एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेनेस-आधारित बालों की जड़ परिवर्तन द्वारा मिश्रित पौधों के उत्पादन के लिए एक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि
Summary
यहां, हम मिश्रित पौधों का उत्पादन करने के लिए एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसिएन्स द्वारा मध्यस्थता की गई एक-चरण यी परिवर्तन विधि का विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
Abstract
एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेनेस-मध्यस्थता वाले बालों वाली जड़ परिवर्तन का उपयोग करके ट्रांसजेनिक जड़ों और गैर-ट्रांसजेनिक तनों और कलियों के साथ मिश्रित पौधों का उत्पादन करना जड़ से संबंधित जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। बालों की जड़ परिवर्तन डिकोटाइलडोन की एक विस्तृत श्रृंखला में और कई मोनोकोटाइलडॉन प्रजातियों में स्थापित किया गया है और यह जीनोटाइप से लगभग स्वतंत्र है। मिश्रित पौधों को प्राप्त करने के लिए ए राइजोजेन्स के साथ हाइपोकोटिल इंजेक्शन की पारंपरिक विधि अक्षम, समय लेने वाली, श्रमसाध्य है, और अक्सर निविदा और छोटे हाइपोकोटिल पौधों की मृत्यु का कारण बनती है। राइजोजेनेस द्वारा मध्यस्थता में एक अत्यधिक कुशल, एक-चरण यी बालों वाली जड़ परिवर्तन पहले स्थापित किया गया था, जो बालों की जड़ों के उत्पादन के बाद प्रत्यारोपण की आवश्यकता को समाप्त करता है। इस अध्ययन में, एक आंशिक हाइपोकोटिल और प्राथमिक जड़ को हटा दिया गया था, हाइपोकोटिल चीरा साइट को ए राइजोजेन्स के साथ लेपित किया गया था, और फिर हाइपोकोटिल को बाँझ वर्मीक्यूलाइट में लगाया गया था। 12 दिनों की खेती के बाद, हाइपोकोटिल चीरा का विस्तार हुआ और नई बालों वाली जड़ें प्रेरित हुईं। यह लेख ए राइजोजेनेस द्वारा मध्यस्थता में एक-चरण परिवर्तन विधि का विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, जिसमें जंगली सोयाबीन, सोलनम अमेरिकनम और कद्दू के मिश्रित पौधों का उत्पादन करके इसकी प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया जाता है।
Introduction
एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेनेस राइजोबियासी परिवार से एक ग्राम-नकारात्मक मिट्टी जीवाणु है। राइजोजीन घावों के माध्यम से लगभग सभी डिकोटाइलडोन, कुछ मोनोकोटाइलडोन और व्यक्तिगत जिम्नोस्पर्म को संक्रमित कर सकते हैं, जिससे संक्रमित पौधों में बालों की जड़ें पैदा होती हैं। जीवाणु में री (जड़-उत्प्रेरण) प्लास्मिड होता है, और री प्लास्मिड का टी-डीएनए ओपिन संश्लेषण जीन और रोल जीन (रूट लोकस जीन) को वहन करता है। री प्लास्मिड का टी-डीएनए एक पौधे की कोशिका में प्रवेश करने और एक मेजबान गुणसूत्र में एकीकृत होने के बाद, रोल जीन की अभिव्यक्ति बालोंवाली जड़ों के उत्पादन को प्रेरित करती है। एक लक्ष्य जीन को ले जाने वाले एक पौधे बाइनरी अभिव्यक्ति वेक्टर को ए राइजोजीन में बदल दिया जाता है, और रूपांतरित ए राइजोजीन का उपयोग पौधे को संक्रमित करने के लिए किया जाता है। ट्रांसजेनिक जड़ों को संक्रमित पौधों में प्रेरित किया जा सकता है, जिससे ट्रांसजेनिक जड़ों और गैर-ट्रांसजेनिक तनों और कलियों वाले मिश्रित पौधों का उत्पादन होता है। आम तौर पर, एक समग्र संयंत्र 14-20 दिनों के भीतर प्राप्त किया जा सकता है। राइजोजेनेस-मध्यस्थता वाले बालों की जड़ परिवर्तन आम तौर पर डाइकोटाइलडोनसपौधों में जीनोटाइप द्वारा सीमित नहीं है2. राइजोजेनेस-संक्रमित पौधों द्वारा उत्पादित बालों वाली जड़ों को तेज विकास दर, स्थिर विरासत और आसान संचालन की विशेषता है। राइजोजेनेस द्वारा मध्यस्थ बालों की जड़ परिवर्तन वर्तमान में जड़ से संबंधित जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, बालों की जड़ों के परिवर्तन का उपयोग CRISPR / Cas9 सिस्टम 3,4,5 और प्रोटीन उपकोशिकीय स्थानीयकरण की लक्ष्य-संपादन दक्षता को मान्य और अनुकूलित करने के लिए भी किया जा सकता है। इसलिए, बालों वाली जड़ परिवर्तन पौधे जीन फ़ंक्शन, चयापचय इंजीनियरिंग, और जड़ों और राइजोस्फीयर सूक्ष्मजीवों के बीच बातचीत 6,7,8 पर शोध में एक महत्वपूर्ण उपकरण है।
बालों की जड़ परिवर्तन के माध्यम से प्राप्त ट्रांसजेनिक जड़ों वाले मिश्रित पौधों का व्यापक रूप से डाइकोटाइलडोनस पौधों में उत्पादन किया गया है, खासकर फलियों में। राइजोजेनेस के साथ हाइपोकोटिल को इंजेक्ट करने की पारंपरिक विधि का उपयोग मिश्रित लोटस कॉर्निकुलटस9, सोयाबीन10, टमाटर 11, शकरकंद12, और कईअन्य पौधों 5,8 का उत्पादन करने के लिए किया गया है। हाइपोकोटिल-इंजेक्शन विधि अक्षम है और युवा या छोटे हाइपोकोटिल पौधों की मृत्यु का कारण बनने की संभावना है। इसलिए, भ्रूण की जड़ों को काटकर, ए राइजोजीन के साथ अंकुर चीरा को कोटिंग करके, और फिर जड़ से खेती के लिए बाँझ संस्कृति माध्यम पर हाइपोकोटिल को रखकर विधि में सुधार किया गया था। हालांकि, उन चरणों को बाँझ वातावरण में किया जाता है, और ऑपरेशन चरण अपेक्षाकृत बोझिल होते हैं। विशेष रूप से, परिणामी मिश्रित पौधों को प्रत्यारोपित करने की आवश्यकता होती है, जिससे काम की मात्रा बढ़ जाती है। पिछले काम में, ककड़ी, सोयाबीन, लोटस जैपोनिकस, मेडिकागो ट्रंकाटुला और टमाटर 2,14,15,16,17 में एक-चरण ए राइजोजेनेस-मध्यस्थता (एआरएम) बालों की जड़ परिवर्तन स्थापित किया गया था। प्राथमिक जड़ और आंशिक हाइपोकोटिल को हटा दिया गया था, शेष हाइपोकोटिल के चीरा स्थल को रूपांतरित ए राइजोजीन के साथ लेपित किया गया था, और अंकुर को तब नम बाँझ वर्मीक्यूलाइट में लगाया गया था। 12 दिनों की खेती के बाद, चीरा स्थल पर बालों वाली जड़ें पैदा हुईं। एक-चरण एआरएम विधि अत्यधिक कुशल है और बालों की जड़ों का उत्पादन करने के लिए कम समय की आवश्यकता होती है। बालों वाली जड़ें बनाने के बाद रोपाई भी आवश्यक नहीं है। क्योंकि प्रत्यारोपण के बिना माइक्रोबियल संदूषण से बचा जा सकता है, पौधों और सूक्ष्मजीवों के बीच बातचीत का अध्ययन करते समय एक-चरण एआरएम विधि विशेष रूप से उपयोगी हो सकती है, जैसे कि फलीदार पौधों और राइजोबिया के बीच सहजीवी नाइट्रोजन निर्धारण, और पौधों और आर्बसकुलर माइकोराइजाल कवक के बीच सहजीवन। इस पेपर में, जंगली सोयाबीन, सोलनम अमेरिकनम और कद्दू में उत्पादित मिश्रित पौधों के उदाहरणों के साथ एक विस्तृत एक-चरण ए राइजोजेनेस-मध्यस्थता बालों वाली जड़ परिवर्तन प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। प्रोटोकॉल के साथ, शोधकर्ता आसानी से एक-चरण एआरएम परिवर्तन कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
राइजोजेनेस-मध्यस्थता वाली बालों वाली जड़ विधि हाइपोकोटिल-इंजेक्शन विधि की तुलना में मिश्रित पौधों के उत्पादन के लिए एक सरल और अधिक कुशल विधि है। एक-चरण एआरएम विधि बालों की जड़ परिवर्तन की दक्षता म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को लियाओचेंग विश्वविद्यालय (318012028) के अनुसंधान कोष और शेडोंग प्रांत (ZR2020MC034) के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
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