Summary
استخدمنا السنكروترون التصوير المقطعي بالأشعة السينية في الإشعاع السنكروترون مرفق الأوروبي (ESRF) لغير جراحية إنتاج مجموعات بيانات 3D تصوير الشعاعي الطبقي مع دقة بكسل من 0.7μm. حجم باستخدام تقديم البرامج ، وهذا يسمح للتعمير الهياكل الداخلية في حالتها الطبيعية ، دون القطع الأثرية التي تنتجها sectioning النسيجية.
Abstract
ولا يعرف سوى القليل عن التنظيم الداخلي للالمفصليات الصغيرة مع العديد من أحجام الجسم أقل من 1 ملم. أسباب ذلك هي صغيرة الحجم وإهاب الثابت الذي يجعل من الصعب استخدام بروتوكولات الأنسجة الكلاسيكية. بالإضافة إلى ذلك ، sectioning النسيجي يدمر العينة وبالتالي لا يمكن استخدامها للمواد فريدة من نوعها. ومن هنا ، وهي طريقة غير المدمرة أمر مرغوب فيه والذي يسمح لعرضها داخل عينات صغيرة من دون الحاجة إلى sectioning.
استخدمنا السنكروترون التصوير المقطعي بالأشعة السينية في الإشعاع السنكروترون مرفق الأوروبي (ESRF) في غرونوبل (فرنسا) لغير جراحية إنتاج مجموعات بيانات 3D تصوير الشعاعي الطبقي مع دقة بكسل من 0.7μm. حجم باستخدام تقديم البرامج ، وهذا يسمح لنا لإعادة التنظيم الداخلي في حالته الطبيعية من دون القطع التي تنتجها sectioning النسيجية. ويمكن استخدام هذه الكمية موعد لالتشكل ، والمعالم ، أو لتصور أفلام الرسوم المتحركة لفهم بنية أجزاء الجسم الخفية واتباع نظم الجهاز كاملة أو أنسجة من خلال العينات.
Protocol
الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة
وقد أخذت عينات من oribatid بكرية التوالد سوس Archegozetes longisetosus (Acari ، Oribatida) من ثقافة مختبرنا. ثقافة تنمو على الجص باريس / مزيج الفحم (09:01) في جرار بلاستيكية ، في الظلام ثابتة عند 20-23 درجة مئوية مع ما يقرب من 90 ٪ من الرطوبة الجوية.
نموذج إعداد
- وقد أخذت عينات من الثقافة ، وتنظيفها بفرشاة الجميلة وضعت في خليط من الإيثانول 06:03:01 80 ٪ ، 35 ٪ الفورمالدهيد وحمض الخليك بنسبة 100 ٪ لمدة 24 ساعة.
- بعد ذلك ، كانت العينات المجففة في سلسلة متدرجة من الايثانول 70 ٪ ، 75 ٪ ، 80 ٪ ، 85 ٪ ، 90 ٪ ، 95 ٪ ، و 100 ٪ مع 3 تغييرات في كل التركيز ، و 10 دقيقة بين الخطوات.
- أخيرا ، وضعت نماذج جديدة في نقطة الإيثانول بنسبة 100 ٪ بين عشية وضحاها والحرجة المجففة في CO 2 (CPD 020 ، Balzers). كانت تعلق العينات المجففة لغيض من الدبابيس البلاستيكية (1.2 سم طويلة ؛ 3.0 مليمتر في القطر).
السنكروترون التصوير المقطعي بالأشعة السينية
أجري التصوير المقطعي بالأشعة السينية في ID19 beamline (ESRF ، غرينوبل ، فرنسا ، والتجربة SC - 2127).
- وقد شنت هذه العينات في صاحب العينة وتعديلها لمكانة مركزية في شعاع.
- تم قياس عينات من الطاقة مع 20.5 كيلو. سجلت الأشعة مع CCD تبريد (ESRF FReLoN الكاميرا) مع مجموعة 14 بت دينامية ، 2048 × 2048 بكسل وحجم البكسل الفعالة 0.7 ميكرون. وسجلت أكثر من 1500 إسقاطات تناوب 180 ° العينة مع الوقت تعرض ليالي 0.35 لكل التوقعات. وكشف عن المسافة إلى عينة 20 ملم.
باستخدام مسافة معينة بين العينة وكشف التصوير تمكن الفرق من المواد مع انخفاض معاملات توهين الأشعة السينية (Cloetens ، وآخرون 1996) ، والتي ستنتج في المقابل عدم كفاية الامتصاص التصوير (حيث يقع مباشرة أمام نموذج للكاشف ). معظم الأمور هي كائنات بيولوجية المرحلة ، التي تتألف من مواد ذات امتصاص منخفض و / أو الاختلافات صغيرة فقط من حيث العدد الذري (بيتز ، وآخرون ، 2007). ومع ذلك ، المرحلة المعززة يتطلب التصوير المقطعي التماسك العالية المكاني لشعاع الأشعة السينية متجانسة. لذلك ، هو أكثر ملاءمة من الإشعاع السنكروتروني سطح المكتب والماسحات الضوئية لهذا النوع من القياسات.
تحليل البيانات
- تحولت الصور الشعاعية الناتجة 2D إلى 3D فوكسل بيانات (8 بت رمادية القيم) مع خوارزمية الإسقاط الخلفي تصفيتها (Cloetens ، وآخرون ، 1997)
- وقد تم تحليل البيانات فوكسل مع ماكس VGStudio البرمجيات 1.2.1. (الرسومات وحدة التخزين ، هايدلبرغ ، ألمانيا).
- أزيلت غراي القيم من الخلفية من الرسم البياني لرؤية - 3D.
- واستخدمت محددة مسبقا الكاميرا مسارات لتوليد الرسوم المتحركة التناوب والطائرات لقطة متحركة.
- ولدت والمعرفة لمتابعة مسار الكاميرا الجهاز الهضمي أ. longisetosus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العرض ، وركزنا على التصور 3D للتشريح الداخلية لالمفصلية الدقيقة chelicerate. الأشعة السينية القياسات السنكروترون تسمح بكسل القرار من أسفل إلى 0.3μm ، اعتمادا على حجم العينة. هنا ، لقد أظهرنا البيانات مع 0.7μm بكسل القرار. عموما ، يمكن السنكروترون التصوير المقطعي بالأشعة السينية أن تكون مفيدة لتحليل المواد البيولوجية الصغيرة (أو الأنسجة) مع توهين الأشعة السينية المنخفضة. القرار بكسل تقريبا التي تصل إلى الفحص المجهري للضوء التقليدية. ويمكن تطبيق هذه التقنية إلى أي نوع من المواد التي التنظيم الداخلي هو من الفائدة والتي لا يجب أن دمرتها sectioning. sectioning النسيجي ، ومع ذلك ، لديه ميزة أنه يمكن الملون الأنسجة تفاضليا ، وهو غير ممكن مع التصوير المقطعي بالأشعة السينية. لكن هنا ، تختلف رمادية القيم تتوافق مع الأنسجة مع توهين الأشعة السينية المختلفة ، ويمكن توسيع نطاق توزيع رمادي القيمة باستخدام التصوير المقطعي الكمي المرحلة (holotomography ؛ Cloetens وآخرون ، 1999 ؛ Heethoff Cloetens و 2008). تقنية الأشعة السينية السنكروترون التصوير المقطعي هو قيمة استثنائية نظرا للأسباب التالية :
- إعداد نموذج سهل ويقتصر على تثبيت والتجفيف ، وليس من الضروري sectioning النسيجي
- هذه الطريقة غير الغازية : يمكن لاحظت التنظيم الداخلي للعينة في الحالة الطبيعية
- ويمكن تحليل مجموعة البيانات الناتجة في أي اتجاه المطلوب والذي يختلف من حيث sectioning النسيجي يتم إصلاح الأجزاء إلى اتجاه واحد.
نقترح النظر في هذا الأسلوب كلما الهياكل الداخلية في دولة طبيعية أو عينات صغيرة من العينات التي يجب أن لا تكون دمرت (على سبيل المثال ، في حفريات العنبر أو نوع العينات) وسيتم تحليلها. بطبيعة الحال ، لا يقتصر هذا الأسلوب على مواد بيولوجية ، ولكن هنا فإنه من أكبر ميزة بسبب إمكانية تحليل المواد مع الأشعة السينية التي تعاني من انخفاض الأشعة السينية التوهين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر بافو بيرغمان ، مايكل لومان ، وSchmelzle سيباستيان لمساعدتهم في ESRF. وأيد هذا العمل من قبل المشروع الأوروبي مرفق السنكروترون الإشعاع SC - 2127 من خلال تخصيص وقت شعاع.
References
- Betz, O., Wegst, U., Weide, D., Heethoff, M., Helfen, L., Lee, W. -K., Cloetens, P. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterial science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. J. Microscopy. 22, 51-71 (2007).
- Cloetens, P., Barrett, R., Baruchel, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Phase objects in synchrotron radiation hard X-ray imaging. J. Phys. D: Appl. Phys. 29, 133-146 (1996).
- Cloetens, P., Pateyron-Salome, M., Buffiere, J. Y., Peix, G., Baruchel, J., Peyrin, V., Schlenker, M. Observation in microstructure and damage in materials by phase sensitive radiography and tomography. J. Apll. Phys. 81, 5878-5886 (1997).
- Clotens, P., Ludwig, W., Baruchel, J., van Dyck, D., van Landyut, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Holotomography: quantitative phase tomography with micrometer resolution using hard synchrotron radiation X-rays. Appl. Phys. Lett. 75, 2912-2914 (1999).
- Heethoff, M., Cloetens, P. A Comparison of aynchrotron X-ray phase contrast tomography and holotomography for non-invasive investigations of the internal anatomy of mites. Soil Organisms. , (2008).
