Summary
여기에서는 복합 식물을 생산하기 위해 Agrobacterium tumefaciens 가 매개하는 원스텝 형질전환 방법의 자세한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
아그로박테리움 뿌리 유전자 매개 털이 많은 뿌리 형질전환을 사용하여 형질전환 뿌리와 비형질전환 줄기 및 새싹이 있는 복합 식물을 생산하는 것은 뿌리 관련 생물학을 연구하는 강력한 도구입니다. 털이 많은 뿌리 변형은 광범위한 쌍떡잎 식물과 여러 외떡잎 식물 종에서 확립되며 유전자형과 거의 무관합니다. 복합 식물을 얻기 위해 A. rhizogenes로 배축을 주사하는 전통적인 방법은 비효율적이고 시간이 많이 걸리며 힘들고 부드럽고 작은 배축 식물이 자주 죽습니다. A. rhizogenes에 의해 매개되는 매우 효율적인 1단계 털이 많은 뿌리 변형이 이전에 확립되어 털이 많은 뿌리를 생산한 후 이식할 필요가 없습니다. 본 연구에서는 부분적인 배축과 일차뿌리를 제거하고 배축 절개 부위를 A. rhizogenes로 코팅한 후 멸균 질석에 배축을 심었다. 재배 12일 후, 배축 절개가 확장되고 새로운 털이 많은 뿌리가 유도되었습니다. 이 기사는 A. rhizogenes에 의해 매개되는 원스텝 형질전환 방법의 상세한 프로토콜을 제공하며, 그 효과는 야생 대두, Solanum americanum 및 호박의 복합 식물을 생산함으로써 입증되었습니다.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes는 Rhizobiaceae 계통의 그람 음성 토양 박테리아입니다. A. rhizogenes는 상처를 통해 거의 모든 쌍떡잎식물, 소수의 외떡잎식물 및 개별 겉씨식물을 감염시켜 감염된 식물에 털이 많은 뿌리를 생성할 수 있습니다. 박테리아는 Ri(root-inducing) 플라스미드를 운반하고, Ri 플라스미드의 T-DNA는 오핀 합성 유전자와 rol 유전자(root locus genes)를 운반합니다. Ri 플라스미드의 T-DNA가 식물 세포에 들어가 숙주 염색체에 집적된 후, 롤롤 유전자의 발현은 털이 많은 뿌리1의 생성을 유도한다. 표적 유전자를 담지한 식물 이진 발현 벡터를 A. rhizogenes로 형질전환시키고, 형질전환된 A. rhizogenes를 이용하여 식물을 감염시킨다. 형질전환 뿌리는 감염된 식물에서 유도될 수 있으며, 형질전환 뿌리 및 비형질전환 줄기 및 새싹을 포함하는 복합 식물을 생산할 수 있습니다. 일반적으로 복합 식물은 14-20 일 이내에 얻을 수 있습니다. A. rhizogenes 매개 털이 많은 뿌리 형질전환은 일반적으로 쌍떡잎식물에서 유전자형에 의해 제한되지 않는다2. A. rhizogenes에 감염된 식물에 의해 생산되는 털이 많은 뿌리는 빠른 성장 속도, 안정적인 유전 및 쉬운 조작이 특징입니다. A. rhizogenes에 의해 매개되는 털이 많은 뿌리 형질전환은 현재 뿌리 관련 생물학을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 또한, 털이 많은 뿌리의 형질전환은 CRISPR/Cas9 시스템 3,4,5 및 단백질 세포 내 국소화의 표적 편집 효율을 검증하고 최적화하는 데에도 사용할 수 있습니다. 따라서 털이 많은 뿌리 변형은 식물 유전자 기능, 대사 공학 및 뿌리와 근권 미생물 간의 상호 작용에 대한 연구에서 중요한 도구입니다 6,7,8.
털이 많은 뿌리 형질전환을 통해 얻은 형질전환 뿌리를 포함하는 복합 식물은 쌍떡잎식물 식물, 특히 콩과 식물에서 널리 생산되었습니다. 배축에 A. rhizogenes를 주입하는 전통적인 방법은 복합 연꽃 corniculatus9, 콩10, 토마토 11, 고구마12 및 기타 많은 식물 5,8을 생산하는 데 사용되었습니다. 배축 주입 방법은 비효율적이며 젊거나 작은 배축 식물을 죽일 수 있습니다. 따라서, 배아 뿌리를 잘라내고, 절개 묘목을 A. rhizogenes로 코팅한 다음, 배축을 발근 배양을 위한 멸균 배양 배지에 올려놓음으로써 방법을 개선하였다13. 그러나 이러한 단계는 무균 환경에서 수행되며 작업 단계는 상대적으로 번거롭습니다. 특히, 생성 된 복합 식물을 이식해야하므로 작업량이 증가합니다. 이전 연구에서, 오이, 대두, Lotus japonicus, Medicago truncatula 및 토마토 2,14,15,16,17에서 원스텝 A. rhizogenes-mediated (ARM) 털이 많은 뿌리 형질전환이 확립되었다. 1차 뿌리와 부분적인 배축을 제거하고, 나머지 배축의 절개 부위를 형질전환된 A. rhizogenes로 코팅한 다음, 묘목을 촉촉한 멸균 질석에 심었습니다. 재배 12 일 후, 절개 부위에 털이 많은 뿌리가 생성되었습니다. 원스텝 ARM 방법은 매우 효율적이며 털이 많은 뿌리를 생산하는 데 더 적은 시간이 필요합니다. 털이 많은 뿌리를 형성 한 후 이식하는 것도 필요하지 않습니다. 이식 없이 미생물 오염을 피할 수 있기 때문에 원스텝 ARM 방법은 콩과 식물과 Rhizobia 사이의 공생 질소 고정, 식물과 arbuscular mycorrhizal 균류 간의 공생과 같은 식물과 미생물 간의 상호 작용을 연구할 때 특히 유용할 수 있습니다. 이 논문에서는 야생 대두, Solanum americanum 및 호박에서 생산된 복합 식물의 예와 함께 상세한 1단계 A. rhizogenes 매개 털이 많은 뿌리 형질전환 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜을 통해 연구원들은 원스텝 ARM 변환을 원활하게 수행할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 식물 생장 조건 및 A. rhizogenes 배양
- 종자 파종
참고: 야생 콩 종자는 중국 랴오청시 양구현에서 수집되었습니다. S. americanum 과 호박 지역 품종 Yinsu의 씨앗은 시장에서 구입했습니다.- 야생 콩, S. americanum 및 현지 품종의 호박의 씨앗을 모아 1cm 깊이의 질석에 뿌리고 철저히 물을줍니다. 8cm x 11cm x 9cm 플라스틱 상자에 20 개의 씨앗을 심습니다. 약 70 % 상대 습도에서 16 시간 빛 / 8 시간 어둠주기로 24 ± 2 ° C의 성장 챔버에서 식물을 재배합니다.
알림: 야생 콩 씨앗의 코트는 파종 전에 깨뜨려야 합니다. 연구 질문이 식물과 미생물 간의 상호 작용에 초점을 맞추는 경우 씨앗, 질석, 플라스틱 상자 및 물을 사용하기 전에 멸균해야 합니다. - A. rhizogenes K599의 활성화 및 배양
참고: A. rhizogenes K599 균주는 적색 형광 리포터 유전자 DsRed2를 운반하는 하나의 이진 벡터 pRed13052를 가졌습니다.- A. rhizogenes 균주 K599를 -80°C 냉동고에서 꺼내고 28°C에서 48시간 동안 고체 LB 배지(50mg/L 카나마이신 및 50mg/L 스트렙토마이신 포함)에서 박테리아를 활성화합니다.
- 균주 K599의 단일 클론을 골라 1mL의 액체 항생제 함유 LB 배지에서 12시간 동안 배양합니다.
- 박테리아 현탁액 500μL를 고체 항생제 함유 LB 배지에 골고루 펴 바른 다음 28°C에서 24시간 동안 배양합니다.
- 야생 콩, S. americanum 및 현지 품종의 호박의 씨앗을 모아 1cm 깊이의 질석에 뿌리고 철저히 물을줍니다. 8cm x 11cm x 9cm 플라스틱 상자에 20 개의 씨앗을 심습니다. 약 70 % 상대 습도에서 16 시간 빛 / 8 시간 어둠주기로 24 ± 2 ° C의 성장 챔버에서 식물을 재배합니다.
2. 원스텝 A. rhizogenes 매개 털뿌리형질전환 방법
- 배축 절개
- 7 일 후 (종자 파종을 0 일로 정의), 묘목 자엽이 막 펼쳐지고 (그림 1A), 멸균 된 날카로운 메스를 사용하여 약 0.5-1cm의 배축을 자릅니다 (그림 1B). 1차 뿌리와 일부 배축을 버립니다.
알림: 메스를 주의해서 사용하십시오.
- 7 일 후 (종자 파종을 0 일로 정의), 묘목 자엽이 막 펼쳐지고 (그림 1A), 멸균 된 날카로운 메스를 사용하여 약 0.5-1cm의 배축을 자릅니다 (그림 1B). 1차 뿌리와 일부 배축을 버립니다.
- K599 접종
- 배축 절개 부위를 K599 박테리아로 코팅합니다(그림 1C).
- 축축한 질석에 묘목을 심습니다(그림 1D).
- A. rhizogenes 매개 털이 많은 뿌리 변형을 통해 각 종의 30개 식물을 감염시킵니다. 5 mL의 재현 탁 된 K599 박테리아 현탁액 (OD600 = 0.5-0.6)을 1/4 강도 (0.25x) Gamborg B-5 기본 배지 (그림 1E)에 물을줍니다.
- 화분을 매우 투명한 비닐 봉지(그림 1F)로 덮고 성장 챔버에 넣습니다.
3. 털이 많은 뿌리 생산
- 접종 후 ~12일 동안 식물을 키우면 절개 부위에 새로운 털이 많은 뿌리가 유도되고 생성됩니다. 15일 후 털이 많은 뿌리 길이는 일반적으로 2-5cm에 이릅니다(그림 2).
- 생성된 털이 많은 뿌리가 형질전환인지 여부를 결정하기 위해 K599에서 형질전환된 벡터에 의존하는 리포터 유전자의 발현을 조사합니다.
- 540nm에서 녹색 여기 광과 600nm에서 방출되는 화학발광 이미징 시스템을 사용하여 리포터 유전자 DsRed2의 발현을 검출합니다(그림 2B, 그림 2D 및 그림 2F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
고효율 원스텝 A. rhizogenes 매개 털이 많은 뿌리 형질전환
조작된 K599로 접종한 지 12일 후 배축 절개 부위에 털이 많은 뿌리가 생성되었습니다. 형질전환 털뿌리는 이진 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현에 기초하여 결정하였다. 복합 야생 대두, S. americanum 및 호박의 리포터 유전자 DsRed2로 형질전환된 형질전환 뿌리는 자연광(도 2A, 도 2C 및 도 2E) 및 녹색 여기광(도 2B, 도 2D 및 도 2F) 하에서 관찰되었다.
복합 식물이 적어도 하나의 형질전환 뿌리를 함유하는 경우, 이를 형질전환 복합 식물로 지정하였다. 3종 각각의 접종 식물 30종 중 야생 대두 28종, S. 아메리카넘 18종, 호박식물 30종이 형질전환 복합재였다. 따라서, 털뿌리형질전환 효율은 93.3%(대두), 60%(S. americanum), 100%(호박)였다. 세 가지 유형의 식물을 비교한 결과, 배축이 두꺼운 식물은 배축이 얇은 식물보다 형질전환 털이 많은 뿌리를 더 많이 생산했습니다.
그림 1: 원스텝 A. rhizogenes 매개 털이 많은 뿌리 변형. (A) 7 일 된 호박 묘목. (B) K599 박테리아 용액에서 절단된 배축의 정점 부분. (C) K599 박테리아 덩어리 코팅, 배축 절개. (D) 습하고 멸균 된 질석에 심은 외식편. (E) 4분의 1 강도(0.25x) Gamborg B-5 기본 배지에 재현탁된 K599 박테리아 용액 5mL로 급수. (F) 매우 투명한 비닐 봉지 덮개. 스케일 바 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 1단계 A. rhizogenes 매개 털이 많은 뿌리 형질전환에서 얻은 복합 식물. (A,B) 야생 대두, (C,D) Solanum americanum 및 (E,F) 호박의 복합 식물 뿌리는 (A,C,E) 천연 및 (B,D,F) 녹색 여기광 아래에 있습니다. 흰색 화살표는 형질 전환 털이 많은 뿌리를 나타냅니다. 검은 색 화살표는 비 형질 전환 털이 많은 뿌리를 나타냅니다. 스케일 바 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
원스텝 A. rhizogenes 매개 털이 많은 뿌리 방법은 배축 주입 방법보다 복합 식물을 생산하는 더 간단하고 효율적인 방법입니다. 원스텝 ARM 방법은 털이 많은 뿌리 변형의 효율성을 크게 향상시키고, 털이 많은 뿌리를 생성하는 시간을 단축하고, 털이 많은 뿌리의 수를 늘리고, 관련된 작업량을 줄입니다. 개선된 형질전환 프로토콜은 콩과 식물과 근경 사이, 식물과 arbuscular mycorrhizal 균류 사이의 공생 연구에 최적입니다. 이것은 털이 많은 뿌리를 생산 한 후 복합 식물을 이식 할 필요가 없기 때문에 이식 중에 발생하는 접종되지 않은 균주에 의한 오염을 피할 수 있기 때문일 수 있습니다. 또한, 형질전환 효율은 1종의 식물종(호박)에서 100%였다.
다음과 같은 이유로 원스텝 ARM 방법이 털이 많은 뿌리 형질전환에서 배축 주입 방법보다 더 효율적인 이유를 설명할 수 있습니다. 첫째, 1차 뿌리는 제거되었지만 묘목 증산은 유지되었습니다. 따라서, 증산당김은 A. rhizogenes 절개 부위의 배축세포의 침윤을 촉진시켰다. 둘째, 배축 절개로 인한 상처 부위가 배축 주입법으로 인한 상처 부위보다 커서 A. rhizogenes에 의해 더 많은 식물 세포가 감염되었습니다. 마지막으로, 원근을 제거한 후, 배축을 절개하여 어둡고 축축한 질석에 묻었는데, 이는 뿌리를 생산하기에 유리한 환경이다(18).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 랴오청 대학교 (318012028)의 연구 기금과 산 동성 자연 과학 재단 (ZR2020MC034)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).
- Du, H., et al. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).
- Nguyen, D. V., et al. An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.). Frontiers in Plant Science. 12, 770062 (2022).
- Liu, S., et al. AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 952428 (2022).
- Irigoyen, S., et al. Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp. Nature Communications. 11 (1), 5802 (2020).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Stougaard, J. Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation. Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Yu, Y., et al. Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots. Horticulture Research. 7, 131 (2020).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).
- Fan, Y., et al. One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. BMC Plant Biology. 20 (1), 208 (2020).
- Fan, Y., et al. Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Methods. 16, 94 (2020).
- Wang, X., et al. Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae. Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).
- Wang, X., et al. Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 1104905 (2023).
- Li, Q. Q., et al. Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).
