेल का उपयोग करें।
- 7 दिनों के बाद (बीज की बुवाई को दिन 0 के रूप में परिभाषित करें), अंकुर कोटिलेडोन अभी सामने आए हैं (चित्रा 1 ए), हाइपोकोटिल के लगभग 0.5-1 सेमी को काटने के लिए एक निष्फल, तेज स्केलपेल का उपयोग करें (चित्रा 1 बी)। प्राथमिक जड़ और कुछ आंशिक हाइपोकोटिल को छोड़ दें।
- K599 टीकाकरण
- के 599 बैक्टीरिया (चित्रा 1 सी) के साथ हाइपोकोटाइल चीरा को कोट करें।
- रोपाई को नम वर्मीक्यूलाइट में लगाएं (चित्रा 1 डी)।
- राइजोजेनेस-मध्यस्थता बालों वाली जड़ परिवर्तन के माध्यम से प्रत्येक प्रजाति के 30 पौधों को संक्रमित करें। प्रत्येक पौधे को 5 मिलीलीटर पुन: निलंबित K599 बैक्टीरियल सस्पेंशन (OD600 = 0.5-0.6) के साथ एक चौथाई ताकत (0.25x) Gamborg B-5 मूल माध्यम (चित्रा 1E) में पानी दें।
- बर्तनों को एक अत्यधिक पारदर्शी प्लास्टिक बैग (चित्रा 1 एफ) के साथ कवर करें और उन्हें एक विकास कक्ष में रखें।
3. बालों वाली जड़ उत्पादन
- टीकाकरण के बाद ~ 12 दिनों के लिए पौधों को विकसित करें, नई बालों वाली जड़ें चीरा स्थल पर प्रेरित और उत्पन्न होंगी। 15 दिनों के बाद, बालों वाली जड़ की लंबाई आमतौर पर 2-5 सेमी तक पहुंच जाती है (चित्रा 2)।
- यह निर्धारित करने के लिए कि क्या उत्पादित बालों वाली जड़ें ट्रांसजेनिक हैं, K599 में रूपांतरित वेक्टर पर निर्भर रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति की जांच करें।
- 540 एनएम पर हरे रंग की उत्तेजना प्रकाश और 600 एनएम (चित्रा 2 बी, चित्रा 2 डी, और चित्रा 2 एफ) पर उत्सर्जन के साथ एक केमिलुमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके रिपोर्टर जीन डीएसरेड 2 की अभिव्यक्ति का पता लगाएं।
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Representative Results
राइजोजेनेस-मध्यस्थता बालों वाली जड़ परिवर्तन के अत्यधिक कुशल एक-चरण ए।
इंजीनियर K599 के साथ टीकाकरण के 12 दिन बाद हाइपोकोटिल चीरा साइट पर बालों की जड़ों का उत्पादन किया गया था। बाइनरी वेक्टर में निहित रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के आधार पर ट्रांसजेनिक बालों वाली जड़ें निर्धारित की गईं। मिश्रित जंगली सोयाबीन, एस अमेरिकनम और कद्दू के रिपोर्टर जीन डीएसरेड 2 के साथ रूपांतरित ट्रांसजेनिक जड़ों को प्राकृतिक (चित्रा 2 ए, चित्रा 2 सी, और चित्रा 2 ई) और हरी उत्तेजना प्रकाश (चित्रा 2 बी, चित्रा 2 डी, और चित्रा 2 एफ) के तहत देखा गया था।
जब एक मिश्रित पौधे में कम से कम एक ट्रांसजेनिक जड़ होती है, तो इसे ट्रांसजेनिक मिश्रित पौधा नामित किया जाता है। तीन प्रजातियों में से प्रत्येक के 30 टीकाकृत पौधों में से, 28 जंगली सोयाबीन, 18 एस अमेरिकनम और 30 कद्दू के पौधे ट्रांसजेनिक कंपोजिट थे। इस प्रकार, बालों की जड़ परिवर्तन दक्षता 93.3% (सोयाबीन), 60% (एस अमेरिकनम), और 100% (कद्दू) थी। तीन प्रकार के पौधों की तुलना से संकेत मिलता है कि मोटे हाइपोकोटिल वाले पौधे पतले हाइपोकोटिल वाले लोगों की तुलना में अधिक ट्रांसजेनिक बालों वाली जड़ों का उत्पादन करते हैं।
चित्र 1: एक-चरण ए राइजोजेनेस-मध्यस्थता बालों वाली जड़ परिवर्तन। (ए) सात दिन पुराने कद्दू के पौधे। (बी) के 599 जीवाणु समाधान में हाइपोकोटिल का एपिकल हिस्सा काटा गया। (सी) के 599 बैक्टीरियल मास कोटिंग हाइपोकोटिल चीरा। (डी) गीले, बाँझ वर्मीक्यूलाइट में लगाया गया खोज। (ई) क्वार्टर स्ट्रेंथ (0.25 एक्स) गैम्बोर्ग बी -5 मूल माध्यम में 5 मिलीलीटर पुन: निलंबित के 599 जीवाणु समाधान के साथ पानी देना। (एफ) अत्यधिक पारदर्शी प्लास्टिक बैग कवरिंग। स्केल बार = 1 सेमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एक-चरण ए राइजोजीन-मध्यस्थता बालों वाली जड़ परिवर्तन से प्राप्त मिश्रित पौधे। (ए, बी) जंगली सोयाबीन, (सी, डी) सोलनम अमेरिकनम, और (ई, एफ) कद्दू के मिश्रित पौधों की जड़ें (ए, सी, ई) प्राकृतिक और (बी, डी, एफ) हरी उत्तेजना प्रकाश के तहत। सफेद तीर ट्रांसजेनिक बालों वाली जड़ों का संकेत देते हैं; काले तीर गैर-ट्रांसजेनिक बालों वाली जड़ों का संकेत देते हैं। स्केल बार = 1 सेमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
राइजोजेनेस-मध्यस्थता वाली बालों वाली जड़ विधि हाइपोकोटिल-इंजेक्शन विधि की तुलना में मिश्रित पौधों के उत्पादन के लिए एक सरल और अधिक कुशल विधि है। एक-चरण एआरएम विधि बालों की जड़ परिवर्तन की दक्षता में काफी सुधार करती है, बालों की जड़ों का उत्पादन करने के लिए समय को कम करती है, बालों वाली जड़ों की संख्या बढ़ाती है, और इसमें शामिल काम की मात्रा को कम करती है। बेहतर परिवर्तन प्रोटोकॉल फलीदार पौधों और राइजोबिया के बीच और पौधों और आर्बसकुलर माइकोराइजल कवक के बीच सहजीवन पर अध्ययन के लिए इष्टतम है। इसे इस तथ्य के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि बालों वाली जड़ों के उत्पादन के बाद मिश्रित पौधों के प्रत्यारोपण की आवश्यकता नहीं होती है, जो रोपाई के दौरान होने वाले गैर-टीकाकृत उपभेदों के साथ संदूषण से बचता है। इसके अलावा, एक पौधे की प्रजाति (कद्दू) में परिवर्तन दक्षता 100% थी।
निम्नलिखित कारण बता सकते हैं कि बालों की जड़ परिवर्तन में हाइपोकोटिल-इंजेक्शन विधि की तुलना में एक-चरण एआरएम विधि अधिक कुशल क्यों थी। सबसे पहले, हालांकि प्राथमिक जड़ को हटा दिया गया था, अंकुर वाष्पोत्सर्जन को बनाए रखा गया था। इस प्रकार, वाष्पोत्सर्जन खिंचाव ने चीरे में हाइपोकोटिल कोशिकाओं के ए राइजोजीन आक्रमण की सुविधा प्रदान की। दूसरा, हाइपोकोटिल चीरा के कारण घाव क्षेत्र हाइपोकोटिल-इंजेक्शन विधि के कारण होने वाले घाव क्षेत्र से बड़ा था, और इसलिए, अधिक पौधे कोशिकाएं ए राइजोजीन से संक्रमित थीं। अंत में, प्राथमिक जड़ को हटाने के बाद, हाइपोकोटिल चीरा को अंधेरे और नम वर्मीक्यूलाइट में दफन कर दिया गया था, जो एक अनुकूल वातावरण है जिसमें जड़ें18 का उत्पादन होता है।
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Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को लियाओचेंग विश्वविद्यालय (318012028) के अनुसंधान कोष और शेडोंग प्रांत (ZR2020MC034) के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
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