Summary
Biz non-invaziv 0.7μm piksel çözünürlüğe sahip 3D tomografik veri setleri üretmek için Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi (ESRF) sinkrotron X-ışını tomografisi kullanılır. Volume rendering yazılımı kullanarak, bu histolojik kesit tarafından üretilen eserler olmadan kendi doğal devlet iç yapıları yeniden inşası sağlar.
Abstract
Küçük vücut boyutları ile 1 mm altında bir çok mikro-eklembacaklılar iç organizasyonu hakkında da bilinir. Nedenleri, küçük boyutlu ve zor klasik histoloji protokollerini kullanacak şekilde sabit manikür. Buna ek olarak, histolojik kesit örneği yok eder ve bu nedenle, eşsiz bir malzeme için kullanılan olamaz. Bu nedenle, tahribatsız bir yöntem tercih edilir kesit gerek kalmadan küçük örnekler içinde görüntülemenize olanak verir.
Grenoble (Fransa), non-invaziv 0.7μm piksel çözünürlüğe sahip 3D tomografik veri setleri üretmek Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi (ESRF) sinkrotron X-ışını tomografisi kullanılır. Volume rendering yazılımları kullanarak, bu bize histolojik kesit tarafından üretilen eserler olmadan doğal haliyle iç organizasyonunu yeniden sağlar. Bu tarih, gizli vücut parçaları yapısını anlamak için, tam bir organ sistemleri ya da doku ve örnekler üzerinden takip etmek kantitatif morfolojisi, yerler, ya da animasyon filmlerin gösterimi için kullanılabilir.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan hayvanların
Parthenogenetic oribatid akar Archegozetes longisetosus (Acari, Oribatida) örnekleri laboratuvar kültür alınmıştır. Kültür 20-23 sürekli karanlıkta, Paris / plastik kavanoz içinde kömür karışımı (9:1) bir sıva üzerine büyür ° C, hava nemi yaklaşık% 90 ile.
Örnek hazırlama
- Örnekler, ince bir fırça ile temizlenmeli ve 24 saat boyunca% 80 etanol,% 35 formaldehit ve% 100 asetik asit karışımı 06:03:01 yerleştirilen, kültür alınmıştır.
- Daha sonra, örneklerin her konsantrasyonda 3 değişiklikleri ve adımlar arasındaki 10 dakika ile kademeli bir etanol dizi% 70,% 75,% 80,% 85,% 90,% 95 ve% 100 susuz edildi.
- Son olarak, örnekler, CO 2 kurutulmuş taze% 100 etanol gecelik ve kritik nokta (CPD 020, Balzers) yerleştirildi. Kurutulmuş numuneler plastik pimleri ucu (çapı 3.0 mm uzunluğunda 1.2 cm) bağlanmıştır.
Sinkrotron X-ışını tomografisi
X-ışını tomografisi beamline ID19 (ESRF, Grenoble, Fransa, deney SC-2127) yapıldı.
- Örnekler, örnek tutucu monte ve ışın merkezi bir konumda yer ayarlandı.
- Örnekleri 20.5 keV enerji ile ölçüldü. Radyografi ile soğutmalı CCD bir 14-bit dinamik aralık (ESRF FReLoN kamera), 2048 × 2048 piksel, 0.7 mikron etkili bir piksel boyutunda kaydedildi. 1500 projeksiyonları, her bir projeksiyon için 0.35 saniyelik bir pozlama süresi ile 180 ° örnek rotasyon kaydedildi. Dedektör-örnek mesafesi 20 mm idi.
Örnek ve dedektör arasında belli bir mesafe kullanılması, (örnek dedektör önünde doğrudan nerede emme görüntüleme yetersiz kontrast üretmek düşük X-ışını zayıflatma katsayıları (Cloetens, ve ark 1996), malzemelerin bir diferansiyel görüntüleme sağlar .) En biyolojik konularda düşük emilim ve / veya atom numarası sadece küçük farklılıklar (Betz, ve ark 2007) materyallerden oluşan faz nesneler,. Ancak, faz gelişmiş tomografi homojen bir X-ışını yüksek bir mekansal tutarlılığı gerektirir. Bu nedenle, bu tür ölçümler için daha iyi sinkrotron ışınımı masaüstü tarayıcılar daha uygundur.
Veri analizi
- Filtrelenmiş bir arka projeksiyon algoritması (Cloetens ve ark, 1997) ile sonuçlanan 2D radyografileri 3D voksel verileri (8-bit gri değerler) dönüştürülmüştür.
- Voksel veri, yazılım VGStudio Max 1.2.1 ile analiz edildi. (Cilt Grafik, Heidelberg, Almanya).
- Arka plan Gri-değerleri 3D görselleştirme için histogram çıkarıldı.
- Ön tanımlı kamera yolları dönme animasyonlar ve animasyonlu kırpma uçaklar üretmek için kullanılır.
- Bir kullanıcı tanımlı kamera yolu A. sindirim sistemi takip için oluşturulan longisetosus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu sunumda, chelicerate bir mikro-eklembacaklıların iç anatomi 3D görselleştirme odaklandı. Sinkrotron X-ray ölçümleri örnek büyüklüğüne bağlı olarak, 0.3μm bir piksel çözünürlük aşağı izin. Burada, 0.7μm piksel çözünürlüklü veri göstermiştir. Genellikle, sinkrotron X-ışını tomografisi düşük X-ışını zayıflama küçük biyolojik maddeler ya da doku analizi için yararlı olabilir. Piksel çözünürlük, neredeyse geleneksel ışık mikroskobu ulaşır. Iç organizasyon ilgi olduğu ve kesit tarafından imha edilmesi gereken malzeme her türlü tekniği uygulanabilir. Histolojik kesit, ancak, dokuların X-ışını tomografisi ile mümkün değildir, farklı lekeli olabilir ki bir avantaja sahiptir. Ama burada, farklı gri değerleri farklı X-ışını zayıflama ile dokulara uygun, gri değer dağılımı kantitatif faz tomografi kullanılarak genişletilebilir (holotomography; Cloetens ve ark, 1999; Heethoff & Cloetens, 2008). Sinkrotron X-ışını tomografisi tekniği aşağıdaki nedenlerden dolayı olağanüstü değerli:
- kolay numune hazırlama ve fiksasyon ve kurutma sınırlı, histolojik kesit gerekli
- yöntem, non-invaziv: numunenin iç örgütlenmesi, doğal bir durum görülebilir
- dataset bölümleri tek yönlü sabit histolojik kesit farklı herhangi bir istenen yönde analiz edilebilir.
Küçük örneklerinin ya da (örneğin, kehribar ya da tip örneklerin fosilleri) tahrip edilmemelidir örneklerin doğal devlet iç yapılarını analiz edilecek zaman bu tekniği dikkate öneririz. Tabii ki, bu tekniğin, biyolojik materyaller sınırlı değil, ama burada en büyük avantajı düşük X-ray zayıflama X-ışınları ile malzeme analiz olasılığı nedeniyle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Paavo Bergmann, Michael Laumann ve Sebastian Schmelzle ESRF de yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma, ışın zaman tahsisi yoluyla Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi projesi SC-2127 tarafından desteklenmiştir.
References
- Betz, O., Wegst, U., Weide, D., Heethoff, M., Helfen, L., Lee, W. -K., Cloetens, P. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterial science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. J. Microscopy. 22, 51-71 (2007).
- Cloetens, P., Barrett, R., Baruchel, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Phase objects in synchrotron radiation hard X-ray imaging. J. Phys. D: Appl. Phys. 29, 133-146 (1996).
- Cloetens, P., Pateyron-Salome, M., Buffiere, J. Y., Peix, G., Baruchel, J., Peyrin, V., Schlenker, M. Observation in microstructure and damage in materials by phase sensitive radiography and tomography. J. Apll. Phys. 81, 5878-5886 (1997).
- Clotens, P., Ludwig, W., Baruchel, J., van Dyck, D., van Landyut, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Holotomography: quantitative phase tomography with micrometer resolution using hard synchrotron radiation X-rays. Appl. Phys. Lett. 75, 2912-2914 (1999).
- Heethoff, M., Cloetens, P. A Comparison of aynchrotron X-ray phase contrast tomography and holotomography for non-invasive investigations of the internal anatomy of mites. Soil Organisms. , (2008).
