Summary
Ici, nous fournissons le protocole détaillé d’une méthode de transformation en une étape médiée par Agrobacterium tumefaciens pour produire des plantes composites.
Abstract
La production de plantes composites avec des racines transgéniques et des tiges et bourgeons non transgéniques en utilisant la transformation racinaire poilue médiée par Agrobacterium rhizogenes est un outil puissant pour étudier la biologie liée aux racines. La transformation des racines velues est établie dans une large gamme de dicotylédons et chez plusieurs espèces de monocotylédones et est presque indépendante du génotype. La méthode traditionnelle d’injection d’hypocotyle avec A. rhizogenes pour obtenir des plantes composites est inefficace, longue, laborieuse et provoque fréquemment la mort de plantes hypocotyles tendres et minuscules. Une transformation très efficace des racines velues en une étape médiée par A. rhizogenes a été établie précédemment, ce qui élimine le besoin de transplantation après la production de racines velues. Dans cette étude, un hypocotyle partiel et une racine primaire ont été enlevés, le site d’incision de l’hypocotyle a été recouvert d’A. rhizogenes, puis les hypocotyles ont été plantés dans de la vermiculite stérile. Après 12 jours de culture, l’incision de l’hypocotyle s’est élargie et de nouvelles racines velues ont été induites. Cet article fournit le protocole détaillé d’une méthode de transformation en une étape médiée par A. rhizogenes, dont l’efficacité a été démontrée par la production de plantes composites de soja sauvage, de Solanum americanum et de citrouille.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes est une bactérie du sol à Gram négatif de la famille des Rhizobiaceae. A. rhizogenes peut infecter presque tous les dicotylédones, quelques monocotylédones et les gymnospermes individuels par des plaies, produisant des racines velues chez les plantes infectées. La bactérie porte le plasmide Ri (inducteur racinaire), et l’ADN-T du plasmide Ri porte le gène de synthèse opine et les gènes rol (gènes du locus racinaire). Après que l’ADN-T du plasmide Ri pénètre dans une cellule végétale et est intégré dans un chromosome hôte, l’expression des gènes rol induit la production de racines velues1. Un vecteur d’expression binaire végétale portant un gène cible est transformé en A. rhizogenes, et l’A. rhizogenes transformé est utilisé pour infecter une plante. Les racines transgéniques peuvent être induites dans les plantes infectées, produisant des plantes composites contenant des racines transgéniques et des tiges et bourgeons non transgéniques. Généralement, une plante composite peut être obtenue dans les 14-20 jours. La transformation racinaire poilue médiée par A. rhizogenes n’est généralement pas limitée par le génotype chez les plantes dicotylédones2. Les racines velues produites par les plantes infectées par A. rhizogenes se caractérisent par un taux de croissance rapide, un héritage stable et une utilisation facile. La transformation racinaire velue médiée par A. rhizogenes est actuellement largement utilisée pour étudier la biologie liée aux racines. En outre, la transformation des racines velues peut également être utilisée pour valider et optimiser l’efficacité de l’édition de la cible du système CRISPR / Cas9 3,4,5 et de la localisation subcellulaire des protéines. Par conséquent, la transformation des racines velues est un outil important dans la recherche sur la fonction des gènes des plantes, l’ingénierie métabolique et les interactions entre les racines et les microorganismes de la rhizosphère 6,7,8.
Les plantes composites contenant des racines transgéniques obtenues par transformation de racines velues ont été largement produites chez les plantes dicotylédones, en particulier dans les légumineuses. La méthode traditionnelle d’injection de l’hypocotyle avec A. rhizogenes a été utilisée pour produire Lotus corniculatus9, soja 10, tomate11, patates douces12 et de nombreuses autres plantes 5,8. La méthode d’injection d’hypocotyle est inefficace et est susceptible de causer la mort de plantes hypocotyles jeunes ou minuscules. Par conséquent, la méthode a été améliorée en coupant les racines embryonnaires, en recouvrant l’incision des plantules d’A. rhizogenes, puis en plaçant l’hypocotyle sur un milieu de culture stérile pour la culture enracinaire13. Cependant, ces étapes sont effectuées dans un environnement stérile et les étapes de l’opération sont relativement lourdes. En particulier, les plantes composites résultantes doivent être transplantées, ce qui augmente la quantité de travail. Dans des travaux antérieurs, une transformation racinaire velue en une étape médiée par A. rhizogenes (ARM) a été établie dans le concombre, le soja, Lotus japonicus, Medicago truncatula et la tomate 2,14,15,16,17. La racine primaire et l’hypocotyle partiel ont été enlevés, le site d’incision de l’hypocotyle restant a été recouvert d’A. rhizogenes transformé, et le semis a ensuite été planté dans de la vermiculite humide stérile. Après 12 jours de culture, des racines poilues ont été produites sur le site d’incision. La méthode ARM en une étape est très efficace et nécessite moins de temps pour produire des racines velues. Le repiquage après la formation de racines poilues n’est pas non plus nécessaire. Parce que la contamination microbienne peut être évitée sans transplantation, la méthode ARM en une étape peut être particulièrement utile pour étudier les interactions entre les plantes et les micro-organismes, telles que la fixation symbiotique de l’azote entre les légumineuses et Rhizobia, et les symbioses entre les plantes et les champignons mycorhiziens arbusculaires. Dans cet article, un protocole détaillé de transformation des racines velues médiée par A. rhizogenes en une étape est fourni avec des exemples de plantes composites produites dans le soja sauvage, Solanum americanum et la citrouille. Avec le protocole, les chercheurs peuvent effectuer en douceur la transformation ARM en une étape.
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Protocol
1. Conditions de croissance des plantes et culture d’A. rhizogenes
- Semer
NOTE: Des semences de soja sauvage ont été récoltées dans le comté de Yanggu, Liaocheng, Chine; des graines de S. americanum et de la variété locale de citrouille Yinsu ont été achetées sur un marché.- Récoltez des graines de soja sauvage, de S. americanum et de la variété locale de citrouille, semez-les dans de la vermiculite à une profondeur de 1 cm et arrosez-les soigneusement. Plantez 20 graines dans des boîtes en plastique de 8 cm x 11 cm x 9 cm. Cultivez les plantes dans une chambre de croissance à 24 ± 2 °C avec un cycle de lumière de 16 h / 8 heures d’obscurité à environ 70% d’humidité relative.
REMARQUE : Les couches de graines de soja sauvage doivent être brisées avant le semis. Si la question de recherche porte sur les interactions entre les plantes et les microorganismes, les graines, la vermiculite, les boîtes en plastique et l’eau doivent être stérilisées avant utilisation. - Activation et culture de A. rhizogenes K599
NOTE: La souche A. rhizogenes K599 avait un vecteur binaire pRed13052 portant un gène rapporteur fluorescent rouge DsRed2.- Retirer la souche K599 d’A. rhizogenes d’un congélateur à -80 °C et activer la bactérie sur un milieu LB solide (avec 50 mg/L de kanamycine et 50 mg/L de streptomycine) à 28 °C pendant 48 h.
- Prélever un seul clone de la souche K599 et le cultiver dans 1 mL de milieu LB liquide contenant des antibiotiques pendant 12 h.
- Répartir uniformément 500 μL de la suspension bactérienne sur un milieu LB solide contenant des antibiotiques, suivi d’une incubation à 28 °C pendant 24 h.
- Récoltez des graines de soja sauvage, de S. americanum et de la variété locale de citrouille, semez-les dans de la vermiculite à une profondeur de 1 cm et arrosez-les soigneusement. Plantez 20 graines dans des boîtes en plastique de 8 cm x 11 cm x 9 cm. Cultivez les plantes dans une chambre de croissance à 24 ± 2 °C avec un cycle de lumière de 16 h / 8 heures d’obscurité à environ 70% d’humidité relative.
2. Méthode de transformation des racines velues médiée par A. rhizogenes en une étape
- Incision de l’hypocotyle
- Après 7 jours (définissez le semis des graines comme le jour 0), les cotylédons de semis viennent de se déplier (Figure 1A), utilisez un scalpel stérilisé et pointu pour couper environ 0,5 à 1 cm de l’hypocotyle (Figure 1B). Jetez la racine primaire et une partie de l’hypocotyle partiel.
REMARQUE: Utilisez le scalpel avec précaution.
- Après 7 jours (définissez le semis des graines comme le jour 0), les cotylédons de semis viennent de se déplier (Figure 1A), utilisez un scalpel stérilisé et pointu pour couper environ 0,5 à 1 cm de l’hypocotyle (Figure 1B). Jetez la racine primaire et une partie de l’hypocotyle partiel.
- Inoculation K599
- Enduire l’incision hypocotyle de la bactérie K599 (figure 1C).
- Plantez les semis dans de la vermiculite humide (figure 1D).
- Infecter 30 plantes de chaque espèce par transformation racinaire velue médiée par A. rhizogenes. Arrosez chaque plante avec 5 mL de suspension bactérienne K599 remise en suspension (DO600 = 0,5-0,6) dans un milieu basique Gamborg B-5 d’un quart de concentration (0,25x) (figure 1E).
- Couvrir les pots d’un sac en plastique hautement transparent (figure 1F) et les placer dans une chambre de croissance.
3. Production de racines velues
- Cultivez les plantes pendant ~ 12 jours après l’inoculation, de nouvelles racines velues seront induites et générées au site d’incision. Après 15 jours, la longueur des racines velues atteint généralement 2 à 5 cm (Figure 2).
- Pour déterminer si les racines velues produites sont transgéniques, examiner l’expression des gènes rapporteurs dépendant du vecteur transformé dans K599.
- Détecter l’expression du gène rapporteur DsRed2 à l’aide d’un système d’imagerie par chimiluminescence avec lumière d’excitation verte à 540 nm et émission à 600 nm (Figure 2B, Figure 2D et Figure 2F).
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Representative Results
Transformation très efficace des racines velues en une étape médiée par A. rhizogenes
Des racines velues ont été produites au site d’incision de l’hypocotyle 12 jours après l’inoculation avec du K599 modifié. Les racines velues transgéniques ont été déterminées en fonction de l’expression du gène rapporteur contenu dans le vecteur binaire. Des racines transgéniques transformées avec le gène rapporteur DsRed2 du soja sauvage composite, de S. americanum et de la citrouille ont été observées sous lumière d’excitation naturelle (figure 2A, figure 2C et figure 2E) et verte (figure 2B, figure 2D et figure 2F).
Lorsqu’une plante composite contenait au moins une racine transgénique, elle était désignée plante composite transgénique. Parmi les 30 plantes inoculées de chacune des trois espèces, 28 plants de soja sauvage, 18 plants de S. americanum et 30 plants de citrouille étaient des composites transgéniques. Ainsi, l’efficacité de transformation des racines velues était de 93,3 % (soja), 60 % (S. americanum) et 100 % (citrouille). Une comparaison des trois types de plantes a indiqué que les plantes à hypocotyles épais produisaient plus de racines velues transgéniques que celles à hypocotyles minces.
Figure 1 : Transformation des racines velues médiée par A. rhizogenes en une étape. (A) Plantules de citrouille âgées de sept jours. (B) Partie apicale de l’hypocotyle coupée dans une solution bactérienne K599. (C) K599 masse bactérienne recouvrant l’incision hypocotyle. (D) Explant planté dans de la vermiculite humide et stérile. (E) Arrosage avec 5 mL de solution bactérienne K599 remise en suspension dans un milieu basique Gamborg B-5 quart de concentration (0,25x). (F) Revêtement de sac en plastique hautement transparent. Barres d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Plantes composites obtenues à partir d’une transformation racinaire velue induite par A. rhizogenes en une étape. Racines de plantes composites de (A,B) soja sauvage, (C,D) Solanum americanum et (E,F) citrouille sous (A,C,E) lumière d’excitation naturelle et (B,D,F) verte. Les flèches blanches indiquent des racines velues transgéniques; Les flèches noires indiquent des racines velues non transgéniques. Barres d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode à racine velue médiée par A. rhizogenes en une étape est une méthode plus simple et plus efficace pour produire des plantes composites que la méthode d’injection d’hypocotyle. La méthode ARM en une étape améliore considérablement l’efficacité de la transformation des racines velues, raccourcit le temps de production des racines velues, augmente le nombre de racines velues et réduit la quantité de travail impliquée. Le protocole de transformation amélioré est optimal pour les études sur les symbioses entre les légumineuses et les rhizobiums et entre les plantes et les champignons mycorhiziens arbusculaires. Cela peut être attribué au fait que la transplantation de plantes composites après la production de racines velues n’est pas nécessaire, ce qui évite la contamination par des souches non inoculées qui se produit pendant le repiquage. De plus, l’efficacité de transformation était de 100% pour une espèce végétale (citrouille).
Les raisons suivantes pourraient expliquer pourquoi la méthode ARM en une étape était plus efficace que la méthode d’injection d’hypocotyle dans la transformation des racines velues. Tout d’abord, bien que la racine primaire ait été enlevée, la transpiration des plantules a été maintenue. Ainsi, la traction de transpiration a facilité l’invasion des cellules hypocotyles par A. rhizogenes dans l’incision. Deuxièmement, la zone de la plaie causée par l’incision de l’hypocotyle était plus grande que celle causée par la méthode d’injection d’hypocotyle et, par conséquent, plus de cellules végétales ont été infectées par A. rhizogenes. Enfin, après avoir enlevé la racine primaire, l’incision hypocotyle a été enterrée dans de la vermiculite sombre et humide, ce qui constitue un environnement favorable à la production de racines18.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Fonds de recherche de l’Université de Liaocheng (318012028) et la Fondation des sciences naturelles de la province du Shandong (ZR2020MC034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
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