Summary
В этой статье мы приводим подробный протокол одностадийного метода трансформации, опосредованного Agrobacterium tumefaciens , для получения сложных растений.
Abstract
Получение сложных растений с трансгенными корнями и нетрансгенными стеблями и почками с использованием опосредованной Agrobacterium rhizogenes волосистой трансформации корня является мощным инструментом для изучения биологии корней. Волосистая корневая трансформация устанавливается у широкого круга двудольных и у нескольких однодольных видов и почти не зависит от генотипа. Традиционный метод инъекции гипокотила с A. rhizogenes для получения сложных растений является неэффективным, трудоемким, трудоемким и часто приводит к гибели нежных и крошечных растений гипокотиля. Ранее была установлена высокоэффективная одноступенчатая волосистая корневая трансформация, опосредованная A. rhizogenes , которая устраняет необходимость пересадки после образования волосистых корней. В этом исследовании частичный гипокотиль и первичный корень были удалены, место разреза гипокотиль было покрыто A. rhizogenes, а затем гипокотиль был посажен в стерильный вермикулит. Через 12 дней культивирования разрез гипокотиля расширился и были индуцированы новые волосистые корни. В данной статье представлен подробный протокол одностадийного метода трансформации, опосредованного A. rhizogenes, эффективность которого продемонстрирована на производстве композиционных растений дикой сои, Solanum americanum и тыквы.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes — грамотрицательная почвенная бактерия из семейства Rhizobiaceae. A. rhizogenes может инфицировать почти все двудольные, несколько однодольных и отдельные голосеменные через раны, образуя волосистые корни у зараженных растений. Бактерия несет плазмиду Ri (индуцирующую корень), а Т-ДНК плазмиды Ri несет ген синтеза опина и гены rol (гены корневого локуса). После того, как Т-ДНК плазмиды Ri проникает в растительную клетку и интегрируется в хромосому хозяина, экспрессия генов rol индуцирует образование волосистых корней1. Бинарный вектор экспрессии растений, несущий ген-мишень, трансформируется в A. rhizogenes, а трансформированный A. rhizogenes используется для заражения растения. Трансгенные корни могут быть индуцированы у зараженных растений, производя сложные растения, содержащие трансгенные корни и нетрансгенные стебли и почки. Как правило, композитное растение можно получить в течение 14-20 дней. Волосистая трансформация корней, опосредованная A. rhizogenes, как правило, не ограничена генотипом у двудольных растений2. Волосистые корни, образующиеся у растений, зараженных A. rhizogenes, характеризуются высокой скоростью роста, стабильным наследованием и простотой в эксплуатации. Волосистая корневая трансформация, опосредованная A. rhizogenes, в настоящее время широко используется для изучения корневой биологии. Кроме того, трансформация волосистых корней также может быть использована для проверки и оптимизации эффективности редактирования мишеней системы CRISPR/Cas9 3,4,5 и субклеточной локализации белка. Таким образом, волосистая корневая трансформация является важным инструментом в исследованиях функции генов растений, метаболической инженерии и взаимодействия между корнями и ризосферными микроорганизмами 6,7,8.
Сложные растения, содержащие трансгенные корни, полученные путем волосистой трансформации корней, широко размножаются у двудольных растений, особенно у бобовых. Традиционный метод введения гипокотиля с A. rhizogenes был использован для получения сложного лотоса рогового9, сои10, томата 11, сладкого картофеля12 и многих других растений 5,8. Метод введения гипокотиля неэффективен и может привести к гибели молодых или крошечных растений гипокотиля. Поэтому способ совершенствовали путем отрезания зародышевых корней, покрытия надреза сеянца A. rhizogenes, а затем помещения гипокотиля на стерильную культуральную среду для укоренения13. Однако эти этапы выполняются в стерильной среде, и этапы операции относительно громоздки. В частности, получившиеся композитные растения нужно пересаживать, что увеличивает объем работ. В предыдущей работе была установлена одностадийная волосистая корневая трансформация A. rhizogenes-опосредованного (ARM) у огурца, сои, Lotus japonicus, Medicago truncatula и томата 2,14,15,16,17. Первичный корень и частичный гипокотиль удаляли, место надреза оставшегося гипокотила покрывали трансформированным A. rhizogenes, а затем саженец высаживали во влажный стерильный вермикулит. Через 12 дней культивирования на месте надреза образовались волосистые корни. Одноэтапный метод ARM отличается высокой эффективностью и требует меньше времени для образования волосистых корней. Пересаживать после образования волосистых корней также не нужно. Поскольку микробного загрязнения можно избежать без трансплантации, одноэтапный метод ARM может быть особенно полезен при изучении взаимодействий между растениями и микроорганизмами, таких как симбиотическая фиксация азота между бобовыми растениями и ризобиями, а также симбиозы между растениями и арбускулярными микоризными грибами. В данной работе представлен подробный одноэтапный протокол трансформации волосистого корня A. rhizogenes, опосредованный A. rhizogenes, с примерами сложных растений, полученных из дикой сои, Solanum americanum и тыквы. С помощью этого протокола исследователи могут плавно выполнять одноэтапное преобразование ARM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Условия произрастания растений и культура A. rhizogenes
- Посев семян
ПРИМЕЧАНИЕ: Семена дикой сои были собраны в уезде Янгу, Ляочэн, Китай; На рынке были куплены семена S. americanum и тыквы местного сорта Yinsu.- Соберите семена дикой сои, S. americanum, местного сорта тыквы, посейте их в вермикулит на глубину 1 см и тщательно полейте. Посадите 20 семян в пластиковые коробки размером 8 см х 11 см х 9 см. Культивируйте растения в ростовой камере при температуре 24 ± 2 °C с циклом 16 часов света и 8 часов темноты при относительной влажности воздуха около 70%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оболочки семян дикой сои должны быть разбиты перед посевом. Если исследовательский вопрос сосредоточен на взаимодействии между растениями и микроорганизмами, семена, вермикулит, пластиковые коробки и вода должны быть стерилизованы перед использованием. - Активация и культивирование A. rhizogenes K599
ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм A. rhizogenes K599 имел один бинарный вектор pRed13052 , несущий красный флуоресцентный репортерный ген DsRed2.- Извлеките штамм A. rhizogenes K599 из морозильной камеры при температуре -80 °C и активируйте бактерии на твердой среде LB (с 50 мг/л канамицина и 50 мг/л стрептомицина) при 28 °C в течение 48 ч.
- Выберут один клон штамма К599 и культивируют его в 1 мл жидкой среды LB, содержащей антибиотик, в течение 12 ч.
- Равномерно распределить 500 мкл бактериальной суспензии на твердой среде, содержащей антибиотик, с последующей инкубацией при 28 °C в течение 24 ч.
- Соберите семена дикой сои, S. americanum, местного сорта тыквы, посейте их в вермикулит на глубину 1 см и тщательно полейте. Посадите 20 семян в пластиковые коробки размером 8 см х 11 см х 9 см. Культивируйте растения в ростовой камере при температуре 24 ± 2 °C с циклом 16 часов света и 8 часов темноты при относительной влажности воздуха около 70%.
2. Одностадийный метод трансформации волосистого корня A. rhizogenes-опосредованного
- Разрез гипокотиля
- Через 7 дней (определите посев семян как день 0), семядоли проростков только что развернулись (Рисунок 1А), стерилизованным острым скальпелем срежьте примерно 0,5-1 см гипокотиля (Рисунок 1Б). Отбросьте первичный корень и часть частичного гипокотиля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте скальпель с осторожностью.
- Через 7 дней (определите посев семян как день 0), семядоли проростков только что развернулись (Рисунок 1А), стерилизованным острым скальпелем срежьте примерно 0,5-1 см гипокотиля (Рисунок 1Б). Отбросьте первичный корень и часть частичного гипокотиля.
- Инокуляция К599
- Обмажьте разрез гипокотиля бактериями K599 (рис. 1C).
- Высадите рассаду во влажный вермикулит (рисунок 1D).
- Заразить 30 растений каждого вида через опосредованную A. rhizogenes трансформацию волосистых корней. Полейте каждое растение 5 мл ресуспендированной бактериальной суспензии К599 (OD600 = 0,5-0,6) в четверти крепости (0,25х) основной среды Гамборг Б-5 (рис. 1Е).
- Накройте горшки прозрачным полиэтиленовым пакетом (рис. 1F) и поместите их в камеру для роста.
3. Образование волосистых корней
- Выращивайте растения в течение ~12 дней после инокуляции, новые волосистые корни будут индуцированы и сформированы в месте разреза. Через 15 дней длина волосистых корней обычно достигает 2-5 см (Рисунок 2).
- Чтобы определить, являются ли полученные волосистые корни трансгенными, изучите экспрессию репортерных генов, зависящих от трансформированного вектора в K599.
- Детектируйте экспрессию репортерного гена DsRed2 с помощью системы хемилюминесцентной визуализации с зеленым возбуждающим светом на длине волны 540 нм и излучением на длине волны 600 нм (рис. 2B, рис. 2D и рис. 2F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Высокоэффективная одностадийная волосистая корневая трансформация A. rhizogenes, опосредованная
Волосистые корни образовывались в месте разреза гипокотиля через 12 дней после инокуляции инженерным препаратом K599. Трансгенные волосистые корни определяли на основе экспрессии репортерного гена, содержащегося в бинарном векторе. Трансгенные корни, трансформированные репортерным геном DsRed2 составной дикой сои, S. americanum и тыквы, наблюдались при естественном (рис. 2A, рис. 2C и рис. 2E) и зеленом возбуждающем свете (рис. 2B, рис. 2D, рис . 2F).
Если сложное растение содержало хотя бы один трансгенный корень, оно обозначалось как трансгенное сложное растение. Среди 30 инокулированных растений каждого из трех видов 28 диких соевых бобов, 18 растений S. americanum и 30 растений тыквы были трансгенными композитами. Таким образом, эффективность трансформации волосистого корня составила 93,3% (соя), 60% (S. americanum) и 100% (тыква). Сравнение трех типов растений показало, что растения с толстыми гипокотилями дают больше трансгенных волосистых корней, чем растения с тонкими гипокотилями.
Рисунок 1: Одностадийная волосатая корневая трансформация A. rhizogenes. (А) Семидневные саженцы тыквы. (Б) Верхушечная часть гипокотила, срезанная в бактериальном растворе К599. (C) Бактериальная масса K599, покрывающая разрез гипокотиля. (D) Эксплантировать посаженный во влажный, стерильный вермикулит. (E) Полив 5 мл ресуспендированного бактериального раствора K599 в четверти концентрации (0,25x) основной среды Gamborg B-5. (F) Высокопрозрачное покрытие из пластикового пакета. Масштабные линейки = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сложные растения, полученные в результате одностадийной трансформации волосистого корня A. rhizogenes. Корни составных растений (A,B) дикой сои, (C,D) Solanum americanum и (E,F) тыквы при (A,C,E) естественном и (B,D,F) зеленом возбуждающем свете. Белые стрелки указывают на трансгенные волосистые корни; Черные стрелки указывают на нетрансгенные волосистые корни. Масштабные линейки = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одностадийный метод волосистого корня, опосредованный A. rhizogenes, является более простым и эффективным методом получения сложных растений, чем метод гипокотильной инъекции. Одноэтапный метод ARM значительно повышает эффективность трансформации волосистых корней, сокращает время образования волосистых корней, увеличивает количество волосистых корней и уменьшает объем работы. Усовершенствованный протокол трансформации оптимален для изучения симбиозов между бобовыми растениями и ризобиями, а также между растениями и арбускулярными микоризными грибами. Это можно объяснить тем, что пересадка сложносложных растений после образования волосистых корней не требуется, что позволяет избежать заражения непривитыми штаммами, которое происходит при пересадке. Кроме того, эффективность трансформации составила 100% у одного вида растений (тыквы).
Следующие причины могут объяснить, почему одностадийный метод ARM был более эффективным, чем метод гипокотильной инъекции при трансформации волосистого корня. Во-первых, несмотря на то, что первичный корень был удален, транспирация саженцев сохранилась. Таким образом, транспирационное вытяжение способствовало инвазии A. rhizogenes гипокотильных клеток в разрезе. Во-вторых, площадь раны, вызванной разрезом гипокотиля, была больше, чем при инъекционном методе гипокотиля, и, следовательно, больше растительных клеток было инфицировано A. rhizogenes. Наконец, после удаления первичного корня надрез гипокотила закапывали в темный и влажный вермикулит, который является благоприятной средой для образования корней18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Научно-исследовательского фонда Ляочэнского университета (318012028) и Фонда естественных наук провинции Шаньдун (ZR2020MC034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).
- Du, H., et al. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).
- Nguyen, D. V., et al. An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.). Frontiers in Plant Science. 12, 770062 (2022).
- Liu, S., et al. AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 952428 (2022).
- Irigoyen, S., et al. Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp. Nature Communications. 11 (1), 5802 (2020).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Stougaard, J. Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation. Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Yu, Y., et al. Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots. Horticulture Research. 7, 131 (2020).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).
- Fan, Y., et al. One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. BMC Plant Biology. 20 (1), 208 (2020).
- Fan, Y., et al. Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Methods. 16, 94 (2020).
- Wang, X., et al. Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae. Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).
- Wang, X., et al. Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 1104905 (2023).
- Li, Q. Q., et al. Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).
