Summary
Hier stellen wir das detaillierte Protokoll einer einstufigen Transformationsmethode zur Verfügung, die durch Agrobacterium tumefaciens zur Herstellung von Mischpflanzen vermittelt wird.
Abstract
Die Produktion von Kompositpflanzen mit transgenen Wurzeln und nicht-transgenen Stängeln und Knospen unter Verwendung der durch Agrobacterium rhizogenes vermittelten haarigen Wurzeltransformation ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der wurzelbezogenen Biologie. Die Haarwurzeltransformation ist bei einer Vielzahl von Dikotyledonen und bei mehreren Monokotyledonenarten etabliert und nahezu unabhängig vom Genotyp. Die traditionelle Methode der Hypokotylinjektion mit A. rhizogenes zur Gewinnung von Mischpflanzen ist ineffizient, zeitaufwändig, mühsam und führt häufig zum Absterben zarter und winziger Hypokotylpflanzen. Zuvor wurde eine hocheffiziente, einstufige Haarwurzeltransformation etabliert, die durch A. rhizogenes vermittelt wird und die ein Umtopfen nach der Produktion von Haarwurzeln überflüssig macht. In dieser Studie wurden ein Teil der Hypokotyl- und Primärwurzel entfernt, die Hypokotyl-Inzisionsstelle wurde mit A. rhizogenes beschichtet und dann wurden Hypokotyle in sterilen Vermiculit gepflanzt. Nach 12 Tagen Kultivierung dehnte sich der Hypokotylschnitt aus und es wurden neue behaarte Wurzeln induziert. Dieser Artikel enthält das detaillierte Protokoll einer einstufigen Transformationsmethode, die durch A. rhizogenes vermittelt wird und deren Wirksamkeit durch die Herstellung von Mischpflanzen aus wilder Sojabohne, Solanum americanum und Kürbis nachgewiesen wurde.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes ist ein gramnegatives Bodenbakterium aus der Familie der Rhizobiaceae. A. rhizogenes kann fast alle Dikotyledonen, einige wenige Monokotyledonen und einzelne Gymnospermen durch Wunden infizieren und behaarte Wurzeln in infizierten Pflanzen produzieren. Das Bakterium trägt das Ri-Plasmid (wurzelinduzierend), und die T-DNA des Ri-Plasmids trägt das Gen für die Oppinsynthese und die Rollengene (Gene des Wurzellocus). Nachdem die T-DNA des Ri-Plasmids in eine Pflanzenzelle eingedrungen und in ein Wirtschromosom integriert wurde, induziert die Expression der Rollengene die Produktion von Haarwurzeln1. Ein binärer Expressionsvektor einer Pflanze, der ein Zielgen trägt, wird in A. rhizogenes umgewandelt, und der transformierte A. rhizogenes wird verwendet, um eine Pflanze zu infizieren. Transgene Wurzeln können in infizierten Pflanzen induziert werden, wodurch zusammengesetzte Pflanzen entstehen, die transgene Wurzeln und nicht-transgene Stängel und Knospen enthalten. Im Allgemeinen kann eine zusammengesetzte Pflanze innerhalb von 14-20 Tagen erhalten werden. Die A. rhizogenes-vermittelte Haarwurzeltransformation ist bei zweikeimblättrigen Pflanzen im Allgemeinen nicht durch den Genotyp begrenzt2. Die behaarten Wurzeln, die von A. rhizogenes-infizierten Pflanzen produziert werden, zeichnen sich durch eine schnelle Wachstumsrate, eine stabile Vererbung und eine einfache Bedienung aus. Die Transformation von Haarwurzeln, die durch A. rhizogenes vermittelt wird, wird derzeit häufig zur Untersuchung der wurzelbezogenen Biologie verwendet. Darüber hinaus kann die Transformation von Haarwurzeln auch dazu verwendet werden, die Effizienz des CRISPR/Cas9-Systems 3,4,5 und der subzellulären Lokalisierung von Proteinen zu validieren und zu optimieren. Daher ist die Transformation von Haarwurzeln ein wichtiges Werkzeug in der Erforschung der Funktion von Pflanzengenen, des Metabolic Engineering und der Wechselwirkungen zwischen Wurzeln und Mikroorganismen der Rhizosphäre 6,7,8.
Kompositpflanzen mit transgenen Wurzeln, die durch Haarwurzeltransformation gewonnen werden, sind in zweikeimblättrigen Pflanzen, insbesondere in Hülsenfrüchten, weit verbreitet. Die traditionelle Methode der Injektion von A. rhizogenes in das Hypokotyl wurde verwendet, um zusammengesetzten Lotus corniculatus9, Sojabohnen10, Tomaten11, Süßkartoffeln12 und viele andere Pflanzen zu produzieren 5,8. Die Hypokotyl-Injektionsmethode ist ineffizient und führt wahrscheinlich zum Absterben junger oder winziger Hypokotylpflanzen. Daher wurde die Methode verbessert, indem die embryonalen Wurzeln abgeschnitten, der Keimlingsschnitt mit A. rhizogenes beschichtet und dann das Hypokotyl auf steriles Nährmedium für die Bewurzelungskultivierung gelegtwurde 13. Diese Schritte werden jedoch in einer sterilen Umgebung durchgeführt, und die Operationsschritte sind relativ umständlich. Insbesondere die entstehenden Mischpflanzen müssen umgepflanzt werden, was den Arbeitsaufwand erhöht. In früheren Arbeiten wurde eine einstufige A. rhizogenes-vermittelte (ARM) Haarwurzeltransformation in Gurken, Sojabohnen, Lotus japonicus, Medicago truncatula und Tomaten etabliert 2,14,15,16,17. Die Primärwurzel und ein Teil des Hypokotyls wurden entfernt, die Inzisionsstelle des verbleibenden Hypokotyls wurde mit transformiertem A. rhizogenes beschichtet und der Keimling wurde dann in feuchten, sterilen Vermiculit gepflanzt. Nach 12 Tagen Kultivierung wurden an der Inzisionsstelle behaarte Wurzeln gebildet. Die einstufige ARM-Methode ist hocheffizient und benötigt weniger Zeit, um behaarte Wurzeln zu produzieren. Auch ein Umtopfen nach der Bildung von Haarwurzeln ist nicht notwendig. Da eine mikrobielle Kontamination ohne Transplantation vermieden werden kann, kann die einstufige ARM-Methode besonders nützlich sein, wenn es darum geht, Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroorganismen zu untersuchen, wie z. B. die symbiotische Stickstofffixierung zwischen Leguminosen und Rhizobien sowie Symbiosen zwischen Pflanzen und arbuskulären Mykorrhizapilzen. In dieser Arbeit wird ein detailliertes einstufiges A. rhizogenes-vermitteltes Haarwurzel-Transformationsprotokoll mit Beispielen von Kompositpflanzen aus wilder Sojabohne, Solanum americanum und Kürbis vorgestellt. Mit dem Protokoll können Forscher die einstufige ARM-Transformation reibungslos durchführen.
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Protocol
1. Pflanzenwachstumsbedingungen und Kultur von A. rhizogenes
- Aussaat von Saatgut
HINWEIS: Wilde Sojabohnensamen wurden im Kreis Yanggu, Liaocheng, China, gesammelt. Samen von S. americanum und der lokalen Kürbissorte Yinsu wurden auf einem Markt gekauft.- Samen von wilder Sojabohne, S. americanum und der lokalen Kürbissorte sammeln, 1 cm tief in Vermiculit säen und gründlich gießen. Pflanzen Sie 20 Samen in 8 cm x 11 cm x 9 cm große Plastikboxen. Kultivieren Sie die Pflanzen in einer Wachstumskammer bei 24 ± 2 °C mit einem Zyklus von 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit bei ca. 70 % relativer Luftfeuchtigkeit.
HINWEIS: Die Hüllen von wilden Sojabohnensamen müssen vor der Aussaat gebrochen werden. Konzentriert sich die Forschungsfrage auf Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroorganismen, müssen Saatgut, Vermiculit, Kunststoffboxen und Wasser vor der Verwendung sterilisiert werden. - Aktivierung und Kultur von A. rhizogenes K599
HINWEIS: Der Stamm A. rhizogenes K599 hatte einen binären Vektor pRed13052 , der ein rot fluoreszierendes Reportergen DsRed2 trug.- Den A. rhizogenes-Stamm K599 aus dem Gefrierschrank bei -80 °C nehmen und die Bakterien auf festem LB-Medium (mit 50 mg/l Kanamycin und 50 mg/l Streptomycin) bei 28 °C für 48 h aktivieren.
- Wählen Sie einen einzelnen Klon des Stammes K599 aus und kultivieren Sie ihn 12 Stunden lang in 1 ml flüssigem, antibiotikahaltigem LB-Medium.
- 500 μl der Bakteriensuspension werden gleichmäßig auf festem, antibiotikahaltigem LB-Medium verteilt, gefolgt von einer Inkubation bei 28 °C für 24 h.
- Samen von wilder Sojabohne, S. americanum und der lokalen Kürbissorte sammeln, 1 cm tief in Vermiculit säen und gründlich gießen. Pflanzen Sie 20 Samen in 8 cm x 11 cm x 9 cm große Plastikboxen. Kultivieren Sie die Pflanzen in einer Wachstumskammer bei 24 ± 2 °C mit einem Zyklus von 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit bei ca. 70 % relativer Luftfeuchtigkeit.
2. Einstufige A. rhizogenes-vermittelte Haarwurzel-Transformationsmethode
- Hypokotyl-Inzision
- Nach 7 Tagen (definieren Sie die Aussaat der Samen als Tag 0), haben sich die Keimblätter der Sämlinge gerade entfaltet (Abbildung 1A), schneiden Sie mit einem sterilisierten, scharfen Skalpell etwa 0,5-1 cm des Hypokotyls ab (Abbildung 1B). Verwerfen Sie die Primärwurzel und einen Teil des partiellen Hypokotyls.
HINWEIS: Verwenden Sie das Skalpell mit Vorsicht.
- Nach 7 Tagen (definieren Sie die Aussaat der Samen als Tag 0), haben sich die Keimblätter der Sämlinge gerade entfaltet (Abbildung 1A), schneiden Sie mit einem sterilisierten, scharfen Skalpell etwa 0,5-1 cm des Hypokotyls ab (Abbildung 1B). Verwerfen Sie die Primärwurzel und einen Teil des partiellen Hypokotyls.
- K599 Impfung
- Beschichten Sie den Hypokotylschnitt mit K599-Bakterien (Abbildung 1C).
- Pflanzen Sie die Sämlinge in feuchten Vermiculit (Abbildung 1D).
- Infizieren Sie 30 Pflanzen jeder Art über die A. rhizogenes-vermittelte Haarwurzeltransformation. Gießen Sie jede Pflanze mit 5 ml resuspendierter K599-Bakteriensuspension (OD600 = 0,5-0,6) in einem viertel starken (0,25x) Gamborg B-5-Basismedium (Abbildung 1E).
- Decken Sie die Töpfe mit einem hochtransparenten Plastikbeutel ab (Abbildung 1F) und stellen Sie sie in eine Wachstumskammer.
3. Behaarte Wurzelproduktion
- Lassen Sie die Pflanzen ~12 Tage nach der Inokulation wachsen, neue behaarte Wurzeln werden induziert und an der Inzisionsstelle erzeugt. Nach 15 Tagen erreichen die behaarten Wurzellängen typischerweise 2-5 cm (Abbildung 2).
- Um festzustellen, ob die produzierten Haarwurzeln transgen sind, untersuchen Sie die Expression von Reportergenen, die vom transformierten Vektor in K599 abhängig sind.
- Nachweis der Expression des Reportergens DsRed2 mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem mit grünem Anregungslicht bei 540 nm und Emission bei 600 nm (Abbildung 2B, Abbildung 2D und Abbildung 2F).
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Representative Results
Hocheffiziente einstufige A. rhizogenes-vermittelte Haarwurzeltransformation
Behaarte Wurzeln wurden 12 Tage nach der Inokulation mit künstlich hergestelltem K599 an der Hypokotyl-Inzisionsstelle produziert. Transgene Haarwurzeln wurden anhand der Expression des im binären Vektor enthaltenen Reportergens bestimmt. Transgene Wurzeln, die mit dem Reportergen DsRed2 von zusammengesetzten wilden Sojabohnen, S. americanum und Kürbis transformiert wurden, wurden unter natürlichem (Abbildung 2A, Abbildung 2C und Abbildung 2E) und grünem Anregungslicht (Abbildung 2B, Abbildung 2D und Abbildung 2F) beobachtet.
Wenn eine zusammengesetzte Pflanze mindestens eine transgene Wurzel enthielt, wurde sie als transgene zusammengesetzte Pflanze bezeichnet. Unter den 30 inokulierten Pflanzen jeder der drei Arten waren 28 wilde Sojabohnen, 18 S. Americanum und 30 Kürbispflanzen transgene Komposite. So betrug die Effizienz der Haarwurzeltransformation 93,3 % (Sojabohne), 60 % (S. americanum) und 100 % (Kürbis). Ein Vergleich der drei Pflanzenarten zeigte, dass Pflanzen mit dicken Hypokotylen mehr transgene Haarwurzeln produzierten als solche mit dünnen Hypokotylen.
Abbildung 1: Einstufige A. rhizogenes-vermittelte Haarwurzeltransformation. (A) Sieben Tage alte Kürbissämlinge. (B) Apikaler Teil des Hypokotyls, der in K599-Bakterienlösung geschnitten wurde. (C) K599 Bakterienmasse, die den Hypokotyleinschnitt bedeckt. (D) Explantat in nassen, sterilen Vermiculit gepflanzt. (E) Bewässerung mit 5 ml resuspendierter K599-Bakterienlösung in viertelstarker (0,25x) Gamborg B-5 Basismedium. (F) Hochtransparente Plastiktütenabdeckung. Maßstabsbalken = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Kompositpflanzen, die aus einer einstufigen A. rhizogenes-vermittelten Haarwurzeltransformation gewonnen wurden. Wurzeln von Korbblütlern aus (A,B) wilder Sojabohne, (C,D) Solanum americanum und (E,F) Kürbis unter (A,C,E) natürlichem und (B,D,F) grünem Anregungslicht. Weiße Pfeile weisen auf transgene Haarwurzeln hin; Schwarze Pfeile zeigen nicht-transgene Haarwurzeln an. Maßstabsbalken = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die einstufige A. rhizogenes-vermittelte Haarwurzelmethode ist eine einfachere und effizientere Methode zur Herstellung von Mischpflanzen als die Hypokotyl-Injektionsmethode. Die einstufige ARM-Methode verbessert die Effizienz der Haarwurzeltransformation erheblich, verkürzt die Zeit bis zur Herstellung von Haarwurzeln, erhöht die Anzahl der Haarwurzeln und reduziert den Arbeitsaufwand. Das verbesserte Transformationsprotokoll ist optimal für Studien zu Symbiosen zwischen Leguminosen und Rhizobien sowie zwischen Pflanzen und arbuskulären Mykorrhizapilzen. Dies ist darauf zurückzuführen, dass eine Transplantation von Mischpflanzen nach der Produktion von Haarwurzeln nicht erforderlich ist, wodurch die Kontamination mit nicht inokulierten Stämmen, die beim Umpflanzen auftritt, vermieden wird. Des Weiteren lag die Umwandlungseffizienz bei einer Pflanzenart (Kürbis) bei 100%.
Die folgenden Gründe könnten erklären, warum die einstufige ARM-Methode bei der Haarwurzeltransformation effizienter war als die Hypokotyl-Injektionsmethode. Erstens, obwohl die Primärwurzel entfernt wurde, blieb die Transpiration der Sämlinge erhalten. So erleichterte der Transpirationszug die Invasion von A. rhizogenes in Hypokotylzellen in der Inzision. Zweitens war die durch den Hypokotylschnitt verursachte Wundfläche größer als die durch die Hypokotyl-Injektionsmethode verursachte, und daher wurden mehr Pflanzenzellen mit A. rhizogenes infiziert. Zuletzt wurde der Hypokotyleinschnitt nach Entfernung der Primärwurzel in dunklem und feuchtem Vermiculit begraben, was eine günstige Umgebung für die Bildung von Wurzeln darstellt18.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Forschungsfonds der Universität Liaocheng (318012028) und der Natural Science Foundation der Provinz Shandong (ZR2020MC034) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
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