Summary
כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול המפורט של שיטת טרנספורמציה חד-שלבית בתיווך Agrobacterium tumefaciens לייצור צמחים מרוכבים.
Abstract
ייצור צמחים מרוכבים עם שורשים טרנסגניים וגבעולים וניצנים שאינם מהונדסים באמצעות טרנספורמציית שורשים שעירים בתיווך אגרובקטריום הוא כלי רב עוצמה לחקר ביולוגיה הקשורה לשורשים. טרנספורמציית שורשים שעירים מתבססת במגוון רחב של דיקוטילדונים ובמספר מיני מונוקוטילדונים והיא כמעט בלתי תלויה בגנוטיפ. השיטה המסורתית של הזרקת היפוקוטיל עם קנה שורש A . להשגת צמחים מרוכבים אינה יעילה, גוזלת זמן, מייגעת, ולעתים קרובות גורמת למוות של צמחי היפוקוטיל רכים וזעירים. בעבר הוקמה טרנספורמציה יעילה ביותר, חד-שלבית, של שורש שעיר בתיווך A. rhizogenes , אשר מבטלת את הצורך בהשתלה לאחר ייצור שורשים שעירים. במחקר זה הוסרו היפוקוטיל חלקי ושורש ראשוני, אתר חתך ההיפוקוטיל היה מצופה בקנה-שורש A, ולאחר מכן נשתלו היפוקוטיל בוורמיקוליט סטרילי. לאחר 12 ימי טיפוח, חתך ההיפוקוטיל התרחב והושרו שורשים שעירים חדשים. מאמר זה מספק את הפרוטוקול המפורט של שיטת טרנספורמציה חד-שלבית בתיווך A. rhizogenes, כאשר יעילותה הודגמה על ידי ייצור צמחים מרוכבים של סויה בר, Solanum americanum ודלעת.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes הוא חיידק קרקע גראם-שלילי ממשפחת Rhizobiaceae. A. rhizogenes יכול להדביק כמעט את כל dicotyledons, כמה monocotyledons, ואת gymnosperms בודדים דרך פצעים, לייצר שורשים שעירים בצמחים נגועים. החיידק נושא את פלסמיד Ri (השראת שורש), וה-T-DNA של פלסמיד Ri נושא את הגן הסינתזה opine ואת הגנים rol (גנים לוקוס שורש). לאחר שה-T-DNA של פלסמיד Ri נכנס לתא צמח ומשולב בכרומוזום מארח, ביטוי הגנים של הרול גורם לייצור שורשים שעירים1. וקטור ביטוי בינארי של צמח הנושא גן מטרה הופך לקנה שורש A, וקנה השורש A. שעבר טרנספורמציה משמש להדבקת צמח. שורשים טרנסגניים יכולים להיות מושרים בצמחים נגועים, לייצר צמחים מרוכבים המכילים שורשים טרנסגניים וגבעולים וניצנים שאינם מהונדסים . בדרך כלל, צמח מורכב ניתן להשיג בתוך 14-20 ימים. A. שינוי שורש שעיר בתיווך קנה שורש אינו מוגבל בדרך כלל על ידי גנוטיפ בצמחים dicotyledonous2. השורשים השעירים המיוצרים על ידי צמחים נגועים בריזוגנים מאופיינים בקצב צמיחה מהיר, תורשה יציבה ותפעול קל. טרנספורמציה של שורשים שעירים בתיווך A. rhizogenes נמצאת כיום בשימוש נרחב לחקר ביולוגיה הקשורה לשורשים. יתר על כן, ניתן להשתמש בטרנספורמציה של שורשים שעירים גם כדי לאמת ולמטב את יעילות עריכת המטרותשל מערכת CRISPR/Cas9 3,4,5 ולוקליזציה תת-תאית של חלבונים. לכן, טרנספורמציה של שורשים שעירים היא כלי חשוב במחקר על תפקוד גנים של צמחים, הנדסה מטבולית ואינטראקציות בין שורשים למיקרואורגניזמים בריזוספרה 6,7,8.
צמחים מרוכבים המכילים שורשים טרנסגניים המתקבלים באמצעות טרנספורמציה של שורשים שעירים הופקו באופן נרחב בצמחים דיקוטילדוניים, במיוחד בקטניות. השיטה המסורתית של הזרקת hypocotyl עם קנה שורש A. שימש לייצור מרוכב Lotus corniculatus9, פולי סויה10, עגבניות 11, בטטות12, וצמחים רבים אחרים 5,8. שיטת הזרקת ההיפוקוטיל אינה יעילה ועלולה לגרום למוות של צמחי היפוקוטיל צעירים או זעירים. לכן, השיטה שופרה על ידי חיתוך שורשי העובר, ציפוי חתך השתיל עם A. rhizogenes, ולאחר מכן הנחת hypocotyl על מדיום תרבית סטרילית עבור השתרשות טיפוח13. עם זאת, שלבים אלה מבוצעים בסביבה סטרילית, ושלבי הניתוח מסורבלים יחסית. בפרט, צמחים מרוכבים וכתוצאה מכך צריך להיות מושתל, אשר מגדיל את כמות העבודה. בעבודה קודמת נקבעה טרנספורמציה של שורש שעיר בתיווך A. rhizogenes (ARM) במלפפון, סויה, לוטוס japonicus, Medicago truncatula, ועגבניות 2,14,15,16,17. השורש הראשוני וההיפוקוטיל החלקי הוסרו, אתר החתך של ההיפוקוטיל הנותר היה מצופה בקנה-שורש A. שעבר טרנספורמציה, והשתיל הושתל לתוך ורמיקוליט סטרילי לח. לאחר 12 ימי גידול, שורשים שעירים הופקו באתר החתך. שיטת ARM החד-שלבית יעילה ביותר ודורשת פחות זמן לייצר שורשים שעירים. השתלה לאחר יצירת שורשים שעירים הוא גם לא הכרחי. מאחר שניתן להימנע מזיהום מיקרוביאלי ללא השתלה, שיטת ARM החד-שלבית יכולה להיות שימושית במיוחד כאשר חוקרים אינטראקציות בין צמחים ומיקרואורגניזמים, כגון קיבוע חנקן סימביוטי בין צמחים קטומים לריזוביה, וסימביוזה בין צמחים ופטריות מיקוריזה ארבוסקולריות. במאמר זה, פרוטוקול טרנספורמציה מפורט של שורש שעיר בתיווך A. rhizogenes מספק דוגמאות של צמחים מרוכבים המיוצרים בפולי סויה בר, Solanum americanum ודלעת. בעזרת הפרוטוקול, חוקרים יכולים לבצע בצורה חלקה את טרנספורמציית ARM בצעד אחד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תנאי גידול צמחים ותרבית A. rhizogenes
- זריעת זרעים
הערה: זרעי סויה פראיים נאספו במחוז יאנגו, ליאוצ'נג, סין; זרעים של S. americanum ודלעת זן מקומי Yinsu נרכשו מהשוק.- לאסוף זרעים של סויה בר, S. americanum, ואת הזן המקומי של דלעת, לזרוע אותם vermiculite בעומק של 1 ס"מ, ולהשקות אותם היטב. לשתול 20 זרעים בקופסאות פלסטיק בגודל 8 ס"מ על 11 ס"מ על 9 ס"מ. טפחו את הצמחים בתא גידול בטמפרטורה של 24 ± 2°C עם מחזור אור של 16 שעות / 8 שעות חושך בכ-70% לחות יחסית.
הערה: יש לשבור מעילים של זרעי סויה פראיים לפני הזריעה. אם שאלת המחקר מתמקדת באינטראקציות בין צמחים למיקרואורגניזמים, יש לעקר זרעים, ורמיקוליט, קופסאות פלסטיק ומים לפני השימוש. - הפעלה ותרבות של A. rhizogenes K599
הערה: לזן A. rhizogenes K599 היה וקטור בינארי אחד pRed13052 הנושא גן כתב פלואורסצנטי אדום DsRed2.- הסר את זן קנה השורש A . K599 מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C, והפעל את החיידקים על LB בינוני מוצק (עם 50 מ"ג/ליטר קנמיצין ו-50 מ"ג/ליטר סטרפטומיצין) ב-28°C למשך 48 שעות.
- בחר שיבוט יחיד של זן K599 ותגדל אותו בתרבית של 1 מ"ל של מדיום LB נוזלי המכיל אנטיביוטיקה למשך 12 שעות.
- פיזור שווה של 500 μL של תרחיף החיידקים על מדיום LB מוצק המכיל אנטיביוטיקה, ואחריו דגירה ב 28 ° C במשך 24 שעות.
- לאסוף זרעים של סויה בר, S. americanum, ואת הזן המקומי של דלעת, לזרוע אותם vermiculite בעומק של 1 ס"מ, ולהשקות אותם היטב. לשתול 20 זרעים בקופסאות פלסטיק בגודל 8 ס"מ על 11 ס"מ על 9 ס"מ. טפחו את הצמחים בתא גידול בטמפרטורה של 24 ± 2°C עם מחזור אור של 16 שעות / 8 שעות חושך בכ-70% לחות יחסית.
2. שיטת שינוי שורש שעיר בתיווך קנה שורש A. שלב אחד
- חתך היפוקוטיל
- לאחר 7 ימים (הגדירו את זריעת הזרעים כיום 0), שתילי קוטילדונים נפרשו, זה עתה (איור 1A), השתמשו באזמל מעוקר וחד כדי לחתוך בערך 0.5-1 ס"מ מההיפוקוטיל (איור 1B). יש להשליך את השורש הראשוני וחלק מההיפוקוטיל החלקי.
הערה: השתמש באזמל בזהירות.
- לאחר 7 ימים (הגדירו את זריעת הזרעים כיום 0), שתילי קוטילדונים נפרשו, זה עתה (איור 1A), השתמשו באזמל מעוקר וחד כדי לחתוך בערך 0.5-1 ס"מ מההיפוקוטיל (איור 1B). יש להשליך את השורש הראשוני וחלק מההיפוקוטיל החלקי.
- חיסון K599
- צפו את חתך ההיפוקוטיל בחיידקי K599 (איור 1C).
- שתול את השתילים בוורמיקוליט לח (איור 1D).
- להדביק 30 צמחים מכל מין באמצעות שינוי שורש שעיר בתיווך A. rhizogenes. השקו כל צמח עם 5 מ"ל של תרחיף חיידקי K599 מרחף מחדש (OD600 = 0.5-0.6) בתווך בסיסי Gamborg B-5 בחוזק רבע (0.25x).
- כסו את הסירים בשקית ניילון שקופה במיוחד (איור 1F) והניחו אותם בתא גידול.
3. ייצור שורשים שעירים
- לגדל את הצמחים במשך ~ 12 ימים לאחר החיסון, שורשים שעירים חדשים יושרו וייווצרו באתר החתך. לאחר 15 יום, אורכי השורשים השעירים מגיעים בדרך כלל ל-2-5 ס"מ (איור 2).
- כדי לקבוע אם השורשים השעירים המיוצרים הם טרנסגניים, בחנו את ביטוי הגנים הכתבים התלויים בווקטור שעבר טרנספורמציה ב-K599.
- זהו את הביטוי של הגן המדווח DsRed2 באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנטית עם אור עירור ירוק ב-540 ננומטר ופליטה ב-600 ננומטר (איור 2B, איור 2D ואיור 2F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טרנספורמציה יעילה ביותר של שורש שעיר בתיווך קנה שורש A. rhizogenes
שורשים שעירים יוצרו באתר החתך היפוקוטיל 12 יום לאחר החיסון עם K599 מהונדס. שורשים שעירים טרנסגניים נקבעו על סמך ביטוי הגן המדווח הכלול בווקטור הבינארי. שורשים טרנסגניים שעברו טרנספורמציה בעזרת גן הכתב DsRed2 של פולי סויה בר מרוכבים, S. americanum ודלעת נצפו באור עירור טבעי (איור 2A, איור 2C ואיור 2E) וירוק (איור 2B, איור 2D ואיור 2F).
כאשר צמח מרוכב הכיל לפחות שורש מהונדס אחד, הוא הוגדר כצמח מרוכב מהונדס. בין 30 הצמחים המחוסנים מכל אחד משלושת המינים, 28 פולי סויה בר, 18 S. Americanum ו-30 צמחי דלעת היו חומרים מרוכבים טרנסגניים. לפיכך, יעילות שינוי השורש השעיר הייתה 93.3% (פולי סויה), 60% (S. americanum) ו-100% (דלעת). השוואה בין שלושת סוגי הצמחים הצביעה על כך שצמחים עם היפוקוטיל עבה הפיקו שורשים שעירים מהונדסים יותר מאלה עם היפוקוטיל דק.
איור 1: טרנספורמציה של שורש שעיר בתיווך קנה שורש A. (א) שתילי דלעת בני שבעה ימים. (B) חלק אפי של היפוקוטיל חתוך בתמיסה חיידקית K599. (C) K599 מסה חיידקית המצפה את חתך ההיפוקוטיל. (D) חציל נטוע בוורמיקוליט רטוב וסטרילי. (E) השקיה עם 5 מ"ל של תמיסה חיידקית K599 מרחפת ברבע חוזק (0.25x) מדיום בסיסי Gamborg B-5. (ו) כיסוי שקיות ניילון שקוף במיוחד. פסי קנה מידה = 1 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: צמחים מרוכבים שהתקבלו משלב אחד של טרנספורמציית שורש שעיר בתיווך A. Rhizogenes. שורשים של צמחים מרוכבים של (A,B) פולי סויה בר, (C,D) Solanum americanum, ו-(E,F) דלעת תחת (A,C,E) אור עירור טבעי ו-(B,D,F) ירוק. חיצים לבנים מצביעים על שורשים שעירים טרנסגניים; חיצים שחורים מצביעים על שורשים שעירים שאינם מהונדסים . פסי קנה מידה = 1 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת השורש השעיר בתיווך קנה שורש A. היא שיטה פשוטה ויעילה יותר לייצור צמחים מרוכבים מאשר שיטת הזרקת היפוקוטיל. שיטת ARM החד-שלבית משפרת משמעותית את יעילות טרנספורמציית השורשים השעירים, מקצרת את זמן ייצור השורשים השעירים, מגדילה את מספר השורשים השעירים ומפחיתה את כמות העבודה הכרוכה בכך. פרוטוקול הטרנספורמציה המשופר הוא אופטימלי למחקרים על סימביוזות בין צמחים קטומים לריזוביה ובין צמחים ופטריות מיקוריזה ארבוסקולריות. ניתן לייחס זאת לעובדה כי השתלת צמחים מרוכבים לאחר ייצור שורשים שעירים אינה נדרשת, אשר מונעת את הזיהום עם זנים לא מחוסנים המתרחשת במהלך ההשתלה. יתר על כן, יעילות הטרנספורמציה הייתה 100% במין צמח אחד (דלעת).
הסיבות הבאות עשויות להסביר מדוע שיטת ARM החד-שלבית הייתה יעילה יותר משיטת הזרקת היפוקוטיל בטרנספורמציית שורש שעיר. ראשית, למרות שהשורש הראשוני הוסר, נשמרה טרנסספירציה של שתיל. לפיכך, משיכת טרנסספירציה הקלה על פלישת A. rhizogenes של תאים hypocotyl בחתך. שנית, שטח הפצע שנגרם על ידי חתך היפוקוטיל היה גדול יותר מזה שנגרם על ידי שיטת הזרקת היפוקוטיל, ולכן יותר תאי צמח היו נגועים על ידי A. rhizogenes. לבסוף, לאחר הסרת השורש הראשוני, חתך hypocotyl נקבר vermiculite כהה ולח, שהיא סביבה חיובית שבה לייצר שורשים18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של אוניברסיטת ליאוצ'נג (318012028) והקרן למדעי הטבע של פרובינציית שאנדונג (ZR2020MC034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).
- Du, H., et al. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).
- Nguyen, D. V., et al. An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.). Frontiers in Plant Science. 12, 770062 (2022).
- Liu, S., et al. AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 952428 (2022).
- Irigoyen, S., et al. Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp. Nature Communications. 11 (1), 5802 (2020).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Stougaard, J. Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation. Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Yu, Y., et al. Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots. Horticulture Research. 7, 131 (2020).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).
- Fan, Y., et al. One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. BMC Plant Biology. 20 (1), 208 (2020).
- Fan, Y., et al. Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Methods. 16, 94 (2020).
- Wang, X., et al. Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae. Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).
- Wang, X., et al. Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 1104905 (2023).
- Li, Q. Q., et al. Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).
