Summary
هنا ، نقدم البروتوكول التفصيلي لطريقة تحويل من خطوة واحدة بوساطة Agrobacterium tumefaciens لإنتاج نباتات مركبة.
Abstract
يعد إنتاج النباتات المركبة ذات الجذور المحورة وراثيا والسيقان والبراعم غير المعدلة وراثيا باستخدام تحويل الجذر المشعر بوساطة Agrobacterium rhizogenes أداة قوية لدراسة البيولوجيا المتعلقة بالجذور. يتم إنشاء تحول جذر الشعر في مجموعة واسعة من ثنائيات الفلقة وفي العديد من الأنواع أحادية الفلقة وهو مستقل تقريبا عن النمط الوراثي. الطريقة التقليدية لحقن hypocotyl مع A. rhizogenes للحصول على النباتات المركبة غير فعالة ، وتستغرق وقتا طويلا ، وشاقة ، وكثيرا ما تسبب موت نباتات hypocotyl الرقيقة والصغيرة. تم إنشاء تحويل جذر مشعر عالي الكفاءة بخطوة واحدة بوساطة A. rhizogenes سابقا ، مما يلغي الحاجة إلى الزرع بعد إنتاج جذور شعرية. في هذه الدراسة ، تمت إزالة hypocotyl الجزئي والجذر الأساسي ، وتم طلاء موقع شق hypocotyl ب A. rhizogenes ، ثم تم زرع hypocotyls في الفيرميكوليت المعقم. بعد 12 يوما من الزراعة ، توسع شق hypocotyl وتم تحفيز جذور شعر جديدة. توفر هذه المقالة البروتوكول التفصيلي لطريقة تحويل من خطوة واحدة بوساطة A. rhizogenes ، مع فعاليتها التي أثبتت فعاليتها من خلال إنتاج نباتات مركبة من فول الصويا البري ، Solanum americanum ، واليقطين.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes هي بكتيريا تربة سالبة الجرام من عائلة Rhizobiaceae. A. الجذور يمكن أن تصيب جميع ثنائيات الفلقة تقريبا ، وعدد قليل من ذوات الفلقة الواحدة ، وعاريات البذور الفردية من خلال الجروح ، مما ينتج عنه جذور مشعرة في النباتات المصابة. تحمل البكتيريا البلازميد Ri (المستحث للجذر) ، ويحمل T-DNA لبلازميد Ri جين تخليق الأوبين وجينات رول (جينات موضع الجذر). بعد دخول الحمض النووي التائي لبلازميد Ri إلى خلية نباتية ودمجه في كروموسوم مضيف ، يؤدي التعبير عن جينات rol إلى إنتاج جذور مشعرة1. يتحول ناقل التعبير الثنائي للنبات الذي يحمل الجين المستهدف إلى A. rhizogenes ، ويستخدم A. rhizogenes المحول لإصابة النبات. يمكن تحفيز الجذور المحورة وراثيا في النباتات المصابة، وإنتاج نباتات مركبة تحتوي على جذور محورة وراثيا وسيقان وبراعم غير محورة وراثيا. بشكل عام ، يمكن الحصول على مصنع مركب في غضون 14-20 يوما. A. لا يقتصر تحول الجذر المشعر بوساطة الجذور بشكل عام على النمط الوراثي في النباتات ثنائية الفلقة2. تتميز الجذور المشعرة التي تنتجها النباتات المصابة بالجذور A. بمعدل نمو سريع ووراثة مستقرة وسهولة التشغيل. يستخدم تحويل الجذر المشعر بوساطة A. rhizogenes حاليا على نطاق واسع لدراسة البيولوجيا المتعلقة بالجذور. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا استخدام تحويل الجذور المشعرة للتحقق من صحة وتحسين كفاءة تحريرالهدف لنظام CRISPR / Cas9 3،4،5 وتوطين البروتين تحت الخلوي. لذلك ، يعد تحويل الجذر المشعر أداة مهمة في البحث عن وظيفة الجينات النباتية ، والهندسة الأيضية ، والتفاعلات بين الجذور والكائنات الحية الدقيقة في الجذور6،7،8.
تم إنتاج النباتات المركبة التي تحتوي على جذور محورة وراثيا تم الحصول عليها من خلال تحويل الجذر المشعر على نطاق واسع في النباتات ثنائية الفلقة ، وخاصة في البقوليات. تم استخدام الطريقة التقليدية لحقن hypocotyl مع A. rhizogenes لإنتاج مركب لوتس كورنيكولاتوس9 ، فول الصويا 10 ، الطماطم11 ، البطاطا الحلوة12 ، والعديد من النباتات الأخرى 5,8. طريقة حقن hypocotyl غير فعالة ومن المحتمل أن تتسبب في موت نباتات hypocotyl الصغيرة أو الصغيرة. لذلك ، تم تحسين الطريقة عن طريق قطع الجذور الجنينية ، وطلاء شق الشتلات ب A. rhizogenes ، ثم وضع hypocotyl على وسط استزراع معقم لزراعةالجذور 13. ومع ذلك ، يتم تنفيذ هذه الخطوات في بيئة معقمة ، وخطوات العملية مرهقة نسبيا. على وجه الخصوص ، يجب زرع النباتات المركبة الناتجة ، مما يزيد من حجم العمل. في العمل السابق ، تم إنشاء تحويل جذر مشعر بخطوة واحدة A. rhizogenes بوساطة (ARM) في الخيار وفول الصويا واللوتس جابونيكوس و Medicago truncatula والطماطم2،14،15،16،17. تمت إزالة الجذر الأساسي والهيبوكوتيل الجزئي ، وتم طلاء موقع شق hypocotyl المتبقي بجذور A. المحولة ، ثم تم زرع الشتلات في الفيرميكوليت المعقم الرطب. بعد 12 يوما من الزراعة ، تم إنتاج جذور مشعرة في موقع الشق. طريقة ARM ذات الخطوة الواحدة عالية الكفاءة وتتطلب وقتا أقل لإنتاج جذور مشعرة. الزرع بعد تشكيل جذور الشعر ليست ضرورية أيضا. نظرا لأنه يمكن تجنب التلوث الميكروبي دون زرع ، يمكن أن تكون طريقة ARM ذات الخطوة الواحدة مفيدة بشكل خاص عند دراسة التفاعلات بين النباتات والكائنات الحية الدقيقة ، مثل تثبيت النيتروجين التكافلي بين النباتات البقولية و Rhizobia ، والتكافل بين النباتات والفطريات الفطرية الشجرية. في هذه الورقة ، تم توفير بروتوكول مفصل لتحويل الجذر المشعر بوساطة A. rhizogenes بخطوة واحدة مع أمثلة للنباتات المركبة المنتجة في فول الصويا البري ، Solanum americanum ، واليقطين. باستخدام البروتوكول ، يمكن للباحثين إجراء تحويل ARM بخطوة واحدة بسلاسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ظروف نمو النبات وثقافة A. الجذور
- بذر البذور
ملاحظة: تم جمع بذور فول الصويا البري في مقاطعة يانجو ، لياوتشنغ ، الصين. تم شراء بذور S. americanum واليقطين المحلي Yinsu من السوق.- جمع بذور فول الصويا البري ، S. americanum ، والتنوع المحلي من اليقطين ، وزرعها في الفيرميكوليت على عمق 1 سم ، وسقيها جيدا. زرع 20 بذرة في صناديق بلاستيكية 8 سم × 11 سم × 9 سم. قم بزراعة النباتات في غرفة النمو عند 24 ± 2 درجة مئوية مع دورة مظلمة لمدة 16 ساعة / 8 ساعات عند رطوبة نسبية بنسبة 70٪ تقريبا.
ملاحظة: يجب كسر معاطف بذور فول الصويا البري قبل البذر. إذا كان سؤال البحث يركز على التفاعلات بين النباتات والكائنات الحية الدقيقة ، فيجب تعقيم البذور والفيرميكوليت والصناديق البلاستيكية والماء قبل الاستخدام. - تفعيل وثقافة A. جذور K599
ملاحظة: كان لسلالة A. rhizogenes K599 متجه ثنائي واحد pRed13052 يحمل جين مراسل الفلورسنت الأحمر DsRed2.- قم بإزالة سلالة A. rhizogenes K599 من الفريزر -80 درجة مئوية ، وقم بتنشيط البكتيريا على وسط LB صلب (مع 50 مجم / لتر كاناميسين و 50 مجم / لتر ستربتومايسين) عند 28 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- اختر نسخة واحدة من سلالة K599 واستزرعها في 1 مل من وسط LB المحتوي على المضادات الحيوية السائلة لمدة 12 ساعة.
- يوزع بالتساوي 500 ميكرولتر من المعلق البكتيري على وسط LB صلب يحتوي على مضاد حيوي ، يليه الحضانة عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- جمع بذور فول الصويا البري ، S. americanum ، والتنوع المحلي من اليقطين ، وزرعها في الفيرميكوليت على عمق 1 سم ، وسقيها جيدا. زرع 20 بذرة في صناديق بلاستيكية 8 سم × 11 سم × 9 سم. قم بزراعة النباتات في غرفة النمو عند 24 ± 2 درجة مئوية مع دورة مظلمة لمدة 16 ساعة / 8 ساعات عند رطوبة نسبية بنسبة 70٪ تقريبا.
2. خطوة واحدة A. طريقة تحويل الجذر المشعر بوساطة الجذور
- شق هيبوكوتيل
- بعد 7 أيام (حدد بذر البذور في اليوم 0) ، تكشفت نباتات الشتلات للتو (الشكل 1 أ) ، استخدم مشرطا معقم وحادا لقطع حوالي 0.5-1 سم من hypocotyl (الشكل 1 ب). تجاهل الجذر الأساسي وبعض hypocotyl الجزئي.
ملاحظة: استخدم المشرط بعناية.
- بعد 7 أيام (حدد بذر البذور في اليوم 0) ، تكشفت نباتات الشتلات للتو (الشكل 1 أ) ، استخدم مشرطا معقم وحادا لقطع حوالي 0.5-1 سم من hypocotyl (الشكل 1 ب). تجاهل الجذر الأساسي وبعض hypocotyl الجزئي.
- تلقيح K599
- قم بتغطية شق hypocotyl ببكتيريا K599 (الشكل 1C).
- زرع الشتلات في الفيرميكوليت الرطب (الشكل 1 د).
- تصيب 30 نباتا من كل نوع عن طريق تحويل جذر الشعر بوساطة A. الجذور. سقي كل نبات ب 5 مل من المعلق البكتيري K599 المعاد تعليقه (OD600 = 0.5-0.6) في ربع قوة (0.25x) وسط Gamborg B-5 الأساسي (الشكل 1E).
- قم بتغطية الأواني بكيس بلاستيكي شفاف للغاية (الشكل 1F) وضعها في غرفة النمو.
3. إنتاج الجذر شعر
- قم بزراعة النباتات لمدة ~ 12 يوما بعد التلقيح ، وسيتم تحفيز جذور شعر جديدة وتوليدها في موقع الشق. بعد 15 يوما ، تصل أطوال جذور الشعر عادة إلى 2-5 سم (الشكل 2).
- لتحديد ما إذا كانت الجذور المشعرة المنتجة معدلة وراثيا ، افحص التعبير عن جينات المراسل التي تعتمد على الناقل المحول في K599.
- اكتشف تعبير جين المراسل DsRed2 باستخدام نظام تصوير التلألؤ الكيميائي مع ضوء إثارة أخضر عند 540 نانومتر وانبعاث عند 600 نانومتر (الشكل 2B والشكل 2D والشكل 2F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كفاءة عالية من خطوة واحدة A. تحويل الجذر المشعر بوساطة الجذور
تم إنتاج جذور مشعرة في موقع شق hypocotyl بعد 12 يوما من التلقيح باستخدام K599 الهندسي. تم تحديد جذور الشعر المعدلة وراثيا بناء على تعبير الجين المراسل الموجود في الناقل الثنائي. لوحظت جذور محورة وراثيا تحولت مع الجين المراسل DsRed2 من فول الصويا البري المركب ، S. americanum ، واليقطين تحت الطبيعي (الشكل 2A ، الشكل 2C ، والشكل 2E) وضوء الإثارة الأخضر (الشكل 2B ، الشكل 2D ، والشكل 2F).
عندما يحتوي النبات المركب على جذر وراثي واحد على الأقل ، تم تعيينه نباتا مركبا محورا وراثيا. من بين 30 نباتا ملقحا لكل نوع من الأنواع الثلاثة ، كان 28 فول الصويا البري و 18 S. Americanum و 30 نبات اليقطين مركبات معدلة وراثيا. وبالتالي ، كانت كفاءة تحويل الجذر المشعر 93.3 ٪ (فول الصويا) ، 60 ٪ (S. americanum) ، و 100 ٪ (اليقطين). أشارت مقارنة بين الأنواع الثلاثة من النباتات إلى أن النباتات ذات الهيبوكوتيل السميكة أنتجت جذورا مشعرة معدلة وراثيا أكثر من تلك التي تحتوي على hypocotyls رقيقة.
الشكل 1: خطوة واحدة A. تحويل الجذر المشعر بوساطة الجذور الريزوجينية. أ: شتلات اليقطين البالغة من العمر سبعة أيام. (ب) الجزء القمي من قطع hypocotyl في محلول بكتيري K599. (ج) الكتلة البكتيرية K599 تغطي شق hypocotyl. د: زرع نبات في الفيرميكوليت الرطب المعقم. (ه) الري ب 5 مل من المحلول البكتيري K599 المعاد تعليقه في ربع قوة (0.25x) وسط Gamborg B-5 الأساسي. (و) غطاء كيس بلاستيكي شفاف للغاية. أشرطة المقياس = 1 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: النباتات المركبة التي تم الحصول عليها من خطوة واحدة A. تحويل الجذر المشعر بوساطة الجذور. جذور النباتات المركبة من (A,B) فول الصويا البري، (C,D) Solanum americanum، و (E,F) اليقطين تحت (A,C,E) الطبيعي و (B,D,F) ضوء الإثارة الأخضر. تشير الأسهم البيضاء إلى جذور الشعر المعدلة وراثيا. تشير الأسهم السوداء إلى جذور شعر غير معدلة وراثيا. أشرطة المقياس = 1 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة الجذر المشعر بوساطة A. rhizogenes ذات الخطوة الواحدة هي طريقة أبسط وأكثر كفاءة لإنتاج النباتات المركبة من طريقة حقن hypocotyl. تعمل طريقة ARM ذات الخطوة الواحدة على تحسين كفاءة تحويل جذر الشعر بشكل كبير ، وتقصير الوقت اللازم لإنتاج جذور الشعر ، وزيادة عدد الجذور المشعرة ، وتقليل مقدار العمل المتضمن. بروتوكول التحول المحسن هو الأمثل للدراسات على التكافل بين النباتات البقولية والجذور وبين النباتات والفطريات الجذرية الشجرية. يمكن أن يعزى ذلك إلى حقيقة أن زرع النباتات المركبة بعد إنتاج جذور الشعر غير مطلوب ، مما يتجنب التلوث بالسلالات غير الملقحة التي تحدث أثناء الزرع. علاوة على ذلك ، كانت كفاءة التحويل 100٪ في نوع نباتي واحد (اليقطين).
قد تفسر الأسباب التالية لماذا كانت طريقة ARM ذات الخطوة الواحدة أكثر كفاءة من طريقة حقن hypocotyl في تحويل جذر الشعر. أولا ، على الرغم من إزالة الجذر الأساسي ، تم الحفاظ على نتح الشتلات. وهكذا ، سهل سحب النتح غزو A. rhizogenes لخلايا hypocotyl في الشق. ثانيا ، كانت منطقة الجرح الناتجة عن شق hypocotyl أكبر من تلك التي تسببها طريقة حقن hypocotyl ، وبالتالي ، أصيب المزيد من الخلايا النباتية ب A. rhizogenes. أخيرا ، بعد إزالة الجذر الأساسي ، تم دفن شق hypocotyl في الفيرميكوليت الداكن والرطب ، وهي بيئة مواتية لإنتاج الجذور18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل صندوق الأبحاث بجامعة لياوتشنغ (318012028) ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة شاندونغ (ZR2020MC034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).
- Du, H., et al. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).
- Nguyen, D. V., et al. An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.). Frontiers in Plant Science. 12, 770062 (2022).
- Liu, S., et al. AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 952428 (2022).
- Irigoyen, S., et al. Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp. Nature Communications. 11 (1), 5802 (2020).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Stougaard, J. Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation. Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Yu, Y., et al. Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots. Horticulture Research. 7, 131 (2020).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).
- Fan, Y., et al. One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. BMC Plant Biology. 20 (1), 208 (2020).
- Fan, Y., et al. Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Methods. 16, 94 (2020).
- Wang, X., et al. Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae. Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).
- Wang, X., et al. Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 1104905 (2023).
- Li, Q. Q., et al. Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).
