Summary
Nous avons utilisé synchrotron tomographie par rayons X à l'European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) pour produire de manière non invasive en 3D des jeux de données tomographiques avec un pixel résolution de 0.7μm. En utilisant le logiciel de rendu de volume, ce qui permet la reconstruction des structures internes dans leur état naturel sans les artefacts produits par sectionnement histologique.
Abstract
On connaît mal l'organisation interne de nombreux micro-arthropodes du corps avec des tailles inférieures à 1 mm. Les raisons en sont la petite taille et la cuticule dure ce qui rend difficile d'utiliser des protocoles de l'histologie classique. En outre, les coupes histologiques détruit l'échantillon et ne peut donc pas être utilisé pour matériau unique. Ainsi, une méthode non destructive est souhaitable qui permet de visualiser l'intérieur de petits échantillons sans avoir besoin de sectionnement.
Nous avons utilisé synchrotron tomographie par rayons X à l'European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) à Grenoble (France) à la non-invasive de produire des ensembles de données 3D tomographique avec une résolution de pixel 0.7μm. En utilisant le logiciel de rendu de volume, ce qui nous permet de reconstituer l'organisation interne dans son état naturel sans les artefacts produits par sectionnement histologique. Ces date peut être utilisé pour la morphologie quantitative, des repères, ou pour la visualisation de films d'animation pour comprendre la structure des parties du corps cachés et de suivre les systèmes d'organes ou de tissus complète à travers les échantillons.
Protocol
Les animaux utilisés dans cette étude
Les spécimens de la parthénogénétiques oribates acariens Archegozetes longisetosus (Acari, Oribatides) ont été prises à partir de notre culture en laboratoire. La culture pousse sur un plâtre de Paris / mix charbon (9:1) dans des pots en plastique, dans l'obscurité constante à 20-23 ° C avec environ 90% d'humidité de l'air.
La préparation des échantillons
- Les échantillons ont été prélevés dans la culture, nettoyé avec un pinceau fin et placé dans un mélange 06:03:01 d'éthanol 80%, formaldéhyde 35% et 100% d'acide acétique pendant 24 heures.
- Ensuite, les échantillons ont été déshydratés dans une série d'éthanol à 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% et 100% avec 3 changements à chaque concentration, et à 10 min entre les étapes.
- Enfin, les échantillons ont été placés au point éthanol frais de 100% durant la nuit et critique séchées en CO 2 (CPD 020, Balzers). Les spécimens séchés étaient attachés à l'extrémité des broches en plastique (1,2 cm de long, 3,0 mm de diamètre).
Synchrotron tomographie par rayons X
Tomographie par rayons X a été réalisée à ligne de lumière ID19 (ESRF, Grenoble, France, expérimenter SC-2127).
- Les échantillons ont été montés dans le porte-échantillon et ajustée à une position centrale dans le faisceau.
- Les échantillons ont été mesurées avec une énergie de 20,5 keV. Les radiographies ont été enregistrées avec un CCD refroidie (ESRF FRELON caméra) avec une gamme dynamique de 14 bits, 2048 × 2048 pixels et une taille de pixels effectifs de 0,7 um. 1500 projections ont été enregistrées au cours de la rotation de 180 ° de l'échantillon avec un temps d'exposition de 0,35 s pour chaque projection. La distance de détection à l'échantillon était de 20 mm.
Utiliser une certaine distance entre l'échantillon et le détecteur permet une imagerie différentielle des matériaux à faible coefficient d'atténuation des rayons X (Cloetens, et al. 1996), qui produirait un contraste insuffisant en matière d'imagerie d'absorption (où l'échantillon est situé directement en face du détecteur ). La plupart des questions biologiques sont des objets de phase, composée de matériaux avec une faible absorption et / ou seulement de petites différences dans le numéro atomique (Betz et al. 2007). Cependant, la phase amélioré la tomographie de cohérence exige une haute résolution spatiale d'une homogénéité faisceau de rayons X. Par conséquent, le rayonnement synchrotron est mieux adaptée que les scanners de bureau pour ce genre de mesures.
L'analyse des données
- Les radiographies résultant 2D ont été transformées en données 3D voxel (8-bit des valeurs de gris) avec une rétroprojection filtrée algorithme (Cloetens, et al., 1997)
- Les données ont été analysées voxel avec le logiciel Max vgstudio 1.2.1. (Graphics tome, Heidelberg, Allemagne).
- Gris-valeurs de l'arrière-plan ont été retirés de l'histogramme pour visualisation 3D.
- Pré-définis caméra chemins ont été utilisés pour générer des animations de rotation et de plans de découpe animée.
- Un chemin défini par l'utilisateur caméra a été généré à suivre le système digestif de A. longisetosus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans cette présentation, nous nous sommes concentrés sur la visualisation 3D de l'anatomie interne d'un micro-chelicerate arthropodes. Les rayons X synchrotron mesures permettent un pixel-résolution allant jusqu'à 0.3μm, selon la taille de l'échantillon. Ici, nous avons montré des données avec 0.7μm pixels de résolution. Généralement, synchrotron tomographie aux rayons X peut être utile pour analyser de petits matériels biologiques (ou des tissus) avec un faible atténuation des rayons X. Les pixels de résolution atteint presque celle de la microscopie optique conventionnelle. La technique peut être appliquée à tout type de matériel pour lequel l'organisation interne est de l'intérêt et qui ne doit pas être détruit par sectionnement. Sectionnement histologique, cependant, a l'avantage que les tissus peuvent être colorées différemment, ce qui n'est pas possible avec tomographie par rayons X. Mais ici, différents gris-valeurs correspondent à des tissus avec différentes atténuation des rayons X, et la distribution gris-valeur peut être étendu en utilisant la tomographie de phase quantitative (holotomographie;. Cloetens et al, 1999; Heethoff & Cloetens, 2008). La technique du synchrotron tomographie par rayons X est extraordinaire précieuses pour les raisons suivantes:
- préparation de l'échantillon est facile et limité à la fixation et de séchage, aucune coupe histologique est nécessaire
- la méthode est non invasive: l'organisation interne de l'échantillon peut être observé à l'état naturel
- l'ensemble de données résultant peut être analysé dans toute orientation désirée qui est différent de sectionnement histologique où les sections sont fixés à une seule orientation.
Nous proposons de considérer cette technique lorsque les structures internes à l'état naturel de petits échantillons ou des échantillons qui ne doit pas être détruit (par exemple, des fossiles dans l'ambre ou le type-échantillons) doivent être analysés. Bien sûr, cette technique ne se limite pas au matériel biologique, mais ici il est le plus grand avantage en raison de la possibilité d'analyser les matériaux avec des rayons X qui ont une faible atténuation des rayons X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nous remercions Paavo Bergmann, Michael Laumann, et Sebastian Schmelzle pour leur aide à l'ESRF. Ce travail a été soutenu par le projet European Synchrotron Radiation Facility SC-2127 par l'attribution de temps de faisceau.
References
- Betz, O., Wegst, U., Weide, D., Heethoff, M., Helfen, L., Lee, W. -K., Cloetens, P. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterial science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. J. Microscopy. 22, 51-71 (2007).
- Cloetens, P., Barrett, R., Baruchel, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Phase objects in synchrotron radiation hard X-ray imaging. J. Phys. D: Appl. Phys. 29, 133-146 (1996).
- Cloetens, P., Pateyron-Salome, M., Buffiere, J. Y., Peix, G., Baruchel, J., Peyrin, V., Schlenker, M. Observation in microstructure and damage in materials by phase sensitive radiography and tomography. J. Apll. Phys. 81, 5878-5886 (1997).
- Clotens, P., Ludwig, W., Baruchel, J., van Dyck, D., van Landyut, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Holotomography: quantitative phase tomography with micrometer resolution using hard synchrotron radiation X-rays. Appl. Phys. Lett. 75, 2912-2914 (1999).
- Heethoff, M., Cloetens, P. A Comparison of aynchrotron X-ray phase contrast tomography and holotomography for non-invasive investigations of the internal anatomy of mites. Soil Organisms. , (2008).
