Summary
Usamos síncrotron tomografia de raios-X no Laboratório Europeu de Radiação Síncrotron (ESRF) para não-invasiva produzir conjuntos de dados 3D tomográficos com um pixel de resolução de 0.7μm. Usando software de renderização de volume, o que permite a reconstrução de estruturas internas em seu estado natural, sem os artefatos produzidos por corte histológico.
Abstract
Pouco se sabe sobre a organização interna de muitos micro-artrópodes com tamanhos de corpo abaixo de 1 mm. As razões para isso são o pequeno tamanho ea cutícula dura que o torna difícil de usar protocolos de histologia clássica. Além disso, o corte histológico destrói a amostra e portanto, não pode ser usado para o material original. Assim, um método não-destrutivo é desejável que permite visão interna de pequenas amostras sem a necessidade de corte.
Usamos síncrotron tomografia de raios-X no Laboratório Europeu de Radiação Síncrotron (ESRF) em Grenoble (França) para não-invasiva produzir conjuntos de dados 3D tomográficos com um pixel de resolução de 0.7μm. Usando software de renderização de volume, o que nos permite reconstruir a organização interna em seu estado natural, sem os artefatos produzidos por corte histológico. Estas datas podem ser usados para a morfologia quantitativa, marcos, ou para a visualização de filmes de animação para compreender a estrutura de partes do corpo escondido e seguir sistemas de órgãos ou tecidos completa através das amostras.
Protocol
Animais utilizados neste estudo
Exemplares do ácaro oribatídeos partenogenéticos Archegozetes longisetosus (Acari, Oribatida) foram retirados de nossa cultura em laboratório. A cultura cresce em um gesso de Paris / mix de carvão vegetal (9:1) em frascos de plástico, no escuro constante em 20-23 ° C, com aproximadamente 90% da umidade do ar.
Preparação de amostras
- Espécimes foram retirados a partir da cultura, limpo com um pincel fino e colocado em uma mistura de etanol 06:03:01 80%, de formaldeído 35% e 100% de ácido acético por 24 horas.
- Posteriormente, as amostras foram desidratadas em uma série de etanol graduada de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% e 100% com 3 alterações em cada concentração, e 10 min entre as etapas.
- Finalmente, as amostras foram colocadas no ponto de etanol 100% durante a noite fresca e crítica secas em CO 2 (CPD 020, Balzers). Amostras secas foram anexados à ponta de pinos plásticos (1,2 cm de comprimento, 3,0 mm de diâmetro).
Síncrotron de raios-X a tomografia
X-ray tomografia foi realizada na linha de luz ID19 (ESRF, Grenoble, França, experiência SC-2127).
- As amostras foram montadas no porta-amostras e ajustada para uma posição central na viga.
- As amostras foram medidas com uma energia de 20,5 keV. As radiografias foram gravados com um CCD refrigerado (ESRF Frelon câmera) com uma gama dinâmica de 14 bits, 2048 × 2048 pixels e um tamanho de pixel efetiva de 0,7 mM. 1500 foram registrados projeções sobre a rotação da amostra 180 ° com um tempo de exposição de 0,35 s para cada projeção. A distância detector-de-amostra foi de 20 mm.
Usando uma certa distância entre a amostra eo detector permite uma imagem diferencial de materiais com baixos coeficientes de atenuação de raios-X (Cloetens, et al. 1996), o que produziria contraste insuficiente em imagem de absorção (onde a amostra é localizado diretamente em frente ao detector ). Assuntos mais biológicos são objetos fase, composta de materiais com baixa absorção e / ou apenas pequenas diferenças no número atômico (Betz, et al. 2007). No entanto, a fase de maior tomografia exige uma coerência alta espacial de um feixe de raios-X homogênea. Portanto, a radiação síncrotron é mais adequado do que desktop-scanners para este tipo de medidas.
Análise de dados
- As radiografias resultantes foram transformados em 2D para 3D de dados voxel (8 bits de cinza valores) com um algoritmo de retro-projeção filtrada (Cloetens, et al., 1997)
- Os dados voxel foram analisadas com o software Max vgstudio 1.2.1. (Graphics Volume, Heidelberg, Alemanha).
- Grey-valores do fundo foram retirados do histograma para visualização 3D.
- Pré-definidos câmera caminhos foram usados para gerar animações de rotação e planos de recorte animado.
- Um user-defined caminho de câmera foi gerada a seguir o sistema digestivo de A. longisetosus.
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Discussion
Nesta apresentação, nós nos concentramos na visualização 3D da anatomia interna de um chelicerate micro-artrópodes. O síncrotron de raios-X medidas permitem que um pixel de resolução de até 0.3μm, dependendo do tamanho da amostra. Aqui, mostramos dados com 0.7μm pixels de resolução. Geralmente, síncrotron tomografia de raios-X pode ser útil para analisar pequenas material biológico (ou tecidos), com atenuação de raios-X de baixa. O pixel de resolução quase alcança o de microscopia de luz convencional. A técnica pode ser aplicada a qualquer tipo de material que a organização interna é de interesse e que não deve ser destruído pelo corte. Corte histológico, no entanto, tem a vantagem que os tecidos podem ser marcadas diferencialmente, que não é possível com a tomografia de raios-X. Mas aqui, diferente de cinza valores correspondem aos tecidos com atenuação de raios-X diferentes, ea distribuição de cinza valor pode ser expandida usando tomografia fase quantitativa (holotomography;. Cloetens et al, 1999; Heethoff & Cloetens, 2008). A técnica de síncrotron de raios-X a tomografia é extraordinário valiosos devido às seguintes razões:
- preparação de amostras é fácil e limitado a fixação e secagem, não corte histológico é necessário
- o método é não-invasiva: a organização interna da amostra pode ser observada em estado natural
- o conjunto de dados resultantes podem ser analisados em qualquer orientação desejada, que é diferente do corte histológico, onde as seções são fixados em uma orientação.
Sugerimos considerar esta técnica sempre que as estruturas internas no estado natural de amostras pequenas ou de amostras que não deve ser destruído (por exemplo, os fósseis em âmbar ou tipo de amostras) devem ser analisados. É claro, esta técnica não se restringe a materiais biológicos, mas aqui é da maior vantagem devido à possibilidade de analisar os materiais com raios-X que tem atenuação de raios-X de baixa.
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Acknowledgments
Agradecemos a Paavo Bergmann, Michael Laumann, e Sebastian Schmelzle por sua ajuda no ESRF. Este trabalho foi financiado pelo projecto European Synchrotron Radiation Facility SC-2127 através da alocação de tempo de feixe.
References
- Betz, O., Wegst, U., Weide, D., Heethoff, M., Helfen, L., Lee, W. -K., Cloetens, P. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterial science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. J. Microscopy. 22, 51-71 (2007).
- Cloetens, P., Barrett, R., Baruchel, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Phase objects in synchrotron radiation hard X-ray imaging. J. Phys. D: Appl. Phys. 29, 133-146 (1996).
- Cloetens, P., Pateyron-Salome, M., Buffiere, J. Y., Peix, G., Baruchel, J., Peyrin, V., Schlenker, M. Observation in microstructure and damage in materials by phase sensitive radiography and tomography. J. Apll. Phys. 81, 5878-5886 (1997).
- Clotens, P., Ludwig, W., Baruchel, J., van Dyck, D., van Landyut, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Holotomography: quantitative phase tomography with micrometer resolution using hard synchrotron radiation X-rays. Appl. Phys. Lett. 75, 2912-2914 (1999).
- Heethoff, M., Cloetens, P. A Comparison of aynchrotron X-ray phase contrast tomography and holotomography for non-invasive investigations of the internal anatomy of mites. Soil Organisms. , (2008).
