Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen durch Anwendung von Fluoro-Gold auf der Oberfläche des Colliculus superior

Summary

Dieses Video beschreibt die Methode der retrograden Markierung von RGC indem Fluor-Gold (FG) auf der Oberfläche des Colliculus superior (SC). Technik umfasst das Bohren des Schädels, das Absaugen des Kortex, und die Anwendung Gelatineschwamm über den gesamten dorsalen Oberfläche des SC.

Abstract

Retinalen Ganglienzellen (RGC) Zählen ist notwendig, um die Degeneration der Netzhaut vor allem bei Glaukom zu bewerten. Zuverlässige RGC Kennzeichnung ist von grundlegender Bedeutung für die Beurteilung der Auswirkungen der Behandlung. Bei Ratten beträgt ca. 98% der RGCs bekannt, zur kontralateralen Colliculus superior (SC) (Forrester und Peters, 1967) Projekt. Anwenden von Fluor-Gold (FG) auf der Oberfläche der SC-Label fast alle RGCs, so dass wir auf diesem am stärksten gefährdeten retinalen Neurons in Glaukom konzentrieren können. FG wird durch das Axon-Terminals von retinalen Ganglienzellen genommen und bilateral retrograd seiner SOMAS in der Netzhaut transportiert. Vergleichen mit retrograde Markierung von RGC indem FG am Stumpf des durchtrennten Sehnerven für 2 Tage, ist die Einmischung der RGC Überleben minimiert. Vergleichen mit Kresylviolett-Färbung, die Flecken RGCs, Amakrinzellen und Endothel der Blutgefäße in der Netzhaut Ganglienzellen, diese Kennzeichnung Methode genauer auf die RGC ist. Dieses Video beschreibt die Methode der retrograden Markierung von RGC indem FG auf der Oberfläche des SC. Das chirurgische Verfahren umfassen das Bohren der Schädel; Absaugen der Rinde in den SC aussetzen und die Anwendung Gelatineschwamm über den gesamten dorsalen Oberfläche des SC gezeigt. Nützliche Tipps zur Vermeidung von massiven Hirnblutungen und Streben des SC gegeben worden.

Protocol

1. Betäuben die Ratte durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (80mg/kg) und Xylazin (8mg/kg) (Volumen-Verhältnis bei 2:1). Bewerben sterile Auge Schmiermittel Salbe zu verhindern Trocknung der Hornhaut während der Operation.
2. Shave den Kopf Pelz (von Auge zu Ohr-Ebene) und fixieren Sie den Kopf auf den Kopf der Bühne durch einen Kopf Klammer und setzen Sie seine Schneidezähne im Schneidezahn bar.
3. Desinfiziert den Betrieb mit 10% Povidon-Iod-Lösung um 70% Alkohol.
4. Schneiden Sie die Haut und Muskeln, um Schädel und Nähte (sagittalen, koronalen und transversalen Nähte) (Abbildung 1) aussetzen. Wenden Sie Schmerzmittel, Bupivacain als Spritzschutz an Schnitt-Bereich (nicht auf 2 mg / kg nicht überschreiten).
5. Bohren Sie ein Schädel-Loch (ø 2x2 mm, 0,5 mm von beiden sagittalen und transversalen Nähte) auf jeder Seite der Pfeilnaht. Vermeiden Bruch der Hirnhaut und des Sinus liegt unterhalb der Nähte.
   
   
   Abbildung 1. Markenzeichen auf Leben Ratte Schädel.
   
   
6. Schneiden Sie die Hirnhaut durch die Feder Schere, nicht reißt.
7. Saugen Sie die zerebrale Inhalte, die über die dorsale Oberfläche des Colliculus superior sorgfältig von der Vakuumpumpe und drei Check-Punkte beobachtet werden können liegt:
   1. die Farbe des Hirngewebes wechselt von grau zu weiß bis grau
   2. Stop Absaugen, wenn die farblose Liquor herauskommen
   3. vergrößert vorsichtig die niedrigste Saugleistung horizontal auf die gelbliche Colliculus superior von der Dura bedeckt aussetzen
8. Absaugen des Gehirns Inhalte über SC bis vier Kanten des SC direkt unter dem Mikroskop beobachtet werden kann. Der Anteil der Hirnrinde entfernt auf ein Minimum begrenzt werden, um unerwünschte Nebenwirkungen (zB motorische Störungen) zu vermeiden. Achten Sie darauf, den Sinus zu berühren.
9. Nehmen Sie die Flüssigkeit in das Loch mit feinen sterile Baumwolle Streifen, um die Oberfläche der SC so trocken wie möglich. Legen Sie dann eine dünne Schicht von Gelatine Schwamm mit Wasser befeuchtete mit 6% Fluoro-Gold auf der Oberfläche der SC (FG wird durch das Axon-Terminals von retinalen Ganglienzellen genommen und bilateral retrograd seiner SOMAS in der Netzhaut transportiert).
10. Füllen Sie das Loch mit Gelschaum und schließen Sie die Hautwunde mit Klammern für chirurgische Nähte.
11. Die Tiere durften unter Glühlampe warm zu halten erholen. Analgetikum, Buprenorphin (100mcg/kg) wird oral im Trinkwasser für 5 Tage nach SC Kennzeichnung angewendet.

Discussion

1. Warum Sie diese OP-Methode für retinalen Ganglienzellen zu zählen?
   
   In Ratten etwa 98% der retinalen Ganglienzellen (RGC) ist bekannt, dass auf der Gegenseite Colliculus superior (SC)-Projekt. Anwenden von Fluor-Gold auf der Oberfläche der SC können fast alle Label der RGCs, so dass wir auf diesem am stärksten gefährdeten retinalen Neurons in Glaukom konzentrieren können. Vergleichen mit retrograde Markierung von RGC indem FG am Stumpf des durchtrennten Sehnerven für 2 Tage, ist die Einmischung der RGC Überleben minimiert. Vergleichen mit Kresylviolett-Färbung, die Flecken der amakrine Zelle, RGC und Endothelien Zelle des Blutgefäßes in der retinalen Ganglienzellen Schicht, diese Methode speziell für den RGC ist.
   
   
2. Wie starke Blutungen zu vermeiden?
   
   Stellen Sie zunächst sicher, dass die Ratte ist ordnungsgemäß betäubt, indem Muskeltonus und der Hornhaut-Reflex. Unzureichende Anästhesie verursachen umfangreiche Blutungen. Zweitens vermeiden Operationen, die die Sinus wie Bohren zu nahe an der Naht oder Reißen der Hirnhäute in die Sinuswand beschädigen. Drittens seien Sie vorsichtig, damit die Dura liegen oberflächlich auf der SC intakt vor allem an den Nasenbereich.
   
   
3. Wie lange dauert es, bis die RGCs gekennzeichnet sind?
   
   Vier Tage nach dem SC Kennzeichnung kann der RGC gekennzeichnet werden. Ich normalerweise sieben Tage lang für bessere Ergebnisse zu warten.