Summary
空气污染影响所有生物的生活质量。在这里，我们描述了微藻生物技术用于处理沼气（同时去除二氧化碳和硫化氢）和通过半工业开放式高速率藻池生产生物甲烷，以及随后分析处理效率、pH 值、溶解氧和微藻生长。
Abstract
近年来，出现了许多将沼气净化为生物甲烷的技术。这种净化需要降低二氧化碳和硫化氢等污染气体的浓度，以增加甲烷的含量。在这项研究中，我们使用微藻培养技术来处理和净化养猪业有机废物产生的沼气，以获得即用型生物甲烷。为了进行栽培和纯化，在墨西哥拉各斯的圣胡安德洛斯建立了两个22.2 m3 的开放式池塘光生物反应器，并配有吸收-解吸塔系统。测试了几种再循环液体/沼气比 （L/G），以获得最高的去除效率;测量了其他参数，例如pH值，溶解氧（DO），温度和生物量增长。最有效的L/Gs为1.6和2.5，处理后的沼气出水在CO2中的成分分别为6.8%vol和6.6%vol，H2S的去除效率高达98.9%，O2 污染值保持在2%vol以下。我们发现，在培养过程中，pH 值在很大程度上决定了 CO2 的去除，比 L/G 更重要，因为它参与了微藻的光合作用过程，并且由于其酸性而在溶解时能够改变 pH 值。DO和温度分别从光合作用的明暗自然周期和一天中的时间中振荡。生物量的生长随CO2 和养分喂养以及反应器收获而变化;然而，这一趋势仍然为增长做好了准备。
Introduction
近年来，出现了几种技术将沼气提纯为生物甲烷，促进其作为非化石燃料的使用，从而减少不可排放的甲烷排放1。空气污染是一个影响世界大多数人口的问题，特别是在城市化地区;最终，世界上大约 92% 的人口呼吸着受污染的空气2.在拉丁美洲，空气污染率主要是由燃料的使用造成的，2014 年，48% 的空气污染是由电力和热力生产部门造成的3.
在过去的十年中，越来越多的关于空气中污染物与死亡率上升之间关系的研究被提出，认为这两个数据集之间存在很强的相关性，特别是在儿童群体中。
为了避免空气污染的持续存在，已经提出了几种策略;其中之一是使用可再生能源，包括风力涡轮机和光伏电池，这减少了释放到大气中的二氧化碳4,5。另一种可再生能源来自沼气，沼气是有机物厌氧消化的副产品，与液态有机沼渣一起产生6。这种气体由气体混合物组成，其比例取决于用于厌氧消化的有机物来源（污水污泥、牛粪或农工生物废物）。通常，这些比例是 CH4 （53%-70%vol）、CO2 （30%-47%vol）、N2 （0%-3%vol）、H2O （5%-10%vol）、O2 （0%-1%vol）、H2S （0-10,000 ppmv）、NH3 （0-100 ppmv）、碳氢化合物 （0-200 mg/m3） 和硅氧烷 （0-41 mg/m3）7,8,9，科学界对甲烷气体感兴趣，因为这是混合物的可再生能量成分。
然而，沼气不能简单地燃烧，因为反应的副产物可能是有害的和污染的;这就需要对混合物进行处理和净化，以增加甲烷的百分比并减少其余部分，从根本上将其转化为生物甲烷10。此过程也称为升级。尽管目前有用于这种处理的商业技术，但这些技术在经济和环境方面存在一些缺点11,12,13。例如，活性炭和水洗涤 （ACF-WS）、压力水洗 （PWS）、气体渗透 （GPHR） 和变压吸附 （PSA） 的系统在环境影响方面存在一些经济或其他缺点。一个可行的替代方案（图1）是使用生物系统，例如将微藻和光生物反应器中生长的细菌结合在一起的系统;一些优点包括设计和操作的简单性、低运行成本以及其环保的操作和副产品10,13,14。当沼气被提纯为生物甲烷时，后者可以用作天然气的替代品，并且沼渣可以作为营养物质的来源来支持系统中微藻的生长10。
由于较低的运营成本和所需的最少投资资本，因此在该升级程序中广泛使用的一种方法是在开放式滚道光反应器中与吸收塔结合微藻的生长6.该应用最常用的滚道反应器类型是高速藻类池（HRAP），它是一个浅水道池，藻类汤的循环通过低功率桨轮14发生。这些反应堆需要大面积的安装，如果在室外条件下使用，非常容易受到污染;在沼气净化过程中，建议使用碱性条件（pH > 9.5）和在较高pH值下茁壮成长的藻类物种，以增强CO2和H2S的去除，同时避免污染15,16。
本研究旨在使用 HRAP 光生物反应器结合吸收-解吸塔系统和微藻联盟确定沼气处理效率和生物甲烷的最终生产。
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Protocol
1. 系统设置
注意： 本协议中描述的系统的管道和仪表图 （P&ID） 如 图 2 所示。
- 反应器设置
- 通过平整和压实地面来准备地面，以提高反应堆的稳定性。
- 在空旷的场地上，从末端挖两个细长的孔和 3 m 处，进一步挖一个 3 m2 和 1 m 深的孔（称为曝气井）。
- 在土工膜覆盖的金属支架上放置两个HRAP（图3）。每个反应堆的运行能力必须为 22.2 m3。
- 在每个反应堆放置一个 1728.42 瓦（2.35 马力）的气泵，靠近挖掘曝气井的 HRAP 点。
- 在反应器上固定一个桨轮（由1103.24瓦[1.5马力]电动机移动），以促进生物质和介质之间的接触。
- 气体处理装置（图4）
- 用 6 英寸聚氯乙烯 （PVC） 管构建解吸柱，其中入口电流从覆盖的顶部进入 2 m，出口电流从底部流出（图 2）。
- 设置吸收池（Vt：2.55 m3），其中气体入口（未经处理的沼气）电流从底部通过 11 个扩散管鼓泡，并通过 4 英寸的 PVC 管道来自厌氧消化器，穿过沼气机、1 英寸转子表和采样口，而液体来自罐底部解吸柱后的介质再循环。液体出口位于储罐的侧面。它将富含 CO2 的介质输送到液位控制塔，气体从储罐顶部的出口排出，该出口与 1“ PVC 管道相连，将获得的生物甲烷传导到燃烧器进行连续燃烧（图 2）。
- 通过 4“ PVC 管将吸收罐连接到解吸塔，在两个操作之间通过采样口（图 2）。
- 用 6 英寸 PVC 管构建液位控制柱，入口位于底部。它有两个出口（由蝶阀控制），具体取决于系统的需要;第一个位于 2.5 m 的高度，第二个位于距地面 3 m 处（图 2）。
- 通过2英寸PVC管道将HRAP光生物反应器连接到6英寸解吸塔，通过再循环离心泵（1103.24瓦[1.5马力]）和1英寸转子计（图2）。
- 通过 4“ PVC 管将液位控制柱连接到附表 40 PVC 管，通过采样端口。接下来，将其连接到柔性 PVC 管的一部分，然后是另一个 schedule 40 PVC 管，最后是一根 4“ PVC 管，该管通向 HRAP 光生物反应器（图 2）。
- 用 2“ PVC 管道设置解吸柱的旁路，并将其连接到采样口前的主管（图 2）。
2. 系统功能测试
- 再循环离心泵（1103.24 瓦 [1.5 hp]）
- 要确定泵的最大流速，请在内部灌注至少 10 分钟以避免吸入空气，并以 230 V 和 1 相启动。
- 通过让再循环流量流过 1 英寸转子流量计来测试再循环流量。
- 沼气冒泡系统
- 要确定鼓泡至少相当于 200 mbar 的气柱所需的力，请测试至少 3 台不同功率的鼓风机（485.52 瓦 [0.66 马力]、1838.74 瓦 [2.5 马力] 和 3309.74 瓦 [4.5 马力]），方法是将空气鼓泡到吸收罐中。
- 目视验证罐内气泡达到的大小和分布。在此描述的操作条件下，气泡的预测平均直径为 3 mm。
3.室内条件下的接种和生长
- 将纯的 Arthrospira maxima 菌株从琼脂平板转移到15mL水性矿物培养基17 （NaHCO3 [10 g / L]，Na3PO4 ·12H2O [0.033 g / L]，NaNO3 [0.185 g / L]，MgSO4 ·7H2O [0.014 g / L]，FeSO4 ·7H2O [0.0008 g / L]，NaCl [0.4 g / L]）。
- 使用100%的烧瓶体积，使用无害的Jourdan水性培养基将培养物放大至500mL烧瓶，并使用带有表面贴装装置（SMD）2835的发光二极管（LED）灯在12小时光照/ 12小时暗光周期中生长，在2000 lm下提供冷光，并通过空气鼓泡（0.3 L / min或0.6 vvm）连续混合。（步骤持续约 1 个月）。
- 继续放大过程，将先前体积的 20% 添加到新体积中，直到达到 50 L。
- 在温室中，在50 L透明袋中（步骤持续约2个月），使培养物适应自然光操作条件和Jourdan培养基。
- 在这些条件下继续缩放至5 m3 HRAP光生物反应器（步骤持续约2个月）。
4. 系统在室外条件下的运行启动
- 将这些 5 m3 HRAP 光生物反应器的全部体积添加到位于室外的 13 m3 的 HRAP 光生物反应器中，并用 Jourdan 培养基填充体积的其余部分。以 30 cm/s 的速度开始通过桨轮混合，以分批模式培养 15 天或直到达到 0.7 g/L（步进持续约 1 个月）。
- 一旦生长达到 0.7 g/L，将体积转移到运行的 22.2 m3 HRAP，用 Jourdan 培养基填充其余部分，并将桨轮设置为 30 cm/s 的速度。让生物质生长，直到达到 0.7 g/L，pH 值为 10;一旦满足这些条件，如果需要，开始取样和收获。
- 以可变流量启动从HRAP光生物反应器到吸收罐的液体再循环，以提高生物质生产率。2小时后开始以平均流量3.5 m3 / h的沼气冒泡，为培养物提供无机碳。注意pH值，因为它必须保持在9以上。
注意： 在通过吸收罐再循环介质之前，请启动上述离心泵。 - 养分添加：每周通过收获监测养分状况，假设稳定状态，计算结果如下：
MNaNO3 = （M生物量 x 0.10）/0.12 [g]
哪里：
MNaNO3 = 硝酸钠质量 [g]
M生物量 = 收获的生物量 [g]
1.10： 氮/生物量的质量产量16 [g/g]
1.12： 硝酸钠中氮的质量分数 [g/g] - 根据氮平衡结果，重新配制 Jourdan 培养基以按比例添加 Na3PO4·12H2O、MgSO4·7H2O 和 FeSO4·7H2O。不要添加更多的碳酸氢钠或氯化钠。
注意：在将营养物质添加到反应器中之前，先将营养物质溶解在干净的水中。 - 监测水分蒸发，必要时每周添加一次。
5. 取样和分析
- 沼气
- 通过用适当直径的软管将 10 L 聚氟乙烯袋连接到出口，从吸收罐前的采样出口和罐后的采样出口对沼气进行采样;将每个放在单独的聚氟乙烯袋中。
- 通过将压力传感器设置为零并等待稳定来校准便携式气体分析仪。为此，请先按 “开始”，然后按“ 下一步”，然后按照分析仪的指示连接透明管和黄色管。按 “下一步 ”，最后按 “气体读数”。
- 将聚氟乙烯袋中的每个样品连接到分析仪，按 下一步 并测量系统两个点的 CH4、CO2、O2 和 H2S 浓度（以 %vol 表示）。
- 通过将液体再循环流量除以沼气生产流量来确定体积再循环液体/沼气比 （L/G）。计算相应的气体流量 （m3/h），以提供最高的 CO2 和 H2S 去除效率。
- 在线测量系统条件（pH值、溶解氧、温度）
- 根据制造商的规格校准所有传感器。
- 将pH传感器、溶解氧（DO）传感器和温度传感器放入每个HRAP的液体中。
注意： 有关每个传感器的品牌和规格，请查看材料表文件。 - 将 pH 和 DO 传感器连接到数据采集设备，该设备由一个 1.4 GHz 64 位四核处理器组成，该处理器连接到便携式屏幕，该屏幕存储在集成开发和学习环境 （IDLE） 2.7 中编写的预制 Python 程序。
- 通过屏幕打开程序并指示存储每个数据点的时间间隔（在本例中为每 2 分钟一次）。
- 创建一个电子表格，程序将在其中自动存储它收集的数据。
- 单击读取 ON 的按钮，表示它已准备好开始存储数据。
- 要停止数据采集，请单击读取 OFF 的按钮。
- 要下载信息，请插入通用串行总线 （USB） 并导入电子表格。
- 将温度传感器连接到温度记录仪以存储实验期间记录的数据。
- 简短的探索性测试
- 确定最有效的L/G
- 调节进入的沼气流量以选择要测试的 L/G 值（0.5、1、1.5、1.6、2、2.5、3.3、3.4）。
- 使用前面描述的仪器测量每种气体（CH4、CO2、H2S、O2、N2）的 pH 值以及每种气体的入口和出口浓度，每 15 分钟测量一次（60 分钟）。
- 通过比较出口值确定最有效的L/G，并根据实验的需要选择最方便的L/G。
- L/G、pH 值和 CO之间的关系 2
- 选择至少两个 L/G 进行比较。
- 对于每个L / G，在开始时测量CO2的pH值以及H2S，O 2和N2的入口和出口浓度作为对照，每15分钟一次，持续60分钟，然后每小时测量一次，总共5小时，使用前面描述的仪器。
- 使用以下公式计算 CO2 去除百分比：
CO2 去除率 = （（CO2输入 - CO2输出）/（CO2输入）） x 100 - 绘制结果图表，并比较每个测试的 L/G 的 pH 值和 CO2 的行为。
- 确定最有效的L/G
- 将每升培养物的生物量重量与750nm处吸光度相关联的校准曲线18
- 对藻类培养物进行采样，尝试获得 1.0 的吸光度。如果培养物的吸光度低于1.0，则通过过滤（0.45μm过滤器）从培养物样品中提取水。如果吸光度大于1，则可以通过添加新鲜培养基来降低吸光度。
- 使用样品制备五种藻类细胞悬浮液并加入新鲜培养基，体积/体积 （V/V） 百分比：100%、80%、60%、40% 和 20%。
- 使用塑料比色皿的分光光度计测量并记录五种溶液在750nm处的吸光度，其中新鲜培养基是空白的。
- 通过先前称量的0.45μm过滤器过滤10mL，并将样品在二氧化硅干燥器中干燥24小时，然后干燥48小时，以确保重量恒定，从而确定每种悬浮液的每升培养物的生物量重量。对五个解决方案中的每个解决方案重复此步骤。
注意：不建议使用更高的温度（高于60°C）进行干燥，因为某些关键化合物会损失，这些化合物可能会挥发并改变样品的重量。 - 确认重量后，使用以下公式计算反应器内的生物质浓度：
生物质浓度=（生物质重量-滤量重量）×1000/过滤体积[g/L] - 使用电子表格或任何其他软件对生物质重量数据（克/升培养物）进行线性回归，作为在750nm处测量的吸光度的函数。线性回归系数应大于 0.95;否则，曲线没有用，应重复该协议。
注意：它被描述为生物质重量，而不是像大多数方法那样干重，因为使用的干燥方法不允许完全去除样品中的水分，使含水量低于 5%19。
- 生物质生长
- 每天监测反应堆。从桨轮与其从每种培养物返回之间的中间点取 1 L 样品，并将其带到实验室。
- 在显微镜下检查菌落生长和培养物的纯度。
- 用分光光度计测量并记录样品在750nm处的吸光度，其中新鲜培养基是空白的。
- 与校准曲线进行比较，以获得以克/升为单位的估计生物质重量。
- 记录每个滚道反应器的生长情况。
- 生物质生产 - 收获
- 每天监测反应堆。如果取样期间生物量增长超过0.7 g/L，则需要收获。
- 在两个 HRAP 之间交替，将聚酯网放在反应器一端的部分顶部，并将柔性 PVC 管的一端置于液体流动中，以便另一端将液体排出网顶部。
- 将 4500 L 至 7500 L（取决于反应器的生物质饱和度）排放到网格上，保持连续流回相应的 HRAP。生物质将保留在网格上。
- 要收获，请从反应器顶部取下网状物并将其放在不同的表面上以刮掉生物质并将其放入漏斗中。
- 将生物质推过漏斗，在干净干燥的网眼顶部形成细长的形状;将网格置于温暖的有盖房间（34-36°C）中48-72小时。
- 干燥后，从网中取出生物质并称重。使用以下公式计算收获的生物量浓度（g/L）：
排出液体量 = 泵流量 x 排油时间 [L]
收获的生物量浓度=收获的生物量重量/排出液体体积[g/L]
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Representative Results
按照协议，该系统被构建、测试和接种。测量和储存条件，采集和分析样品。该协议执行了一年，从 2019 年 10 月开始，一直持续到 2020 年 10 月。值得一提的是，从这里开始，HRAP 将被称为 RT3 和 RT4。
生物甲烷生产力
为了确定促进最高 H2S 和 CO2 去除以及因此达到最高甲烷浓度的条件，在 0.5 至 3.4 的范围内尝试了几种再循环液体/沼气比 （L/G）。这些结果是在9月25日至9月28日期间持续持续60分钟（1小时）的连续沼气冒泡的实验中获得的。在这些测试中，微藻固定了 CO2，细菌氧化了 H2S，浓缩了甲烷 （CH4），并基本上净化了气体混合物。
考虑到整个系统的平均CO2 消除能力（HRAP容积+储罐容积=24.75 m3）和0.8 g/L的稳定生物量浓度，估计了比固定率，结果为65 mgCO2/gbiomass h，低于报告的最大理论值（300 mgCO2/gbiomass h）。这说明基于微藻细菌的沼气净化工艺适合加强。
一般来说，沼气净化在较高的L/G值下提高了功效，使H2S的去除效率保持在98%或以上，CO2 的去除效率低于7.5%vol含量值（图5、 图6和 图7）。然而，由于这种气体的光合作用产生而产生的 O2 生物甲烷污染在较高的 L/G 值下要高得多，这可能是商业用途的潜在问题，因为根据法律，O2 浓度必须保持相当低以降低爆炸的风险20.另一个原因与避免因 O2 稀释而降低其热值有关。相反，可以说 L/Gs 1.6 和 2.5 代表了总体上最有效的结果，CO2 浓度在 6.6%vol 和 6.8% vol 之间，CH4 浓度在 87% vol 和 O2 小于 1.5% vol 之间，并且呈现出 H2S 去除效率高于 98.5%（图 5、 图 6、 和 图7）。获得的百分比与法律接受的百分比之间的比较可以在 表1中找到。
有趣的是，再循环液体/沼气比值为2，即使该值位于最有效的L/Gs之间，CO2 浓度也较高（7.4%vol）;这可能归因于它是在 RT3 而不是 RT4 中测试的。在这种情况下，CO2 去除的条件不太有利，可能是由于生物量浓度较低。总体而言，在这些条件下产生的平均生物甲烷高达20.68 m3 /天，平均流速为4.14 m3 / h。
结果可能因生长条件、沼气类型（合成或真实）和藻类而异;例如，Serejo 等人 21 使用两种合成沼气混合物模拟全 CO2 和 N2 气体混合物，与由 70%vol CH4、29.5%vol CO2 和 0.5%vol H2S 制成的常规沼气进行比较，通过培养 普通小球藻的 180 L HRAP 吸收塔系统对其进行纯化。在本文中，Serejo 还在较小但相似的系统中测试了不同的 L/G 比，范围从 0.5 到 67，在较低的 pH 值和人工照明下。H2S 完全去除，最佳比例（高于 15）的平均去除率为 80%。这些去除效率随比率线性增加;然而，氧气污染也有所增加，这可能会对所得生物甲烷的整体质量造成问题。我们的 CO2 去除效率的提高不是线性的;尽管如此，在更大的比率下，可以看到更好的 CO2 消除。解释是多因果的，涉及pH值、培养养分条件和生物量生长，以及沼气冒泡。
L/G比对沼气提纯系统性能的影响进行了评估，没有重复。这是有道理的，因为测定是在10：00至13：00的昼夜期间进行的（它将引起稳定的太阳照射和室外温度）;因此，它为光合微生物诱导了近乎最佳的生长条件，因此可以认为 pH 值是影响 CO2 吸收的最重要参数22 ，其中评估 L/G 比对 CO2 吸收去除效率的影响的测定也报告了很少低于 2% 的标准偏差。
反应器是在外部培养的，这意味着，即使接种物是 Arthrospira maxima 藻类的纯培养物，被培养物内在恶劣的 pH 条件下存活的其他生物污染的可能性也很高。硫氧化细菌23,24就是这种情况。然而，这种污染被证明对实验的最终目的是有益的，因为这些细菌有助于从沼气中去除 H2S，基本上负责这项任务并有助于提高所得生物甲烷的质量。
在系统运行期间普遍存在的环境和离子强度条件下，溶解的H2S通过氧化-非生物反应被氧化为多硫化物和硫代硫酸盐，几天后，它应该被完全氧化成硫酸盐25。由于与H2S负载速率相比，进料到系统的阳离子量不足（达到阳离子/H2S摩尔比远低于2），因此在水性营养介质中用阳离子沉淀去除H2S是微不足道的。在沼气提纯过程中，我们的目视检查证实了没有沉淀物。由于系统对环境开放，因此目前尚未验证生物硫化物氧化。
系统条件
在光照和黑暗条件下测量溶解氧 （DO） 和 pH 值变化。在白天（光照条件），由于微藻光合产生氧气，溶氧增加，而在夜间（黑暗条件），由于缺乏光合作用和利用呼吸的异养代谢，溶氧减少（图8）。
pH值也随液体中CO2的存在而变化（图8），当溶解的CO2较少时，其值增加，当去除较少的CO2时，pH值会降低;值得注意的是，在不再提供 CO2 的时候，峰值较小，这将在后面进一步讨论。在早晨，pH值在上午11：00左右达到峰值，在下午18：00左右达到最低值，这也与藻类的光合作用活动一致。重要的是要引起人们对第 2 天左右的大幅下降的关注;9 月 29日进行了使用 1.64 的 L/G 进行的短期探索测试，在大约 24 小时（大约第 1 天）供应连续沼气，它引发了系统的大规模不稳定，需要供应尿素来帮助氮回收。10月5日（第7天左右）进行了另一次使用1.58的短时间探索性测试，但在更好的系统条件下（白天供应沼气），这就是为什么pH值在恢复正常行为之前仅略微偏离常规峰值两天的原因。
图 8 中 pH 值的较小峰值可归因于藻类在从光合作用转变为呼吸作用时对环境的自我调节期。
参考将 pH 值和 L/G 与 CO2 去除率联系起来的简短探索性测试（图 9），我们测试了两个比率，如前所述，1.64 和 1.58。这些都是实验期间记录的L/G的平均值。可以注意到两种不同的行为，其中去除率和 pH 值在 1.58 的比率下明显不那么稳定，并且远低于 1.64 比率的记录。
Bahr 等人 15 通过使用带有 一种 Arthrospira maxima 藻类的 HRAP 柱系统进行的沼气升级支持了这一点。Bahr 评估了不同 pH 条件和介质液体流速下 CO2 的去除效率，以及 H2S 和 O2 污染的去除效率，从简单的 CO2-N 2 到具有不同 H2S 浓度（高达 0.5%vol）的沼气成分。他们得出的结论是，在较高的pH值（范围9-10）和较高的培养基液体流速（80 mL/min）下，CO2 去除率接近100%，但遭受的O2 污染较高，而在较高的pH值（范围9-10）和较低的培养基液体流速（20 mL/min）下，CO2 去除率保持在接近100%的水平，观察到的O2 污染要少得多。他们还报告了在这些条件下完全去除 H2S。
同样，溶氧振荡（图 8）可归因于藻类的光合活性，因为在白天，由于微藻光合产生的氧气，溶氧增加，而在夜间，由于缺乏光合作用和异养代谢，溶氧减少利用呼吸作用。
HRAP光生物反应器（RT4）中的温度因一天中的时间和秋季天气而变化，大多数日子在17：00左右达到23°C至28°C之间的峰值，并在6：00左右达到11°C至15°C之间的最低值（图10）。偶尔测量吸收罐入口和出口的温度，平均温度分别为30.1°C和32.5°C。因此，假设在这两种情况下，沼气中的水分都达到饱和，处理后的含水量（蒸气）应略高于沼气处理前（13.5%）。强烈建议安装沼气干燥机，以优化管理和进一步使用净化后的沼气。
9 月 28日至 10 月 10 日期间的平均 L/G 为 1.6，因为短期测试表明该比率将促进更好的结果;然而，由于水性培养基的 pH 缓冲能力差导致微藻培养物过度酸化，因此无法在夜间维持它。因此，只有在白天，沼气才被送入吸收罐，将L/G值调整到1.5左右。
生物质生产力
RT3接种于2020年5月20日，RT4接种于2020年5月27日;考虑到 COVID 全球大流行，测试（9 月）和接种之间的时间有助于稳定培养并解决出现的操作问题，例如瘟疫和系统故障。
生物量增长以两种方式测量：取样和收获。就本文而言，取样是指反应器中任何给定时间的生物质浓度，而收获是指生物质的生产效率，即在避免生长抑制的过程中回收的生物质量。测试于 9 月 29 日至 10 月 9 日进行，平均 L/G 为 1.5，尽管首选 1.6 的比率;导致其下跌的原因是由于第 11 天左右记录的 1.15 比率。
从第1天到第11天（从9月29日到10月9日）定期进行采样（图11），两个反应器的增长趋势非常相似：它从较高的浓度开始，在第4天和第5天达到实验的最低值，在RT4中稳步恢复，RT3有一些变化， 终于又掉了下来。在Harvesting中也看到了完全相同的行为，这表明一个事件（很可能是外部因素）同时影响了两种文化的生长。
收割（图12）是半定期进行的，RT3交替收割一次，RT4交替收割下一次。但是，必须考虑规模;在取样和收获中，数字之间的差异非常小，表明影响两个反应堆的事件并不严重。 图 8 中的红色虚线表示反应堆未收获的时间段;这是由于两个因素造成的：有几天是在周末，不幸的是，反应堆无法进行取样或收集（这也可以在 图11中得到证实），并且该方法要求收集浓度最高的反应堆。在综合体中，有四个反应堆，其中只有两个（RT3和RT4）参与了这项研究，这使得周末之后的几天，其他两个反应堆（RT1和RT2）被团队收集，导致没有从RT3和RT4收集数据。收获数据比采样数据少约50%;这可能是因为该方法的效率较低。
每天的值之间的变化很小（图11），这暗示了一种弹性文化，允许系统条件的变化并保持稳定。 Arthrospira maxima 优先生长在高pH值的高度碳酸化培养基中，并且对NH3 抑制15高度敏感，这与 图8所示的结果一致。2020 年 8 月执行的校准如 图 13 所示。
后期制作审查和副产品
为了审查这种气体减少对环境有害排放的潜力，一家外部公司进行了一份完整的报告，其中研究结果指出，与直接使用厌氧消化池的未净化沼气相比，使用该技术产生的生物甲烷将直接二氧化碳排放总量减少了 84%。此外，当对原始沼气和纯化生物甲烷产生的电力进行生命周期分析时，生物甲烷能够提供的总热容量比原始沼气的热容量高 23,000 kJ。
最后，该纯化过程的副产品是收获的微藻，一旦干燥，在其他行业中具有无数的应用，这可以为该方法增加更多价值并使该过程具有成本效益26。例如，对罗勒作物进行了一项研究，以评估使用干燥 的 Scenedesmus 生物质与普通无机肥料时的叶子数量、枝条鲜重和干重以及叶鲜重等参数;他们在生物质和肥料27中发现了这些标准的可比结果。在另一项研究中也发现了类似的结果，他们比较了四种经济作物植物的生长，同时使用不同浓度的由悬浮在水中的藻类生物质制成的肥料;即使在低浓度（20%）的肥料下，作物也能达到最大生长，与化肥相当28。
图 1：使用微藻净化沼气中发生的生物过程的可视化表示 请单击此处查看此图的较大版本.
图 2：协议中描述的系统的 P&ID 图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：实验期间使用的 HRAP 照片。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：吸收罐。 （A） 吸收池的培养基和沼气入口的照片。（B）吸收罐的前后视图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：RT3 中用于确定 L/G 效率的简短探索性测试。 深绿色对应CH4，绿色对应CO2，浅粉色对应O2，深粉色对应N2。平均pH 9.2435;进液口 60-100 L/min;进气口 50-120 L/min. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：RT4 中用于确定 L/G 效率的简短探索性测试。 深粉色对应 N2，浅粉色对应 O2，深绿色对应 CO2，浅绿色对应 CH4。平均pH值9.95;进液口 116-118 L/min;进气口 35-75 L/min. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7：在短期探索性测试期间，每个 L/G 中 H2S 的所有去除百分比的比较。 0.5、1、1.5 和 2 的 L/G 对应于 RT3,1.6、2.5、3.3 和 3.4 对应于 RT4。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：pH 值和溶解氧曲线。 2020 年 9 月 28日至 10 月 10 日期间 RT4 的 pH（深绿色）和 DO（浅绿色）曲线。进液口 75-118 L/min;进气口 57-75 L/min.每种气体的平均进料浓度：CH4- 60%vol，H2S - 2400 ppmv，CO2- 34%vol，O2- 0.6%vol。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 9：CO2 的去除百分比曲线，具体取决于 pH 值和 L/G。 绿色对应于 L/G 比的 CO2 去除百分比：1.58（深绿色三角形）和 1.64（浅绿色圆圈）。粉红色对应于L/G比值的pH值：1.58（深粉色三角形）和1.64（浅粉色圆圈）。进液口 75-118 L/min;进气口 57-75 L/min.每种气体的平均进料浓度：CH4- 60%vol，H2S - 2400 ppmv，CO2- 34%vol，O2- 0.6%vol。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 10：2020 年 9 月 28日至 10 月 10 日期间 RT4 的温度曲线。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 11：2020 年 9 月 28 日至 10 月 10 日期间 RT4（浅绿色方块）和 RT3（深绿色圆圈）的采样结果。L/G 比用箭头表示。请点击这里查看此图的较大版本.
图 12：2020 年 9 月 28 日至 10 月 10 日期间 RT4（浅绿色方块）和 RT3（深绿色圆圈）的收获结果。L/G 比用箭头表示。在红色虚线中，显示了两个反应堆没有收获的时间段。请点击这里查看此图的较大版本.
图 13：2020 年 8 月进行的校准曲线，将藻类培养物的浓度（以克/升为单位）与 750 nm 处的吸光度相关联。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 分量 （%vol） | 获得沼气组合物 | 升级的沼气成分 | 商业生物甲烷成分 NOM-001-SECRE-2010 |
| 第4 章 | 64.2 ± 0.8 | 85.1 ± 2.0 | >84 |
| 一氧化碳2 | 33.8 ± 0.1 | 7.2 ± 1.2 | <3 |
| H2秒 （ppmv） | 2539 ± 32 | 30.5 ± 4.2 | <6 |
| O2 | 0.3 ± 0.1 | 1.7 ± 0.5 | <0.2 |
表1：沼气成分比较
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Discussion
多年来，这种藻类技术已经过测试，并被用作净化沼气的苛刻而昂贵的物理化学技术的替代品。特别是， 节肢螺旋 体属与 小球藻一起被广泛用于这一特定目的。然而，很少有半工业化规模的方法，这为这一过程增加了价值。
通过使用适当的 L/G 比来保持较低的 O2 浓度至关重要;但是，这取决于将应用此协议的区域。由于管道中存在爆炸和腐蚀的风险，生物甲烷中的氧含量受到严格控制。欧盟一些国家要求含量低至1%vol 29,30,31。另一方面，甲烷的浓度必须超过 65% vol31。在墨西哥，几乎没有关于沼气和生物甲烷的法规，因为它被认为等同于天然气，根据墨西哥标准32，生物甲烷中 CH4 的最低含量为 84%vol，允许的最大 O2 含量为 0.20%vol。
此外，在栽培过程中，pH 值在很大程度上决定了 CO2 的去除率，比 L/G 更重要，这就是为什么在整个方法中保持对 pH 值的适当控制至关重要的原因，尤其是在沼气冒泡期间。重要的是要了解，一旦 CO2 溶解在液体中，就会产生直接影响 pH 值的化学平衡。在这些培养物振荡的pH值（8.5-9.5）下，碳酸氢盐是该分子存在的形式，在pH值范围33的高端，碳酸盐略有增加。在这种形式下，微藻还能够在光合作用的暗反应中代谢碳以产生碳水化合物34。沼气冒泡的时间也很重要，建议保持白天的冒泡。尽管如此，L/G 也会影响 CO2 的去除和 pH 值，如图 5 所示。去除率和pH值在1.58的比率下不太一致，远低于1.64的比率。这种行为可归因于再循环比中较高的气体摄入量（气体越多，比率越小），从而以更快的速度降低了pH值。然而，也可以说 1.64 的起始 pH 值更高，这有利于该测试期间 CO2 消除效率的缓冲行为。该协议中的L / G通过气泡的沼气量进行控制;但是，其他协议会改变循环液体速率，这也是一种选择。此外，由于培养物的酸化和藻类代谢，夜间不可能冒泡沼气，因为此时不提供人造光。
另一个导致结果有效性可变的现象是间歇性空气冒泡，用于避免反应器中的生物质沉降，从而防止氧气积累抑制生长。但是，如果使用此方法，则无法避免这种情况。空气冒泡的另一种方法是添加更多的桨轮，以改善沿反应器长度的运动，这在其他实验中可能有效。另一方面，安装反应堆所需的大面积土地，以及启动和维护系统所需的大量水消耗，以获得公平的生物甲烷生产力。
需要注意的是，这种常规采样过程使用生物质重量-吸光度校准曲线（图9），其中数据之间的相关性几乎为1（0.9995）;虽然该方法可能不是基于以前关于同一藻类的文章，但决定系数显示出该方法可靠的强统计联系。此外，在这种方法中描述取样和收获的重要性是相关的。取样可以适当地维持藻类培养物，而收获具有三重目的：首先，它避免了由于培养物过度拥挤而导致的生长抑制，这可能导致氧气积累35;其次，藻类生物质的恢复可以带来进一步的经济机会;最后，它提供了另一个机会来衡量文化的增长趋势。
然而，确定适当的收获时刻（在本协议中由采样结果定义）也是一个关键步骤，因为它降低了反应器中的生物质。较低的生物质浓度会影响pH和CO2的去除：在不利的系统条件下（例如，在较低的pH值下），生物质增长减慢，这反过来又降低了系统消除CO2的能力，因为代谢CO的生物量较少;溶解度更高的 CO2 会酸化培养基，并关闭循环36.许多其他因素有助于 pH 值和生物量的增长，在这种对因果关系的过度简化中不应忽视这些因素;氮的可用性对于Arthrospira maxima藻类以及温度和光照强度16,36等气候条件极为重要，这些条件在这样的系统中是无法控制的。例如，如图 4 所示，尿素的添加证明了氮以及更高的 pH 值可以使藻类系统规则化。
这种方法的其他局限性与收获生产率有关，与取样相比，收获生产率的效率降低了约50%，这阻碍了系统的经济可行性，需要改进过滤技术。收获重量结果被高估了 6%（之后按照标准干重方法测量），因为协议该部分的干燥条件不会导致完全消除水分。在生物质方面，由于方法19中未完全消除水分，采样结果（包括校准曲线）至少被高估了5%;然而，由于误差是系统性的，因此建议仅进行热重分析以验证培养物中的含水量，以考虑并对结果和校准曲线进行分析修正。
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Disclosures
利益冲突。作者声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢DGAPA墨西哥国立自治大学项目编号IT100423提供部分资金。我们还要感谢PROAN和GSI允许我们分享有关其光合沼气升级全面安装的技术经验。非常感谢佩德罗·埃尔南德斯·格雷罗牧师、卡洛斯·马丁·西加拉、胡安·弗朗西斯科·迪亚斯·马尔克斯、玛格丽塔·伊丽莎白·西斯内罗斯·奥尔蒂斯、罗伯托·索特罗·布里奥内斯·门德斯和丹尼尔·德洛斯·科沃斯·瓦斯孔塞洛斯的技术支持。这项研究的一部分是在IINAM环境工程实验室完成的，并获得了ISO 9001：2015证书。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1" rotameter | CICLOTEC | N/A | |
| 1" rotameter | GPI | A10-LMA100IA1 | |
| Absorption tank | EFISA | Made under previous design | |
| Air blower (2.35 HP) | Elmo Rietschle | 2BH11007AH01 | |
| Biogas blower (2 HP) | Elmo Rietschle | 2BH11007AH01 | |
| Biogas composition measure | Geotech | BIOGAS 5000 | |
| Data-acquisition device | LabJack Co. | U3-LV | |
| Diffuser tubes | Aero-Tube | C3060AR | |
| DO sensor | Applisens | Z10023525 | |
| Dodecahydrated trisodium phosphate | Quimica PIMA | N/A | Fertilizer grade (greenhouse and experior use) |
| Dodecahydrated trisodium phosphate | Fermont | 35963 | Analytical grade (Used in cultures inside the laboratory) |
| Durapore membrane (45 µm) | MerckMillipore | HVLP04700 | |
| Electric motor 1.5 HP | Weg | 00158ET3ERS56C | |
| Ferrous sulfate heptahydrate | Agroquimica Samet | N/A | Fertilizer grade (greenhouse and experior use) |
| Ferrous sulfate heptahydrate | Fermont | 63593 | Analytical grade (Used in cultures inside the laboratory) |
| Geomembrane | GEOSINCERE | N/A | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Tepeyac | N/A | Fertilizer grade (greenhouse and experior use) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fermont | 63623 | Analytical grade (Used in cultures inside the laboratory) |
| Paddle wheel | GSI | Made under previous design | |
| pH sensor | Van London pHoenix | 715-772-0041 | |
| Portable screen | Rasspberry | Pi 3 B+ | |
| Recirculation centrifugal pump (1.5 HP) | Aquapak | ALY 15 | |
| Sodium bicarbonate | Industria del alcali | N/A | Fertilizer grade (greenhouse and experior use) |
| Sodium bicarbonate | Fermont | 12903 | Analytical grade (Used in cultures inside the laboratory) |
| Sodium chloride | Sal Colima | N/A | Fertilizer grade (greenhouse and experior use) |
| Sodium chloride | Fermont | 24912 | Analytical grade (Used in cultures inside the laboratory) |
| Sodium nitrate | Vitraquim | N/A | Fertilizer grade (greenhouse and experior use) |
| Sodium nitrate | Fermont | 41903 | Analytical grade (Used in cultures inside the laboratory) |
| Storing program (pH, DO) | Python Software Foundation | Python IDLE 2.7 | |
| Tedlar bags | SKC Inc. | 232-25 | |
| Temperature recorder | T&D | TR-52i | |
| UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific instrument | GENESYS 10S | |
| Vacuum pump | EVAR | EV-40 |
References
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