Summary
Aqui, apresentamos o protocolo detalhado de um método de transformação em uma etapa mediado por Agrobacterium tumefaciens para produzir plantas compostas.
Abstract
A produção de plantas compostas com raízes transgênicas e caules e gemas não transgênicas usando a transformação de raízes pilosas mediada por Agrobacterium rhizogenes é uma ferramenta poderosa para estudar a biologia relacionada às raízes. A transformação de raízes pilosas é estabelecida em uma ampla gama de dicotiledôneas e em várias espécies de monocotiledôneas e é quase independente do genótipo. O método tradicional de injeção de hipocótilo com A. rhizogenes para obtenção de plantas compostas é ineficiente, demorado, trabalhoso e frequentemente causa a morte de plantas tenras e minúsculas de hipocótilo. Uma transformação radicular pilosa altamente eficiente, de uma etapa, mediada por A. rhizogenes , foi estabelecida previamente, o que elimina a necessidade de transplante após a produção de raízes pilosas. Neste estudo, um hipocótilo parcial e uma raiz primária foram removidos, o local da incisão do hipocótilo foi recoberto com A. rhizogenes e, em seguida, os hipocótilos foram plantados em vermiculita estéril. Após 12 dias de cultivo, a incisão do hipocótilo expandiu-se e novas raízes pilosas foram induzidas. Este artigo fornece o protocolo detalhado de um método de transformação em uma etapa mediado por A. rhizogenes, com sua eficácia demonstrada pela produção de plantas compostas de soja silvestre, Solanum americanum e abóbora.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes é uma bactéria gram-negativa do solo da família Rhizobiaceae. A. rhizogenes pode infectar quase todas as dicotiledôneas, algumas monocotiledôneas e gimnospermas individuais através de feridas, produzindo raízes pilosas em plantas infectadas. A bactéria carrega o plasmídeo Ri (indutor de raízes), e o T-DNA do plasmídeo Ri carrega o gene de síntese de opina e os genes rol (genes do locus radicular). Após o DNA-T do plasmídeo Ri entrar em uma célula vegetal e se integrar a um cromossomo hospedeiro, a expressão dos genes rol induz a produção de raízes pilosas1. Um vetor de expressão binária de planta que carrega um gene alvo é transformado em A. rhizogenes, e o A. rhizogenes transformado é usado para infectar uma planta. Raízes transgênicas podem ser induzidas em plantas infectadas, produzindo plantas compostas contendo raízes transgênicas e caules e gemas não transgênicas. Geralmente, uma planta composta pode ser obtida dentro de 14-20 dias. A transformação de raízes pilosas mediada por A. rhizogenes geralmente não é limitada pelo genótipo em plantas dicotiledôneas2. As raízes pilosas produzidas por plantas infectadas por A. rhizogenes são caracterizadas por uma rápida taxa de crescimento, herança estável e fácil operação. A transformação de raízes pilosas mediada por A. rhizogenes é atualmente amplamente utilizada para estudar a biologia relacionada às raízes. Além disso, a transformação de raízes pilosas também pode ser usada para validar e otimizar a eficiência de edição de alvos do sistema CRISPR/Cas9 3,4,5 e a localização subcelular de proteínas. Portanto, a transformação de raízes pilosas é uma importante ferramenta em pesquisas sobre função gênica de plantas, engenharia metabólica e interações entre raízes e microrganismos rizosféricos 6,7,8.
Plantas compostas contendo raízes transgênicas obtidas através da transformação de raízes pilosas têm sido amplamente produzidas em plantas dicotiledôneas, especialmente em leguminosas. O método tradicional de injeção do hipocótilo com A. rhizogenes tem sido utilizado para produzir o composto Lotus corniculatus9, soja10, tomate 11, batata-doce12 e muitas outras plantas 5,8. O método de injeção de hipocótilo é ineficiente e é provável que cause a morte de plantas jovens ou minúsculas de hipocótilo. Para tanto, o método foi aprimorado com o corte das raízes embrionárias, o revestimento da incisão das plântulas com A. rhizogenes e, em seguida, a colocação do hipocótilo em meio de cultura estéril para o cultivo do enraizamento13. No entanto, essas etapas são executadas em um ambiente estéril e as etapas de operação são relativamente complicadas. Em particular, as plantas compostas resultantes precisam ser transplantadas, o que aumenta a quantidade de trabalho. Em trabalhos anteriores, a transformação da raiz pilosa mediada por A. rhizogenes (ARM) em uma etapa foi estabelecida em pepino, soja, Lotus japonicus, Medicago truncatula, e tomate 2,14,15,16,17. A raiz primária e o hipocótilo parcial foram removidos, o local da incisão do hipocótilo remanescente foi revestido com A. rhizogenes transformado e, em seguida, a plântula foi plantada em vermiculita estéril úmida. Após 12 dias de cultivo, raízes pilosas foram produzidas no local da incisão. O método ARM de uma etapa é altamente eficiente e requer menos tempo para produzir raízes pilosas. O transplante após a formação de raízes pilosas também não é necessário. Como a contaminação microbiana pode ser evitada sem transplante, o método ARM em uma etapa pode ser particularmente útil no estudo de interações entre plantas e microrganismos, como fixação simbiótica de nitrogênio entre leguminosas e rizóbios, e simbioses entre plantas e fungos micorrízicos arbusculares. Neste trabalho, um protocolo detalhado de transformação de raízes pilosas mediado por A. rhizogenes em uma etapa é fornecido com exemplos de plantas compostas produzidas em soja selvagem, Solanum americanum e abóbora. Com o protocolo, os pesquisadores podem realizar sem problemas a transformação do ARM em uma etapa.
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Protocol
1. Condições de crescimento vegetal e cultivo de A. rhizogenes
- Semeadura de sementes
NOTA: Sementes silvestres de soja foram coletadas no condado de Yanggu, Liaocheng, China; sementes de S. americanum e abóbora variedade local Yinsu foram compradas em um mercado.- Coletar sementes de soja selvagem, S. americanum, e a variedade local de abóbora, semeá-las em vermiculita a uma profundidade de 1 cm e regá-las completamente. Plante 20 sementes em caixas plásticas de 8 cm x 11 cm x 9 cm. Cultivar as plantas em câmara de crescimento a 24 ± 2 °C com ciclo claro/8 h escuro de 16 h a aproximadamente 70% de umidade relativa.
OBS: Os tegumentos das sementes silvestres de soja devem ser quebrados antes da semeadura. Se a questão de pesquisa se concentrar nas interações entre plantas e microrganismos, sementes, vermiculita, caixas plásticas e água devem ser esterilizadas antes do uso. - Ativação e cultivo de A. rhizogenes K599
NOTA: A cepa K599 de A. rhizogenes tinha um vetor binário pRed13052 carregando um gene repórter fluorescente vermelho DsRed2.- Retirar a estirpe K599 de A. rhizogenes de um congelador a -80 °C e activar a bactéria em meio LB sólido (com 50 mg/L de canamicina e 50 mg/L de estreptomicina) a 28 °C durante 48 horas.
- Escolher um único clone da cepa K599 e cultivá-lo em 1 mL de meio LB contendo antibiótico líquido por 12 h.
- Espalhe uniformemente 500 μL da suspensão bacteriana em meio LB sólido contendo antibiótico, seguido de incubação a 28 °C por 24 h.
- Coletar sementes de soja selvagem, S. americanum, e a variedade local de abóbora, semeá-las em vermiculita a uma profundidade de 1 cm e regá-las completamente. Plante 20 sementes em caixas plásticas de 8 cm x 11 cm x 9 cm. Cultivar as plantas em câmara de crescimento a 24 ± 2 °C com ciclo claro/8 h escuro de 16 h a aproximadamente 70% de umidade relativa.
2. Método de transformação de raiz pilosa mediado por A. rhizogenes em uma etapa
- Incisão de hipocótilo
- Após 7 dias (definir a semeadura das sementes como dia 0), os cotilédones das plântulas acabaram de se desdobrar (Figura 1A), utilizar bisturi afiado esterilizado para cortar aproximadamente 0,5-1 cm do hipocótilo (Figura 1B). Descarte a raiz primária e parte do hipocótilo parcial.
OBS: Use o bisturi com cuidado.
- Após 7 dias (definir a semeadura das sementes como dia 0), os cotilédones das plântulas acabaram de se desdobrar (Figura 1A), utilizar bisturi afiado esterilizado para cortar aproximadamente 0,5-1 cm do hipocótilo (Figura 1B). Descarte a raiz primária e parte do hipocótilo parcial.
- Inoculação K599
- Revestir a incisão do hipocótilo com a bactéria K599 (Figura 1C).
- Plantar as mudas em vermiculita úmida (Figura 1D).
- Infectar 30 plantas de cada espécie via transformação radicular pilosa mediada por A. rhizogenes. Regue cada planta com 5 mL de suspensão bacteriana K599 ressuspensa (OD600 = 0,5-0,6) em um quarto de força (0,25x) em meio básico Gamborg B-5 (Figura 1E).
- Cubra os vasos com um saco plástico altamente transparente (Figura 1F) e coloque-os em uma câmara de crescimento.
3. Produção de raízes peludas
- Cultivar as plantas por ~12 dias após a inoculação, novas raízes pilosas serão induzidas e geradas no local da incisão. Após 15 dias, o comprimento das raízes pilosas tipicamente atinge 2-5 cm (Figura 2).
- Para determinar se as raízes pilosas produzidas são transgênicas, examine a expressão de genes repórteres dependentes do vetor transformado em K599.
- Detectar a expressão do gene repórter DsRed2 usando um sistema de imagem por quimioluminescência com luz verde de excitação a 540 nm e emissão a 600 nm (Figura 2B, Figura 2D e Figura 2F).
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Representative Results
Transformação de raiz pilosa mediada por A. rhizogenes em uma etapa altamente eficiente
Raízes pilosas foram produzidas no local da incisão do hipocótilo 12 dias após a inoculação com K599 modificado. As raízes pilosas transgênicas foram determinadas com base na expressão do gene repórter contido no vetor binário. Raízes transgênicas transformadas com o gene repórter DsRed2 de soja silvestre composta, S. americanum e abóbora foram observadas sob luz de excitação natural (Figura 2A, Figura 2C e Figura 2E) e verde (Figura 2B, Figura 2D e Figura 2F).
Quando uma planta composta continha pelo menos uma raiz transgênica, ela era designada planta composta transgênica. Dentre as 30 plantas inoculadas de cada uma das três espécies, 28 plantas de soja silvestre, 18 de S. americanum e 30 de abóbora foram compósitos transgênicos. Assim, a eficiência de transformação das raízes pilosas foi de 93,3% (soja), 60% (S. americanum) e 100% (abóbora). A comparação dos três tipos de plantas indicou que plantas com hipocótilo espesso produziram mais raízes pilosas transgênicas do que aquelas com hipocótilo fino.
Figura 1: Transformação da raiz pilosa mediada por A. rhizogenes. (A) Mudas de abóbora com sete dias de idade. (B) Porção apical de hipocótilo cortado em solução bacteriana K599. (C) Massa bacteriana K599 recobrindo a incisão do hipocótilo. (D) Explante plantado em vermiculita úmida e estéril. (E) Rega com 5 mL de solução bacteriana ressuspensa K599 em meio básico Gamborg B-5 de concentração quarto (0,25x). (F) Cobertura de saco plástico altamente transparente. Barras de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Plantas compostas obtidas a partir da transformação de raízes pilosas mediada por A. rhizogenes em uma etapa. Raízes de plantas compostas de (A,B) soja selvagem, (C,D) Solanum americanum e (E,F) abóbora sob (A,C,E) natural e (B,D,F) luz de excitação verde. Setas brancas indicam raízes pilosas transgênicas; setas pretas indicam raízes pilosas não transgênicas. Barras de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método de raiz pilosa mediada por A. rhizogenes em uma etapa é um método mais simples e eficiente para a produção de plantas compostas do que o método de injeção de hipocótilo. O método ARM de uma etapa melhora significativamente a eficiência da transformação de raízes pilosas, encurta o tempo para produzir raízes pilosas, aumenta o número de raízes pilosas e reduz a quantidade de trabalho envolvido. O protocolo de transformação aprimorado é ideal para estudos de simbioses entre leguminosas e rizóbios e entre plantas e fungos micorrízicos arbusculares. Isso pode ser atribuído ao fato de que não é necessário o transplante de plantas compostas após a produção de raízes pilosas, o que evita a contaminação com cepas não inoculadas que ocorre durante o transplante. Além disso, a eficiência de transformação foi de 100% em uma espécie vegetal (abóbora).
As razões a seguir podem explicar por que o método de MRA em uma etapa foi mais eficiente do que o método de injeção de hipocótilo na transformação de raízes pilosas. Primeiro, embora a raiz primária tenha sido removida, a transpiração das plântulas foi mantida. Assim, a tração transpiratória facilitou a invasão de células do hipocótilo por A. rhizogenes na incisão. Em segundo lugar, a área da ferida causada pela incisão do hipocótilo foi maior do que a causada pelo método de injeção do hipocótilo e, portanto, mais células vegetais foram infectadas por A. rhizogenes. Por fim, após a remoção da raiz primária, a incisão do hipocótilo foi enterrada em vermiculita escura e úmida, ambiente propício para a produção de raízes18.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Pesquisa da Universidade de Liaocheng (318012028) e pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Shandong (ZR2020MC034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
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