Summary
פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.
Abstract
הדמיה של חלבונים בתאים חיים באמצעות GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) ותגים פלואורסצנטיים אחרים שיפרה מאוד את ההבנה של לוקליזציה של חלבונים, דינמיקה ותפקוד. בהשוואה לאימונופלואורסנציה, הדמיה חיה משקפת בצורה מדויקת יותר לוקליזציה של חלבונים ללא ממצאים פוטנציאליים הנובעים מקיבוע רקמות. חשוב לציין כי הדמיה חיה מאפשרת אפיון כמותי וזמני של רמות החלבונים ולוקליזציה, החיוניים להבנת תהליכים ביולוגיים דינמיים כגון תנועת תאים או חלוקתם. עם זאת, מגבלה עיקרית של גישות תיוג פלואורסצנטי היא הצורך ברמות ביטוי חלבון גבוהות מספיק כדי להשיג הדמיה מוצלחת. כתוצאה מכך, חלבונים פלואורסצנטיים רבים המתויגים אנדוגנית עם רמות ביטוי נמוכות יחסית אינם ניתנים לזיהוי. מצד שני, ביטוי חוץ רחמי באמצעות מקדמי נגיפים יכול לפעמים להוביל לחוסר לוקליזציה של חלבונים או שינויים תפקודיים בהקשרים פיזיולוגיים. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, מוצגת גישה המשתמשת בזיהוי חלבון בתיווך נוגדנים רגישים ביותר בעוברים חיים, ולמעשה מבצעת אימונופלואורסצנטיות ללא צורך בקיבוע רקמות. כהוכחה עקרונית, ניתן לדמיין בהצלחה קולטן Notch עם תג GFP אנדוגני שבקושי ניתן לגילוי בעוברים חיים לאחר הזרקת נוגדנים. יתר על כן, גישה זו הותאמה כדי להמחיש שינויים פוסט-תרגומיים (PTM) בעוברים חיים, המאפשרים לזהות שינויים זמניים בדפוסי זרחן טירוזין במהלך אמבריוגנזה מוקדמת ולחשוף תת-אוכלוסייה חדשה של פוספוטירוזין (p-Tyr) מתחת לקרומים אפיים. ניתן לשנות גישה זו כך שתתאים לנוגדנים ספציפיים אחרים לחלבון, ספציפיים לתגים או ספציפיים ל-PTM, ועליה להתאים לאורגניזמים אחרים הניתנים להזרקה או לקווי תאים. פרוטוקול זה פותח אפשרויות חדשות להדמיה חיה של חלבונים בעלי שפע נמוך או PTM שבעבר היה מאתגר לזהות באמצעות שיטות תיוג פלואורסצנטיות מסורתיות.
Introduction
אימונופלואורסנציה היא טכניקת אבן פינה בביולוגיה התאית המודרנית שפותחה במקור על ידי אלברט קונס, המאפשרת זיהוי מולקולות בתאי התא הטבעיים שלהן ואפיון ההרכבים המולקולריים של אברונים תת-תאיים או מכונות1. יחד עם מניפולציות גנטיות, immunofluorescence מסייע לבסס את הרעיון המקובל כיום כי לוקליזציה של חלבונים חיונית לתפקודו2. מלבד נוגדנים ראשוניים ספציפיים וצבעים פלואורסצנטיים בהירים, הצלחתה של טכניקה זו נשענת על תהליך מקדים בשם קיבוע וחדירה, המשמר מורפולוגיות תאיות, משתק אנטיגנים ומגביר את נגישות הנוגדנים למדורים תוך תאיים. באופן בלתי נמנע, תהליך הקיבוע והחדירה יהרוג תאים ויסיים את כל התהליכים הביולוגיים3. לכן, immunofluorescence רק מספק תמונות של מסע החיים של חלבונים. עם זאת, תהליכים ביולוגיים רבים כגון נדידת תאים וחלוקות הם דינמיים באופיים, ודורשים חקירה של התנהגויות חלבונים באופן מרחבי-זמני 4,5.
כדי לבחון דינמיקה של חלבונים באורגניזמים חיים, פותחו שיטות הדמיה חיות המבוססות על חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)6 ומיקרוסקופ קונפוקלי מהיר. בקצרה, ניתן לבצע מניפולציה גנטית של החלבון המעניין כדי להתיך אותו עם GFP7, ולאחר מכן לבטא אותו באופן אקטופי ממקדמי נגיפים או שמרים כגון ציטומגלווירוס (CMV)8 או רצף הפעלה במעלה הזרם (UAS)9. מכיוון ש-GFP הוא אוטופלואורסצנטי בטבעו, אין צורך בנוגדנים מצומדים לפלואורופור כדי לחשוף את הלוקליזציה של חלבוני המטרה, מה שעוקף את הצורך בתהליכים מקדימים של קיבוע או חלחול. במהלך שני העשוריםהאחרונים פותחו תגים פלואורסצנטיים המשתרעים על פני כל ספקטרום אורך הגל, המאפשרים הדמיה חיה מרובת צבעים של מספר חלבוני מטרה בו זמנית. עם זאת, בהשוואה לצבעים פלואורסצנטיים מהונדסים כימית כגון AlexaFluor או ATTO, האוטופלואורסצנטיות של חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית אלה חלשה יחסית ובלתי יציבה כאשר היא באה לידי ביטוי ממקדמים אנדוגניים, במיוחד במהלך הדמיה חיה על פני טווחי זמן ארוכים יותר10. בעוד שניתן למתן את המחסור הזה על ידי ביטוי יתר של חלבוני מטרה המתויגים באופן פלואורסצנטי, רבים מהם עם פעילויות אנזימטיות כגון קינאזות ופוספטזות משבשים באופן חמור תהליכים ביולוגיים נורמליים אם אינם באים לידי ביטוי ברמות פיזיולוגיות.
פרוטוקול זה מציג שיטה המאפשרת הארה של מטרות מבוססות נוגדנים במערך תמונה חיה, ולמעשה מאפשרת אימונופלואורסצנטיות ללא תהליך של קיבוע או חדירה (איור 1). באמצעות תגובת אמין ראשוניתפשוטה מבוססת NHS 11, ניתן להצמיד צבעים פלואורסצנטיים כגון AlexaFluor 488 או 594 עם כל נוגדן ראשוני או GFP/HA/Myc nanobody12. תוך ניצול תכונה התפתחותית שכל התאים העובריים של דרוזופילה חולקים ציטופלסמה משותפת בשלבהסינקיטיום 13, ניתן להשיג קשירה והארה של אנטיגן על פני עוברים שלמים לאחר הזרקת נוגדנים מצומדים. עם הרחבת ספריות של חלבונים מתויגים אנדוגניים הזמינים בדרוזופילה ובמערכות מודל אחרות14, שיטה זו יכולה להרחיב את היישומים של ספריות אלה על ידי חשיפת דינמיקה של חלבונים מתויגים פלואורסצנטית בשפע נמוך וחלבונים אחרים שאינם מתויגים פלואורסצנטית (HA/Myc-tagged) ברקמות חיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים נערכו בהתאם להנחיות ולאישור בית הספר למדעי החיים, אוניברסיטת SUSTech. האורגניזם המשמש הוא Drosophila melanogaster, והגנוטיפים הם Notch-Knockin-GFP (כרומוזום X) ו- Sqh-sqh-GFP (כרומוזום II), המסופקים בנדיבות על ידי מעבדותיהם של ד"ר פרנסואה שוויסגוט (מכון פסטר) וד"ר ג'ניפר זאלן (מכון סלואן קטרינג), בהתאמה. בעוד פרוטוקול זה מתמקד בעיקר בהיבטים של תיוג נוגדנים והדמיה חיה, אנא עיין בדוחות שפורסמו לתיאורים מפורטים יותר של איסוף עוברים דרוזופילה והזרקה 15,16.
1. תיוג פלואורסצנטי של נוגדנים
- רצוי, להשתמש נוגדנים חד שבטיים או ננו גופים עבור חלבון של עניין. הכינו את ריכוז הנוגדנים ב-1 מ"ג/מ"ל ומעלה.
הערה: במחקר זה, GFP nanone (ראה טבלה של חומרים) משמש כדוגמה. ננוני GFP הזמינים מסחרית ארוזים בריכוז של 1.0 מ"ג/מ"ל ובנפח של 250 מיקרוליטר. בנוסף, נעשה שימוש בערכה מסחרית לסימון נוגדנים (ראו טבלת חומרים), אשר מצמידה את Alexa Fluor 594 לאמינים ראשוניים של חלבונים באמצעות תגובת אסטר סוקסינימידיל11. חשוב לציין, תהליך תיוג זה אינו משנה באופן משמעותי את ריכוז הנוגדנים. - הכן תמיסת סודיום ביקרבונט 1 M על ידי השעיה מחדש של רכיב B (המסופק בערכת תיוג הנוגדנים) ב -1 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה.
- התאם את ריכוז הנוגדנים ל- 1.0 מ"ג / מ"ל, ולאחר מכןהוסף נפח של 1/10 (10 מיקרוליטר עבור ננו GFP של 100 מיקרוליטר) של תמיסת 1 M נתרן ביקרבונט.
- הוסף 110 μL של תערובת הנוגדנים (משלב 1.3) ישירות לצינור המכיל צבע Alexa Fluor 594. יש להפוך כדי לערבב (לא לערבב) ולדגור על מסובב במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- הרכיבו את עמודת הטיהור מערכת הצמידות (ראו טבלת חומרים). הכינו מיטת שרף בנפח 1.5 מ"ל (מסופקת בערכת סימון הנוגדנים) וצנטריפוגו את העמוד במהירות של 1100 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי להסיר עודפי נוזלים מהשרף.
- הוסף את תערובת התגובה (משלב 1.4) טיפה לראש עמוד השרף והצנטריפוגה ב 1100 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את הנוגדן המסומן. הנוגדן שנאסף צריך להופיע בצבע ורוד, והנפח צריך להיות מעט פחות מ -100 μL. יש לאחסן בצינורות עטופים בנייר כסף או בצבע כהה ב -4 מעלות צלזיוס.
2. הכנת עוברי דרוזופילה
- הניחו 200 דרוזופילה בוגרים שזה עתה בקעו בכלוב בצורת גליל פלסטיק (קוטר = 5 ס"מ, גובה = 8 ס"מ) עם יחס זכר-נקבה של 1:10. אטמו צד אחד ברשת מתכת נקבובית לאוורור ואת הצד השני בצלחת אגר ממרח פירות/שמרים.
- החליפו את הצלחת כל 12 שעות במשך שלושה ימים לפני איסוף העוברים. זה מאפשר סנכרון של הטלת ביצים Drosophila ומשפר את יעילות האיסוף.
- ביום ההזרקה, יש להחליף את הכלוב לצלחת מיץ פירות עם מינימום משחת שמרים ולאסוף עוברים בטמפרטורה של 25°C למשך שעה. אם סבב האיסוף הראשון אינו מניב מספיק עוברים (<50 עוברים), השליכו את הצלחת הראשונה וחזרו על שלב זה לסבב איסוף שני עד שיוטלו יותר מ-100 עוברים תוך שעה.
- מוציאים את הצלחת מהכלוב כדי לעצור את הטלת הביצים ודוגרים ב-25 מעלות צלזיוס למשך שעתיים נוספות כדי לקבל עוברים בני 2-3 שעות. השלב הנכון של העוברים הוא קריטי להצלחת הזרקת הנוגדנים.
- כדי להסיר את קליפת הביצה של עוברים, הוסיפו 2 מ"ל של אקונומיקה 50% לצלחת מיץ הפירות והוציאו בעדינות עוברים מהצלחת באמצעות מברשת צבע (איור 2A-4). לעתים קרובות, עוברים יונחו ישירות על גבי משחת השמרים. במקרה זה, מקובל להבריש את משחת השמרים לתמיסת אקונומיקה כדי לאסוף את כל העוברים.
- דוגרים על העוברים הצפים באקונומיקה של 50% למשך 2 דקות ומערבלים את צלחת מיץ הפירות כל 30 שניות כדי לשפר את יעילות הסרת קליפות הביצה.
- העבירו את תערובת העובר/אקונומיקה על-ידי מזיגה לתוך מסננת תאי ניילון בגודל 70 מיקרומטר (איור 2A-7). שטפו את העוברים ביסודיות באמצעות בקבוק מים כדי להסיר שאריות אקונומיקה ומשחת שמרים. יבשו את מסננת התאים לחלוטין עם מגבות נייר, וודאו שכל עודפי המים סביב העוברים מוסרים.
3. יישור עוברים וייבוש
- הכינו ג'ל אגרוז בגודל 5 ס"מ x 5 ס"מ x 0.5 ס"מ (רוחב, אורך, גובה) 4% (איור 2A-9) ואפשרו לג'ל להתקרר לטמפרטורת החדר. חתכו גוש אגרוז בגודל 1 ס"מ x 3 ס"מ x 0.5 ס"מ (רוחב, אורך, גובה) באמצעות סכין גילוח נקי והניחו את הבלוק על מגלשת זכוכית (איור 2A-2). בדקו את גוש הג'ל מתחת לטווח החיתוך כדי לוודא שהקצוות חתוכים ישר והמשטח שטוח ויבש.
- העבירו עוברים מהמסננת אל גוש הג'ל באמצעות מברשת צבע. פזרו את העוברים באופן שווה לאורך קו האמצע של הבלוק על ידי הברשה עדינה. באופן אידיאלי, אשכולות של עוברים מופרדים ליחידים או כפולים מבלי לגעת זה בזה.
- הכינו פינצטה עם שתי רגליים המודבקות זו לזו בחוזקה כדי ליצור קצה דק אחד (איור 2A-5). תחת טווח ניתוח, הרימו עוברים בודדים באמצעות הפינצטה והניחו אותם לאורך הקצה הארוך של גוש הג'ל. יישרו 20-30 עוברים, וודאו שהציר הקדמי-אחורי שלהם מקביל לקצה (איור 2C).
- דבק פיפטה 10 μL הפטן (ראו טבלת חומרים) במרכז מכסה בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ (איור 2A-1) ומורחים את הדבק לאזור מלבני בגודל 0.5 ס"מ x 3 ס"מ באמצעות קצה פיפטה. יש להמתין לייבוש מוחלט של הדבק לפני השימוש.
- הניחו את מגלשת הזכוכית עם גוש הג'ל בקצה השולחן, כשהעוברים פונים כלפי חוץ. הרימו את הכיסוי עם דבק באמצעות פינצטה שטוחה (איור 2A-6) והחזיקו אותו עדיין על גבי העוברים, כשצד הדבק פונה לכיוון העוברים בזווית הטיה של כ-45 מעלות.
הערה: לחץ בעדינות על הכיסוי כנגד גוש הג'ל כך שהעוברים יהיו במגע עם הדבק, ולאחר מכן שחרר במהירות את הלחץ והרם את הכיסוי. כמות המתח המופעלת היא קריטית כדי שניתן יהיה לחבר את העוברים ביציבות לדבק מבלי להילחץ חזק מדי ולהתפוצץ. - פיפטה 10 μL מים במרכז מגלשת זכוכית חדשה והניחו את הכיסוי עם העוברים מעליו, כשצד העובר פונה כלפי מעלה (איור 2B). יש להקפיד להשתמש במים במקום בלק או דבק דבק אחר להדבקת הכיסוי למגלשת הזכוכית, שכן צד זה של הכיסוי יונח ישירות על גבי העדשה הקונפוקלית לצורך הדמיה חיה.
- יבשו את העוברים בתא התייבשות (איור 2A-3) (ראו טבלת חומרים) במשך 10-15 דקות עד שהקרום הוויטליני יתקמט (איור 2E). הזמן הנדרש עשוי להשתנות עם לחות החדר ויש לבדוק אותו באופן ניסיוני עבור כל תנאי מעבדה.
- פיפטה 40 מיקרוליטר שמן הלוקרבון (תערובת מסוג 27 וסוג 700 ביחס של 1:1 בנפח, ראה טבלת חומרים) בקצה אחד של רצועת העובר. הטו את המגלשה עד ששמן ההלוקרבון יכסה את כל פני השטח של העוברים.
4. הזרקת נוגדנים והדמיה
- הכינו כמה מחטי זכוכית להזרקה באמצעות מושך מיקרופיפטה (ראו טבלת חומרים להגדרות הפרמטרים) וטענו כל מחט בתמיסת נוגדנים עם תווית AlexaFluor 5 μL (משלב 1.6).
- הניחו כיסוי בגודל 25 מ"מ x 25 מ"מ על גבי מגלשת זכוכית. פיפטה 40 μL של שמן halocarbon ולהפיץ אותו לאורך קצה הכיסוי.
- מתחת לטווח ההזרקה, יישרו את קצה המחט כנגד קצה הכיסוי מתחת לשמן. התאימו את לחץ האוויר בהזרקה של משאבת הפיקו (ראו טבלת חומרים) כך שמשאבה אחת תייצר בועה אחת מלאה בנוגדנים. קוטר הבועות צריך להיות מוגבל ל-20-50 מיקרומטר (איור 2F).
- החליפו את מגלשת הזכוכית הריקה במגלשה המכילה עוברים תחת שמן. יישרו את קצה מחט ההזרקה בניצב לציר הקדמי-אחורי של העוברים (איור 2D,G).
- בדקו את שלב העוברים כדי לוודא שרובם התחילו בצלולריזציה אך עדיין לא התחילו בגסטרולציה (שלב 4 ושלב 5), ונותרו כסינקיטיום (איור 2F,G).
הערה: סימן ההיכר של שלב זה הוא היעדר חריצים או קפלים ונוכחות של שק חלמון בצורת אליפסה, בצבע כהה הנראה במרכז העובר. אפיון מורפולוגי של שלב העובר תחת שמן מבוסס על פרק הספר "שלבים של אמבריוגנזה דרוזופילה" מאת פולקר הרטנשטיין17. - השתמש במניפולטור שלב X-Y כדי להזיז עוברים לכיוון המחט עד שהקצה מגיע למרכז החלמון. יש לשאוב פעמיים עד שלוש כדי להזריק נוגדנים לחלמון. הזרקה מוצלחת מסומנת על-ידי היעלמות מהירה של קמט קרום ויטלין כאשר עוברים צוברים נפח מתמיסת הנוגדנים (איור 2G).
- השתמש במניפולטור שלב X-Y כדי להזיז עוברים מהמחט לאחר ההזרקה ולעבור כלפי מטה לעובר הבא. חזור על שלב 6 עד להזרקת כל העוברים בשקופית.
- העבירו את שקופית הזכוכית עם עוברים מוזרקים לתא לחות (איור 2A-8). יש לדגור בטמפרטורה של 25°C עד להשגת השלב הרצוי של התפתחות העובר.
- הרימו את הכיסוי בגודל 24 מ"מ x 50 מ"מ, החליקו מעל מגלשת הזכוכית והניחו אותו ישירות במחזיק המגלשה של המיקרוסקופ. הצד ללא עוברים יעמוד מול המטרות. אתר את העוברים באמצעות עדשה בהגדלה נמוכה תחת תאורת שדה בהיר ועבור לעדשת 40x או 63x להדמיה חיה פלורסנטית ברזולוציה גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים את היתרונות של שיטת הזרקת הנוגדנים על פני הדמיה חיה מבוססת תג פלואורסצנטי או אימונופלואורסנציה, ניתנים שני מקרי מבחן המאפיינים את הלוקליזציה הדינמית של קולטן טרנסממברנה בשפע נמוך, Notch, וסוג של שינוי לאחר תרגום הנקרא זרחן טירוזין בעוברים חיים.
פעילות איתות חריץ ממלאת תפקיד מרכזי בקביעת גורל התא במהלך אמבריוגנזה והומאוסטזיס איברים בוגרים18,19. עם הפעלתו על ידי הליגנדות Delta/Jagged20, התחום התוך-תאי של הקולטן הטרנסממברנה Notch נבקע ומשוחרר לתוך גרעין21, ומתחיל תוכניות שעתוק במורד הזרם כדי להניע שינויים בגורל התא22. הלוקליזציה הסטטית של קולטן Notch התאפיינה היטב באימונופלואורסנציה ברקמות קבועות פורמלדהיד. עם זאת, הלוקליזציה הדינמית של Notch במהלך קשירת ליגנד או תהליך המחשוף התוך-תאי נותרה בלתי ידועה במידה רבה23, בשל היעדר שיטה להדמיה חיה של חלבון זה בשפע נמוך יחסית באופן במהירות גבוהה. כאן, הזרקנו ננוני GFP מצומדים של AlexaFluor לעוברים המבטאים Notch מתויג GFP מלוקוס20 האנדוגני. ללא הזרקה, Notch-GFP בקושי ניתן לגילוי בתנאי הדמיה חיים סטנדרטיים, והאות הפלואורסצנטי מלבין במהירות במהלך הדמיה בהילוך מהיר. לאחר ההזרקה, יחס האות לרעש של קולטן Notch משתפר באופן משמעותי, בדומה לאיכות האות של immunofluorescence (איור 3A). יתר על כן, הזרקת נוגדנים מאפשרת אפיון זמני של לוקליזציה של Notch במרווחים של 45 שניות, ללא אובדן נראה לעין של עוצמת האות בחלון הדמיה של 5 דקות (איור 3B).
זרחן טירוזין הוא סוג עיקרי של שינוי חלבון לאחר תרגום המתווך העברת אותות במסלולים ביולוגיים רבים24. נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים מאוד (כגון PY20 ו-4G10) כנגד פוספוטירוזין (p-Tyr) פותחו כדי לאפיין את הלוקליזציה ואת רמות הזרחן הכולל של טירוזין באמצעות אימונופלואורסנציה וכתמים מערביים25. בעוד שאין תגים פלואורסצנטיים שיכולים לעקוב אחר שינויים בזרחון, רקמות או תאים צריכים להיות קבועים ומוכתמים או מוכתמים בנקודות זמן שונות כדי לספק תמונות של מצב הזרחן לאורך זמן, כדי לחקור את הקינטיקה של זרחן טירוזין עם הפעלת אות26 (למשל, טיפול בגורם גדילה). מרווח הזמן של גישה זו הוא לפחות כמה דקות ולא מדויק מטבעו בשל הזמן המשתנה הדרוש להליכים כגון קיבוע או ליזה של תאים.
כאן, מוצגות ראיות לכך ששיטת הזרקת נוגדנים מאפשרת הדמיה ישירה של מצב הזרחן בעוברים חיים, מעקב אחר שינויי הלוקליזציה והעוצמה של זרחן טירוזין במרווחי זמן קבועים של שניות. נוגדן PY20 מצומד של AlexaFluor הוזרק לעוברים המבטאים שרשרת אור מיוזין מתויגת GFP וביצע הדמיה חיה בצבע כפול במרווחים של 45 שניות. כפי שהוצג בעבר, זרחן טירוזין מועשר מאוד בצמתים תלת-תאיים27, דפוס שגם הוא משוחזר על-ידי אימונופלואורסנציה (איור 4A). באופן מעניין, הדמיה חיה חשפה גם אוכלוסייה חדשה ושנייה של אות p-Tyr מתחת למרכז הממברנה האפיקאלית, שלא נצפתה באמצעות אימונופלואורסנציה (איור 4B). באמצעות דימות דו-צבעי, נמצא שאוכלוסייה זו של אות p-Tyr נמצאת בקרבת מיוזין מדיאלי (איור 4B, תקריבים), תת-אוכלוסייה של מיוזין28 שגם היא בולטת באופן דומה רק בתנאי הדמיה חיה, אך בקושי ניתנת לגילוי באמצעות אימונופלואורסצנציה. נוסף על כך, האוכלוסייה המדיאלית של p-Tyr מציגה דפוסי התלכדות ופיזור פולסאטיליים דומים (איור 4C), כפי שהוכח קודם לכן עבור מיוזין מדיאלי28. זהותה ותפקידה של תת-אוכלוסייה מדיאלית של p-Tyr עדיין אינם ידועים. יחד, תוצאות אלה מראות כי שיטת הזרקת הנוגדנים יכולה להשלים במידה רבה גישות מסורתיות לאפיון התנהגויות של חלבונים בשפע נמוך ולחשוף דפוסי לוקליזציה חדשים שעשויים היו להשתבש במהלך תהליך האימונופלואורסנציה.
איור 1: זרימת עבודה של הזרקת נוגדנים. זרימת עבודה סכמטית הממחישה את השלבים הכרוכים בשיטת הזרקת הנוגדנים. התהליך כולו, מאיסוף עוברים ועד הזרקת נוגדנים, אורך בדרך כלל כ-4-5 שעות. לאחר הזרקת נוגדנים, ניתן לדגור את העוברים בתא לחות לשלב ההתפתחות הרצוי לפני הדמיה חיה. AEL, לאחר הטלת ביצים; RT, טמפרטורת החדר; Ab, נוגדן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: יישור עובר והזרקתו. (A) סקירה כללית של הפריטים הנדרשים לפני ההזרקה, כולל כיסוי, מגלשת זכוכית, קופסת ייבוש, מברשת צבע, פינצטה, מסננת תאים, תא לחות וג'ל אגרוז. (B) עוברים מיושרים המחוברים לדבק הפטן במרכז הכיסוי ומונחים על גבי חרוזי התייבשות. (C) יישור הציר הקדמי-אחורי של העובר במקביל לקצה ג'ל האגרוז. (D) סקירה כללית של מערך ההזרקה. (E) השוואה של מורפולוגיית העובר לפני ואחרי תהליך הייבוש, תוך התמקדות בקמט של קרום ויטלין לאחר התייבשות. (F) גודל בועת ההזרקה לאחר לחיצה אחת על משאבת הפיקו. (G) השוואה של מורפולוגיית העובר לפני ואחרי הזרקת נוגדנים, תוך הדגשת היעלמות קמטי הממברנה לאחר ההזרקה. (E-G) צולמו תחת עדשה אובייקטיבית בהגדלה של פי 10 באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הדמיה חיה של קולטן Notch בעוברים מוקדמים. (A) לוקליזציה של קולטן Notch המתויג אנדוגנית ב-GFP באמצעות אימונופלואורסנציה (משמאל), הדמיה חיה ישירה המבוססת על אוטופלואורסנציה של GFP (באמצע), והזרקת ננוני GFP מצומדת של AlexaFluor 594 (מימין). (B) לוקליזציה דינמית של Notch-GFP במרווחים של 45 שניות לאחר הזרקת נוגדנים. כל התמונות נרכשו כאשר החלק הקדמי של העוברים משמאל והצד הגחוני פונה כלפי מטה. פסי קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיה חיה של דפוסי פוספוטירוזין עובריים. (A) לוקליזציה של טירוזין זרחני (p-Tyr) בעוברים קבועים באמצעות immunofluorescence. (B) לוקליזציה של p-Tyr (מגנטה) בעוברים חיים המבטאים שרשרת אור מיוזין עם תג GFP (ירוק). התיבה המקווקו הלבן מציינת תקריב של האוכלוסייה המדיאלית של פוספוטירוזין ומיוזין מתחת לקרום האפיקאלי. פסי קנה מידה = 10 מיקרומטר. (C) לוקליזציה של p-Tyr ו-GFP-מיוזין שצולמו כל 45 שניות בעוברים חיים. חיצים לבנים מציינים את האוכלוסייה המדיאלית של p-Tyr ומיוסין. כל התמונות צולמו כאשר החלק הקדמי של העוברים משמאל והצד הגחוני פונה כלפי מטה. פסי קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הליך מוצג זה מתאר את השיטה המיוחדת של תיוג פלואורסצנטי עם נוגדנים מותאמים אישית והזרקה לאחר מכן לעוברי דרוזופילה בשלב מוקדם. טכניקה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של חלבונים או שינויים לאחר תרגום הקיימים בכמויות נמוכות ובדרך כלל קשה לצפות בהם באמצעות שיטות תיוג GFP/mCherry קונבנציונליות.
יש לנקוט משנה זהירות בעת הרחבת שיטה זו כדי לבצע השוואות כמותיות בין עוברים מסוג בר ועוברים מוטנטיים. בעוד שריכוז הנוגדנים הראשוניים והמשניים יכול להישמר זהה בין קבוצת הביקורת לקבוצות הניסוי באימונופלואורסנציה, כמות הנוגדנים המוזרקים ויעילות ההתוויה עשויים להשתנות בין עוברים. לכן, ניתוח כמותי צריך להיות מוגבל למעקב אחר שינויים בעוצמה פלואורסצנטית לאורך זמן או ביצוע ניתוח מתאם עם אותות של ערוצים אחרים באותו עובר בעת ביצוע הדמיה חיה מרובת צבעים. לדוגמה, ניתן לבצע קולוקליזציה וניתוח קורלציה באמצעות עוצמות p-Tyr ומיוזין27, בעוד שעוצמות p-Tyr אינן ניתנות להשוואה ישירה בין עוברים מסוג פראי לבין עוברים מסוג gene-X באמצעות שיטת הזרקת נוגדנים.
בדומה לגישות אחרות המבוססות על תגים פלואורסצנטיים לבחינת דינמיקה של חלבונים, קשירת נוגדנים עשויה לשנות את הפעילות, הסחר או הלוקליזציה של חלבוני המטרה. לכן, נוגדנים חד שבטיים או ננו-גופים מועדפים על פני נוגדנים רב-שבטיים להזרקה. מכיוון שהאפיטופים של נוגדנים חד-שבטיים או ננו-גופים מוגדרים היטב, ניתן למדל אם חסימת אפיטופים אלה באמצעות נוגדנים משנה את פעילות החלבונים בהתבסס על מבנים של קפלי אלפא12,25. מצד שני, אפיטופים של נוגדנים רב-שבטיים אינם מוגדרים במדויק, והקישור שלהם עלול לשנות את לוקליזציה או פעילות החלבונים אם כיסים קטליטיים או פפטידים מאותתים של חלבוני מטרה חסומים. שנית, נוגדנים יכולים לזהות אפיטופים לא ספציפיים שאינם חלבוני מטרה, במיוחד בהתחשב בכך שאין כאן שלבי "שטיפה", כמו באימונופלואורסנציה, כדי להסיר קשירות לא ספציפיות בעלות זיקה נמוכה יותר. לכן, חשוב שיהיו קבוצות ביקורת, כגון הזרקת נוגדנים לתאים חסרי אפיטופ, כדי לוודא אם האות שנצפה באמת משקף את חלבוני המטרה או אפיטופים לא ספציפיים אחרים.
הזרקת נוגדנים אינה שונה מהזרקת siRNA או CRISPR gRNA מבחינת מערך הניסוי. לכן, רוב המערכות הסלולריות המקובלות להזרקות צריכות להיות תואמות לשיטת הזרקת הנוגדנים. בעוברי דרוזופילה , נוגדנים מצומדים אלקסה פלואור יציבים במהלך ההתפתחות, ואותות פלואורסצנטיים נשארים ניתנים לזיהוי לאחר שעות של אמבריוגנזה. עבור מערכות אחרות כגון עוברי קסנופוס או דגי זברה, יש לבדוק אמפירית את ריכוז ונפח ההזרקה של נוגדנים באמצעות דילול סדרתי כדי להשיג יעילות התוויה אידיאלית. בנוסף, צבעים פלואורסצנטיים חלופיים כגון ATTO10 עשויים להציע יחס אות לרעש ומסיסות מים טובים יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לד"ר ג'ניפר א. זאלן על אספקת קו Sqh-GFP Drosophila ותמיכה בפיתוח הראשוני של טכניקה זו, ולד"ר פרנסואה שוויסגוט על אספקת קו Notch-GFP Drosophila . עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32270809) ל- H.H.Yu, תמיכה כספית וצוות נדיבה מבית הספר למדעי החיים, SUSTech, ומימון ל- Y. Yan מ- Shenzhen Science and Technology Innovation Commission / JCYJ20200109140201722.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
References
- Coons, A. H.
- Arthur, G., et al.
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H.
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S.
- Kopan, R., Ilagan,, Ma, X. G. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P.
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
