Labeling retrógrada de células ganglionares da retina através da aplicação de Fluoro-Gold na superfície do colículo superior

Summary

Este vídeo descreve o método de rotulagem retrógrado de RGC aplicando fluoro-gold (FG) na superfície do colículo superiores (SC). Técnica envolve a perfuração do crânio, aspiração do córtex, e aplicação de esponja de gelatina sobre a superfície dorsal de toda SC.

Abstract

Contagem de células ganglionares da retina (RGC) é essencial para avaliar a degeneração da retina especialmente em glaucoma. Rotulagem RGC confiável é fundamental para avaliar os efeitos de qualquer tratamento. Em ratos, cerca de 98% do RGCs é conhecido por projeto para o colículo contralateral superior (SC) (Forrester e Peters, 1967). Aplicando fluoro-gold (FG) na superfície de SC pode rotular quase todos os RGCs, para que possamos concentrar-se neste neurônio mais vulneráveis ​​da retina em glaucoma. FG é ocupada pelos terminais dos axônios de células ganglionares da retina bilateralmente e transportados retrogradamente à sua somas na retina. Compare com rotulagem retrógrado de RGC colocando FG no coto do nervo óptico seccionado por 2 dias, a interferência de sobrevivência RGC é minimizado. Compare com coloração violeta cresil que as manchas RGCs, células amácrinas e endotélio dos vasos sanguíneos na camada de células ganglionares da retina, este método de marcação é mais específico para o RGC. Este vídeo descreve o método de rotulagem retrógrado de RGC aplicando FG sobre a superfície de SC. Os procedimentos cirúrgicos incluem a perfuração do crânio; aspiração do córtex para expor a SC e aplicação de esponja de gelatina sobre a superfície dorsal inteiro de SC são mostrados. Dicas úteis para evitar hemorragia intracraniana maciça e aspiração do SC foram dadas.

Protocol

1. Anestesiar o rato por injeção intra-peritoneal de cetamina (80mg/kg) e xilazina (8mg/kg) (relação de volume de 2:1). Aplicar pomada lubrificante estéril olho para evitar o ressecamento das córneas durante a cirurgia.
2. Raspar os pêlos da cabeça (do olho ao nível do ouvido) e fixar a cabeça no palco cabeça por uma cabeça de fixação e defina seu incisivos na barra incisivo.
3. A área de operação desinfectados com solução de iodo povidona 10% seguido pelo álcool 70%.
4. Cortar a pele e os músculos para expor crânio e suturas (sagital, coronal e transversal suturas) (Figura 1). Aplicar analgésico, bupivicaine como um respingo para a área de incisão (não exceder 2 mg / kg).
5. Furar um buraco crânio (ø mm 2x2, 0,5 mm de ambas as suturas sagital e transversal) de cada lado da sutura sagital. Evitar a ruptura das meninges e do seio deitada debaixo das suturas.
   
   
   Figura 1. Marcas no crânio de ratos vivos.
   
   
6. Cortar as meninges por tesouras primavera, evitar rasgar.
7. Aspirar o conteúdo cerebral que se encontra sobre a superfície dorsal do colículo superior cuidadosamente pela bomba de vácuo e três pontos de verificação podem ser observadas:
   1. a cor do tecido cerebral muda de cinza para branco ao cinza
   2. parar quando a aspiração do líquido cefalorraquidiano incolor sair
   3. cuidadosamente ampliar o nível mais baixo de sucção horizontal para expor o colículo amarelada superiores abrangidos pela dura
8. Aspirar o conteúdo do cérebro ao longo SC até quatro bordas de SC podem ser observados diretamente sob o microscópio. A porção do córtex cerebral removido deve ser o mínimo para evitar efeitos colaterais indesejáveis ​​(por exemplo, disfunção motora). Tenha cuidado para não tocar o seio.
9. Absorver o líquido no buraco com listra fina de algodão estéril para tornar a superfície do SC tão seca quanto possível. Em seguida, coloque uma camada fina de gelatina esponja pré-embebidas com 6% Fluoro-Gold na superfície de SC (FG é absorvido pelos terminais dos axônios de células ganglionares da retina bilateralmente e transportados retrogradamente à sua somas na retina).
10. Encha o buraco com gelfoam e fechar a ferida da pele com clips de sutura.
11. Os animais foram autorizados a se recuperar com luz incandescente para manter aquecido. Analgésico, a buprenorfina (100mcg/kg), é aplicada por via oral na água de beber durante 5 dias após a rotulagem SC.

Discussion

1. Por que usar este método cirúrgico para a contagem de células ganglionares da retina?
   
   Em ratos cerca de 98% das células ganglionares da retina (RGC) são conhecidas por projeto para o colículo contralateral superior (SC). Aplicação de flúor em dourado sobre a superfície do SC pode rotular quase todos os RGCs, para que possamos concentrar-se neste neurônio mais vulneráveis ​​da retina em glaucoma. Compare com rotulagem retrógrado de RGC colocando FG no coto do nervo óptico seccionado por 2 dias, a interferência de sobrevivência RGC é minimizado. Compare com coloração violeta cresil que mancha a célula amácrinas, RGC e células endoteliais dos vasos sanguíneos na camada de células ganglionares da retina, este método é mais específico para o RGC.
   
   
2. Como evitar sangramento excessivo?
   
   Primeiro, verifique se o rato está devidamente anestesiados, verificando o tônus ​​muscular e do reflexo da córnea. Anestesia insuficiente irá causar hemorragia extensa. Segundo, evitar operações que irá danificar o seio, como a perfuração muito próxima à sutura ou rasgar das meninges na parede do seio. Em terceiro lugar, ter o cuidado de manter a mentira dura superficialmente sobre a intacta SC especialmente na região nasal.
   
   
3. Quanto tempo demora até que o RGCs são rotulados?
   
   Quatro dias após a rotulagem SC, o RGC pode ser rotulado. Eu normalmente esperar sete dias para melhores resultados.