Summary
Denne protokol beskriver den tilpassede antistofbaserede fluorescensmærkning og injektion i tidlige Drosophila-embryoner for at muliggøre levende billeddannelse af proteiner med lav overflod eller posttranslationelle modifikationer, der er udfordrende at detektere ved hjælp af traditionelle GFP / mCherry-tag-tilgange.
Abstract
Visualisering af proteiner i levende celler ved hjælp af GFP (Green Fluorescent Protein) og andre fluorescerende tags har i høj grad forbedret forståelsen af proteinlokalisering, dynamik og funktion. Sammenlignet med immunfluorescens afspejler levende billeddannelse mere præcist proteinlokalisering uden potentielle artefakter som følge af vævsfiksering. Det er vigtigt, at levende billeddannelse muliggør kvantitativ og tidsmæssig karakterisering af proteinniveauer og lokalisering, hvilket er afgørende for at forstå dynamiske biologiske processer såsom cellebevægelse eller deling. En væsentlig begrænsning ved fluorescerende mærkningsmetoder er imidlertid behovet for tilstrækkeligt høje proteinekspressionsniveauer for at opnå vellykket visualisering. Derfor kan mange endogent mærkede fluorescerende proteiner med relativt lave ekspressionsniveauer ikke detekteres. På den anden side kan ektopisk ekspression ved hjælp af virale promotorer undertiden føre til proteinfejllokalisering eller funktionelle ændringer i fysiologiske sammenhænge. For at løse disse begrænsninger præsenteres en tilgang, der anvender meget følsom antistofmedieret proteindetektion i levende embryoner, der i det væsentlige udfører immunfluorescens uden behov for vævsfiksering. Som bevis på princippet kan endogent GFP-mærket Notch-receptor, der næppe kan påvises i levende embryoner, visualiseres med succes efter antistofinjektion. Desuden blev denne tilgang tilpasset til at visualisere posttranslationelle modifikationer (PTM'er) i levende embryoner, hvilket muliggør påvisning af tidsmæssige ændringer i tyrosinphosphoryleringsmønstre under tidlig embryogenese og afslører en ny subpopulation af phosphotyrosin (p-Tyr) under apikale membraner. Denne fremgangsmåde kan modificeres til at rumme andre proteinspecifikke, mærkespecifikke eller PTM-specifikke antistoffer og bør være kompatibel med andre injektionsmodtagelige modelorganismer eller cellelinjer. Denne protokol åbner nye muligheder for levende billeddannelse af proteiner eller PTM'er med lav forekomst, der tidligere var udfordrende at detektere ved hjælp af traditionelle fluorescerende mærkningsmetoder.
Introduction
Immunofluorescens er en hjørnestensteknik i moderne cellebiologi, der oprindeligt blev udviklet af Albert Coons, som muliggør påvisning af molekyler i deres oprindelige cellulære rum og karakterisering af de molekylære sammensætninger af subcellulære organeller eller maskiner1. Sammen med genetiske manipulationer hjælper immunofluorescens med at etablere det nu velaccepterede koncept, at proteinlokalisering er afgørende for dets funktion2. Bortset fra specifikke primære antistoffer og lyse fluorescerende farvestoffer afhænger succesen med denne teknik af en foreløbig proces kaldet fiksering og permeabilisering, som bevarer cellulære morfologier, immobiliserer antigener og øger tilgængeligheden af antistoffer i intracellulære rum. Uundgåeligt ville fikserings- og permeabiliseringsprocessen dræbe celler og afslutte alle biologiske processer3. Derfor giver immunofluorescens kun snapshots af proteiners livsrejse. Imidlertid er mange biologiske processer såsom cellemigration og delinger dynamiske, hvilket kræver undersøgelse af proteinadfærd på en rumlig-tidsmæssigt løst måde 4,5.
For at undersøge proteindynamikken i levende organismer er der udviklet levende billeddannelsesmetoder baseret på genetisk kodede fluorescerende proteiner såsom grønt fluorescerende protein (GFP)6 og højhastighedskonfokale mikroskoper. Kort fortalt kan proteinet af interesse genetisk manipuleres til at blive smeltet sammen med GFP7 og derefter ektopisk udtrykt fra virale eller gærpromotorer såsom cytomegalovirus (CMV)8 eller opstrøms aktiveringssekvens (UAS)9. Fordi GFP er autofluorescerende i naturen, kræves der ingen fluoroforkoblede antistoffer for at afsløre lokaliseringen af målproteiner, hvilket omgår nødvendigheden af indledende fikseringsprocesser eller permeabilisering. I løbet af de sidste to årtier er fluorescerende mærker, der spænder over hele spektret af bølgelængder, blevet udviklet10, hvilket muliggør flerfarvet levende billeddannelse af flere målproteiner på samme tid. Sammenlignet med kemisk manipulerede fluorescerende farvestoffer som AlexaFluor eller ATTO er autofluorescensen af disse genetisk kodede fluorescerende proteiner imidlertid relativt svag og ustabil, når den udtrykkes fra endogene promotorer, især under levende billeddannelse over længere tidsskalaer10. Mens denne mangel kan afbødes ved overekspression af fluorescerende mærkede målproteiner, forstyrrer mange med enzymatiske aktiviteter såsom kinaser og fosfataser alvorligt normale biologiske processer, hvis de ikke udtrykkes på fysiologiske niveauer.
Denne protokol præsenterer en metode, der muliggør fototabel antistofbaseret målbelysning i en live billedopsætning, hvilket i det væsentlige tillader immunofluorescens uden fikserings- eller permeabiliseringsprocessen (figur 1). Gennem en simpel NHS-baseret primær aminreaktion11 kan man konjugere fluorescerende farvestoffer som AlexaFluor 488 eller 594 med stort set ethvert primært antistof eller GFP / HA / Myc nanobody12. Ved at udnytte en udviklingsfunktion, at alle Drosophila embryonale celler deler en fælles cytoplasma under syncytium fase13, kan man opnå antigenbinding og belysning på tværs af hele embryoner efter injektion af farvestofkonjugerede antistoffer. Med ekspanderende biblioteker af endogent mærkede proteiner, der er tilgængelige i Drosophila og andre modelsystemer14, kan denne metode potentielt udvide anvendelser af disse biblioteker ved at afsløre dynamikken i fluorescerende mærkede proteiner med lav overflod og andre ikke-fluorescerende mærkede (HA / Myc-mærkede) proteiner i levende væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgene blev udført i overensstemmelse med retningslinjer og godkendelse fra School of Life Sciences, SUSTech University. Den anvendte organisme er Drosophila melanogaster, og genotyperne er Notch-Knockin-GFP (kromosom X) og Sqh-sqh-GFP (kromosom II), generøst leveret af laboratorierne af henholdsvis Dr. Francois Schweisguth (Institute Pasteur) og Dr. Jennifer Zallen (Sloan Kettering Institute). Mens denne protokol primært fokuserer på aspekter af antistofmærkning og levende billeddannelse, henvises til offentliggjorte rapporter for mere detaljerede beskrivelser af Drosophila embryoopsamling og injektion15,16.
1. Fluorescerende mærkning af antistoffer
- Brug fortrinsvis monoklonale antistoffer eller nanobodies til proteinet af interesse. Forbered stamkoncentrationen af antistoffer ved 1 mg/ml eller højere.
BEMÆRK: I denne undersøgelse anvendes GFP nanobody (se materialetabel) som et eksempel. Den kommercielt tilgængelige GFP nanobody er pakket i en koncentration på 1,0 mg / ml og et volumen på 250 μL. Derudover anvendes et kommercielt tilgængeligt antistofmærkningssæt (se materialetabel), som konjugerer Alexa Fluor 594 til primære aminer af proteiner gennem en succinimidylesterreaktion11. Det er vigtigt, at denne mærkningsproces ikke signifikant ændrer antistofkoncentrationen. - Der fremstilles en 1 M natriumbicarbonatopløsning ved at resuspendere komponent B (medfølger i antistofmærkningssættet) i 1 ml deioniseret vand.
- Antistofkoncentrationen justeres til 1,0 mg/ml, og der tilsættes derefter 1/10volumen (10 μL for 100 μL GFP nanobody) af 1 M natriumbicarbonatopløsningen.
- Der tilsættes 110 μL af antistofblandingen (fra trin 1.3) direkte til røret, der indeholder Alexa Fluor 594-farvestoffet. Inverter for at blande (ikke hvirvel) og inkubere på en rotator i 1 time ved stuetemperatur.
- Saml rensningskolonnen fra konjugationssættet (se Materialetabel). Forbered et 1,5 ml harpiksleje (leveres i antistofmærkningssættet) og centrifuger søjlen ved 1100 x g i 3 minutter ved stuetemperatur (RT) for at fjerne overskydende væske fra harpiksen.
- Reaktionsblandingen (fra trin 1.4) tilsættes dråbevis til toppen af harpikssøjlen, og der centrifugeres ved 1100 x g i 5 minutter ved 4 °C for at opsamle det mærkede antistof. Det opsamlede antistof skal fremstå lyserødt, og volumenet skal være lidt mindre end 100 μL. Opbevares i folieindpakkede eller mørke rør ved 4 °C.
2. Forberedelse af Drosophila-embryoner
- Placer 200 nyklækkede voksne Drosophila i et plastcylinderformet bur (diameter = 5 cm, højde = 8 cm) med et forhold mellem mand og kvinde på 1: 10. Forsegl den ene side med porøst metalnet til ventilation og den anden side med en agarplade med frugtsaft/gærpasta.
- Skift pladen hver 12. time i tre dage før embryoopsamling. Dette muliggør synkronisering af Drosophila æglægning og forbedrer indsamlingseffektiviteten.
- På injektionsdagen skiftes buret til en frugtsaftplade med minimal gærpasta, og embryonerne opsamles ved 25 °C i 1 time. Hvis den første indsamlingsrunde ikke giver tilstrækkelige embryoner (<50 embryoner), kasseres den første plade, og dette trin gentages i en anden indsamlingsrunde, indtil der er lagt mere end 100 embryoner inden for 1 time.
- Pladen fjernes fra buret for at stoppe æglægningen og udruges ved 25 °C i yderligere 2 timer for at få embryoner, der er 2-3 timer gamle. Den korrekte fase af embryoner er afgørende for succesen med antistofinjektion.
- For at fjerne æggeskallen af embryoner tilsættes 2 ml 50% blegemiddel til frugtsaftpladen og løsner forsigtigt embryoner fra pladen ved hjælp af en pensel (figur 2A-4). Ofte vil embryoner blive lagt direkte oven på gærpastaen. I dette tilfælde er det acceptabelt at børste gærpastaen i blegemiddelopløsningen for at samle alle embryonerne.
- Inkuber de flydende embryoner i 50% blegemiddel i 2 minutter og hvirvler frugtsaftpladen hver 30. s for at forbedre effektiviteten af fjernelse af æggeskal.
- Embryo/blegemiddelblandingen overføres ved at hælde den i en 70 μm nyloncellesi (figur 2A-7). Vask embryonerne grundigt med en vandflaske for at fjerne eventuelle resterende blegemidler og gærpasta. Tør cellefilteret helt med køkkenrulle, og sørg for, at overskydende vand omkring embryonerne fjernes.
3. Embryojustering og udtørring
- Forbered en 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (bredde, længde, højde) 4% agarosegel (figur 2A-9) og lad gelen køle ned til stuetemperatur. Skær en agaroseblok på 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (bredde, længde, højde) ved hjælp af et rent barberblad, og placer blokken på et glasglas (figur 2A-2). Undersøg gelblokken under dissekeringsomfanget for at sikre, at kanterne skæres lige, og overfladen er flad og tør.
- Overfør embryoner fra silen til gelblokken ved hjælp af en pensel. Spred embryonerne jævnt langs blokkens midterlinje ved at børste forsigtigt. Ideelt set adskilles klynger af embryoner i enkelte eller dubletter uden at røre hinanden.
- Forbered en pincet med to ben tapet tæt sammen for at skabe en enkelt fin spids (figur 2A-5). Under et dissekerende omfang skal du hente individuelle embryoner ved hjælp af pincetten og placere dem langs den lange kant af gelblokken. Juster 20-30 embryoner, og sørg for, at deres forreste bageste akse er parallel med kanten (figur 2C).
- Afpipette 10 μL heptanlim (se materialetabel) i midten af et 24 mm x 50 mm dæksel (figur 2A-1), og fordel limen i et rektangulært område på 0,5 cm x 3 cm ved hjælp af en pipettespids. Vent til limen er helt tør inden brug.
- Placer glasobjektglasset med gelblokken ved kanten af skrivebordet med embryoner vendt udad. Løft dækselen med lim ved hjælp af en pincet med flad spids (figur 2A-6), og hold den stille oven på embryonerne med limsiden vendt mod embryonerne i en skrå vinkel på ca. 45 grader.
BEMÆRK: Tryk forsigtigt dæksedlen mod gelblokken, så embryonerne kommer i kontakt med limen, og slip derefter hurtigt trykket og løft dæksedlen. Mængden af spænding, der påføres, er kritisk, så embryoner stabilt kan fastgøres til limen uden at blive presset for hårdt og sprænge. - Afpipette 10 μL vand i midten af et nyt glasglas, og anbring dækslet med embryonerne oven på det, med siden af embryoet opad (figur 2B). Sørg for at bruge vand i stedet for neglelak eller anden klæbende lim til fastgørelse af dæksedlen til glasglasset, da denne side af dæksedlen placeres direkte oven på den konfokale linse til levende billeddannelse.
- Embryonerne tørres i et udtørringskammer (figur 2A-3) (se materialetabel) i 10-15 minutter, indtil vitellinmembranen rynker (figur 2E). Den krævede tid kan variere med rummets fugtighed og bør testes eksperimentelt for hver laboratorietilstand.
- Pipette 40 μL halocarbonolie (en blanding af type 27 og type 700 i forholdet 1:1 i volumen, se materialetabellen) i den ene ende af embryostrimlen. Vip diaset, indtil halocarbonolien dækker hele overfladen af embryonerne.
4. Antistofinjektion og billeddannelse
- Klargør et par injektionsglasnåle ved hjælp af en mikropipettetrækker (se materialetabellen for parameterindstillinger), og fyld hver nål med 5 μL AlexaFluor-mærket antistofopløsning (fra trin 1.6).
- Placer en 25 mm x 25 mm dæksel oven på et glasglas. Pipette 40 μL halocarbonolie og spred den langs kanten af dæksedlen.
- Under injektionsomfanget skal kanylespidsen rettes mod kanten af dæksedlen under olie. Juster picopumpens indsprøjtningslufttryk (se materialetabellen), så en pumpe genererer en boble fyldt med antistoffer. Boblediameteren skal begrænses til 20-50 μm (figur 2F).
- Udskift det tomme glasglas med et, der indeholder embryoner under olie. Spids af kanylen rettes vinkelret mod embryonernes forreste-bageste akse (figur 2D,G).
- Kontroller embryonernes stadium for at sikre, at de fleste har indledt cellularisering, men endnu ikke har startet gastrulation (trin 4 og trin 5), der forbliver som et syncytium (figur 2F, G).
BEMÆRK: Kendetegnende for dette trin er fraværet af riller eller folder og tilstedeværelsen af en ovalformet, mørkfarvet æggeblommesæk, der er synlig i midten af embryoet. Morfologisk karakterisering af embryostadiet under olie er baseret på bogkapitlet "Stadier af Drosophila embryogenese" af Volker Hartenstein17. - Brug X-Y-trinmanipulatoren til at flytte embryoner mod nålen, indtil spidsen ankommer til midten af æggeblommen. Pump to til tre gange for at injicere antistoffer i æggeblommen. Vellykket injektion indikeres ved hurtig forsvinden af vitellinmembranrynken, da embryoner får volumen fra antistofopløsningen (figur 2G).
- Brug X-Y-trinmanipulatoren til at flytte embryoner væk fra nålen efter injektion og bevæge sig nedad til det næste embryo. Gentag trin 6, indtil alle embryoner på objektglasset er injiceret.
- Glasglasset med injicerede embryoner overføres til et fugtighedskammer (figur 2A-8). Der inkuberes ved 25 °C, indtil det ønskede stadium af embryoudvikling er nået.
- Løft dækslet på 24 mm x 50 mm af glasglasset, og læg det direkte i mikroskopets diasholder. Den side, der ikke har embryoner, vil stå over for målene. Find embryonerne ved hjælp af en linse med lav forstørrelse under skarp feltbelysning, og skift til en 40x eller 63x linse til fluorescerende levende billeddannelse med høj opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere fordelene ved antistofinjektionsmetoden i forhold til fluorescerende tag-baseret levende billeddannelse eller immunofluorescens tilvejebringes to casestudier, der karakteriserer den dynamiske lokalisering af en transmembranreceptor med lav forekomst, Notch, og en type posttranslationel modifikation kaldet tyrosinphosphorylering i levende embryoner.
Notch signalaktivitet spiller en vigtig rolle i bestemmelse af celleskæbne under embryogenese og voksenorganhomeostase 18,19. Ved aktivering af dens ligander Delta / Jagged20 spaltes det intracellulære domæne af transmembranreceptoren Notch og frigives i kernen21, hvilket initierer nedstrøms transkriptionsprogrammer for at drive celleskæbneændringer22. Den statiske lokalisering af Notch-receptoren er blevet godt karakteriseret ved immunofluorescens i formaldehydfikserede væv. Imidlertid forbliver den dynamiske lokalisering af Notch under ligandbinding eller den intracellulære spaltningsproces stort set ukendt23 på grund af manglen på en metode til levende billeddannelse af dette relativt lave overflod protein på en højhastigheds måde. Her injicerede vi AlexaFluor-konjugeret GFP-nanobody i embryoner, der udtrykker GFP-mærket hak fra det endogene locus20. Uden injektion kan Notch-GFP næppe detekteres under standard levende billeddannelsesforhold, og det fluorescerende signal bleges hurtigt under time-lapse-billeddannelse. Efter injektion forbedres signal-støj-forholdet mellem Notch-receptoren signifikant, sammenligneligt med signalkvaliteten af immunofluorescens (figur 3A). Desuden muliggør antistofinjektion tidsmæssig karakterisering af Notch-lokalisering med 45 s intervaller uden et tilsyneladende tab af signalintensitet over et 5 minutters billeddannelsesvindue (figur 3B).
Tyrosinphosphorylering er en vigtig type posttranslationel proteinmodifikation, der medierer signaltransduktion i mange biologiske veje24. Meget specifikke monoklonale antistoffer (såsom PY20 og 4G10) mod phosphotyrosin (p-Tyr) er blevet udviklet til at karakterisere lokaliseringen og niveauerne af den samlede tyrosinphosphorylering ved hjælp af immunofluorescens og western blots25. Selvom ingen fluorescerende mærker kan spore fosforyleringsændringer, skal væv eller celler fikseres og farves eller lyseres og blottes på forskellige tidspunkter for at give snapshots af phosphoryleringsstatus over tid for at studere kinetikken af tyrosinphosphorylering ved signalaktivering26 (f.eks. Vækstfaktorbehandling). Tidsintervallet for denne fremgangsmåde er mindst et par minutter langt og i sagens natur unøjagtigt på grund af den variable tid, der kræves til procedurer såsom fiksering eller cellelyse.
Her fremlægges bevis for, at antistofinjektionsmetoden muliggør direkte visualisering af phosphoryleringsstatus i levende embryoner ved at spore lokalisering og intensitetsændringer af tyrosinphosphorylering med regelmæssige tidsintervaller på sekundniveau. AlexaFluor-konjugeret PY20-antistof blev injiceret i embryoner, der udtrykte GFP-mærket myosinlyskæde og udførte dobbeltfarvet levende billeddannelse med 45 s intervaller. Som det tidligere blev vist, er tyrosinphosphorylering stærkt beriget ved tricellulære kryds27, et mønster, der også rekapituleres ved immunofluorescens (figur 4A). Interessant nok afslørede levende billeddannelse også en ny, anden population af p-Tyr-signal under midten af den apikale membran, som ikke observeres ved hjælp af immunofluorescens (figur 4B). Gennem dobbeltfarvet billeddannelse blev det konstateret, at denne population af p-Tyr-signal er tæt på medial myosin (figur 4B, nærbilleder), en underpopulation af myosin28 , der ligeledes kun er udtalt under levende billeddannelsesforhold, men næppe påviselig ved hjælp af immunofluorescens. Derudover udviser den mediale population af p-Tyr lignende pulsatile koalescens- og spredningsmønstre (figur 4C), som tidligere vist for medial myosin28. Identiteten og funktionen af en medial subpopulation af p-Tyr er stadig ukendt. Sammen viser disse resultater, at antistofinjektionsmetoden i høj grad kunne supplere traditionelle tilgange til at karakterisere adfærd af proteiner med lav overflod og afsløre nye lokaliseringsmønstre, der kunne være blevet forstyrret under immunfluorescensprocessen.
Figur 1: Arbejdsproces for antistofinjektion. Skematisk arbejdsgang, der illustrerer de trin, der er involveret i antistofinjektionsmetoden. Hele processen, fra embryoindsamling til antistofinjektion, tager typisk omkring 4-5 timer at fuldføre. Efter antistofinjektion kan embryoner inkuberes i et fugtighedskammer til det ønskede udviklingsstadium før levende billeddannelse. AEL, efter æglægning; RT, stuetemperatur; Ab, antistof. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Embryojustering og injektion. (A) Oversigt over de ting, der kræves før injektion, herunder en dækseddel, glasglas, udtørringsboks, pensel, pincet, cellesi, fugtighedskammer og agarosegel. (B) Justerede embryoner fastgjort til heptanlim i midten af dæksedlen og anbragt oven på udtørringsperler. C) Justering af embryonernes anterior-posteriore akse parallelt med agarosegelens kant. (D) Oversigt over injektionsopsætningen. (E) Sammenligning af embryomorfologi før og efter udtørringsprocessen med fokus på rynken af vitellinmembranen efter udtørring. (F) Størrelsen af injektionsboblen efter et enkelt tryk på picopumpen. (G) Sammenligning af embryomorfologi før og efter antistofinjektion, der fremhæver forsvinden af membranrynker efter injektion. (E-G) blev optaget under en 10x forstørrelsesobjektivlinse ved hjælp af lysfeltmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Live billeddannelse af Notch-receptor i tidlige embryoner. (A) Lokalisering af endogent GFP-mærket Notch-receptor gennem immunofluorescens (venstre), direkte live imaging baseret på GFP-autofluorescens (midten) og AlexaFluor 594-konjugeret GFP-nanobodyinjektion (højre). (B) Dynamisk lokalisering af Notch-GFP afbildet med 45 s intervaller efter antistofinjektion. Alle billeder blev erhvervet med den forreste af embryonerne til venstre og den ventrale side nedad. Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Live billeddannelse af embryonale phosphotyrosinmønstre. (A) Lokalisering af phosphoryleret tyrosin (p-Tyr) i faste embryoner gennem immunofluorescens. (B) Lokalisering af p-Tyr (magenta) i levende embryoner, der udtrykker GFP-mærket myosin lyskæde (grøn). Den hvide stiplede boks angiver nærbilleder af den mediale population af phosphotyrosin og myosin under den apikale membran. Skalastænger = 10 μm. (C) Lokalisering af p-Tyr og GFP-myosin afbildet hver 45. s i levende embryoner. Hvide pile angiver den mediale population af p-Tyr og myosin. Alle billeder blev taget med den forreste af embryonerne til venstre og den ventrale side nedad. Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne præsenterede procedure skitserer den specialiserede metode til fluorescensmærkning med brugerdefinerede antistoffer og efterfølgende injektion i tidlige stadier af Drosophila-embryoner . Denne teknik letter visualisering i realtid af proteiner eller posttranslationelle modifikationer, der findes i lave mængder og typisk er vanskelige at observere gennem konventionelle GFP / mCherry-mærkningsmetoder.
Der bør udvises forsigtighed, når denne metode udvides til at omfatte kvantitative sammenligninger mellem vildtypeembryoner og mutante embryoner. Mens koncentrationen af primære og sekundære antistoffer kan holdes den samme mellem kontrol- og eksperimentelle grupper i immunofluorescens, kan mængden af injiceret antistof og mærkningseffektiviteten variere mellem embryoner. Derfor bør kvantitativ analyse begrænses til sporing af ændringer i fluorescerende intensitet over tid eller udførelse af korrelationsanalyse med signaler fra andre kanaler i samme embryo, når der udføres flerfarvet levende billeddannelse. For eksempel kan colokalisering og korrelationsanalyse udføres ved hjælp af p-Tyr- og myosinintensiteter27, mens p-Tyr-intensiteter ikke kan sammenlignes direkte mellem vildtype- og gen-X-knockdown-embryoner ved hjælp af antistofinjektionsmetoden.
I lighed med andre fluorescerende tag-baserede tilgange til at undersøge proteindynamik kan antistofbinding potentielt ændre aktiviteten, handlen eller lokaliseringen af målproteiner. Derfor foretrækkes monoklonale antistoffer eller nanobodies frem for polyklonale antistoffer til injektion. Fordi epitoperne af monoklonale antistoffer eller nanolegemer er veldefinerede, kan hvorvidt blokering af disse epitoper med antistoffer ændrer proteinaktiviteten, modelleres baseret på alfa-foldstrukturer12,25. På den anden side er epitoper af polyklonale antistoffer ikke præcist afgrænset, og deres binding kan potentielt ændre proteinlokalisering eller aktivitet, hvis katalytiske lommer eller signalpeptider af målproteiner blokeres. For det andet kan antistoffer genkende andre ikke-specifikke epitoper end målproteiner, især i betragtning af at der ikke er nogen "udvaskningstrin" her, som i immunofluorescens, for at fjerne ikke-specifikke bindinger med lavere affinitet. Derfor er det vigtigt at have kontrolgrupper, såsom injektion af antistoffer i celler, der mangler epitopen, for at kontrollere, om det observerede signal virkelig afspejler målproteinerne eller andre ikke-specifikke epitoper.
Injektionen af antistoffer adskiller sig ikke fra injektion af siRNA eller CRISPR gRNA'er med hensyn til eksperimentel opsætning. Derfor bør de fleste cellulære systemer, der er modtagelige for injektioner, være kompatible med antistofinjektionsmetoden. I Drosophila-embryoner er Alexa fluorkonjugerede antistoffer stabile under udvikling, og fluorescerende signaler forbliver detekterbare efter timers embryogenese. For andre systemer såsom Xenopus- eller Zebrafish-embryoner bør koncentrationen og injektionsvolumenet af antistoffer empirisk testes gennem serielle fortyndinger for at opnå ideel mærkningseffektivitet. Derudover kan alternative fluorescerende farvestoffer som ATTO10 potentielt tilbyde et bedre signal-støj-forhold og vandopløselighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Jennifer A. Zallen for at levere Sqh-GFP Drosophila-linjen og støtte til den indledende udvikling af denne teknik og Dr. Francois Schweisguth for at levere Notch-GFP Drosophila-linjen . Dette arbejde blev støttet af finansiering fra National Natural Science Foundation of China (32270809) til HH Yu, generøs økonomisk og personalestøtte fra School of Life Sciences, SUSTech og finansiering til Y. Yan fra Shenzhen Science and Technology Innovation Commission / JCYJ20200109140201722.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
References
- Coons, A. H.
- Arthur, G., et al.
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H.
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S.
- Kopan, R., Ilagan,, Ma, X. G. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P.
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
