Summary
Este vídeo descreve o método de rotulagem retrógrado de RGC aplicando fluoro-gold (FG) na superfície do colículo superiores (SC). Técnica envolve a perfuração do crânio, aspiração do córtex, e aplicação de esponja de gelatina sobre a superfície dorsal de toda SC.
Abstract
Contagem de células ganglionares da retina (RGC) é essencial para avaliar a degeneração da retina especialmente em glaucoma. Rotulagem RGC confiável é fundamental para avaliar os efeitos de qualquer tratamento. Em ratos, cerca de 98% do RGCs é conhecido por projeto para o colículo contralateral superior (SC) (Forrester e Peters, 1967). Aplicando fluoro-gold (FG) na superfície de SC pode rotular quase todos os RGCs, para que possamos concentrar-se neste neurônio mais vulneráveis da retina em glaucoma. FG é ocupada pelos terminais dos axônios de células ganglionares da retina bilateralmente e transportados retrogradamente à sua somas na retina. Compare com rotulagem retrógrado de RGC colocando FG no coto do nervo óptico seccionado por 2 dias, a interferência de sobrevivência RGC é minimizado. Compare com coloração violeta cresil que as manchas RGCs, células amácrinas e endotélio dos vasos sanguíneos na camada de células ganglionares da retina, este método de marcação é mais específico para o RGC. Este vídeo descreve o método de rotulagem retrógrado de RGC aplicando FG sobre a superfície de SC. Os procedimentos cirúrgicos incluem a perfuração do crânio; aspiração do córtex para expor a SC e aplicação de esponja de gelatina sobre a superfície dorsal inteiro de SC são mostrados. Dicas úteis para evitar hemorragia intracraniana maciça e aspiração do SC foram dadas.
Protocol
- Anestesiar o rato por injeção intra-peritoneal de cetamina (80mg/kg) e xilazina (8mg/kg) (relação de volume de 2:1). Aplicar pomada lubrificante estéril olho para evitar o ressecamento das córneas durante a cirurgia.
- Raspar os pêlos da cabeça (do olho ao nível do ouvido) e fixar a cabeça no palco cabeça por uma cabeça de fixação e defina seu incisivos na barra incisivo.
- A área de operação desinfectados com solução de iodo povidona 10% seguido pelo álcool 70%.
- Cortar a pele e os músculos para expor crânio e suturas (sagital, coronal e transversal suturas) (Figura 1). Aplicar analgésico, bupivicaine como um respingo para a área de incisão (não exceder 2 mg / kg).
- Furar um buraco crânio (ø mm 2x2, 0,5 mm de ambas as suturas sagital e transversal) de cada lado da sutura sagital. Evitar a ruptura das meninges e do seio deitada debaixo das suturas.
Figura 1. Marcas no crânio de ratos vivos.
- Cortar as meninges por tesouras primavera, evitar rasgar.
- Aspirar o conteúdo cerebral que se encontra sobre a superfície dorsal do colículo superior cuidadosamente pela bomba de vácuo e três pontos de verificação podem ser observadas:
- a cor do tecido cerebral muda de cinza para branco ao cinza
- parar quando a aspiração do líquido cefalorraquidiano incolor sair
- cuidadosamente ampliar o nível mais baixo de sucção horizontal para expor o colículo amarelada superiores abrangidos pela dura
- Aspirar o conteúdo do cérebro ao longo SC até quatro bordas de SC podem ser observados diretamente sob o microscópio. A porção do córtex cerebral removido deve ser o mínimo para evitar efeitos colaterais indesejáveis (por exemplo, disfunção motora). Tenha cuidado para não tocar o seio.
- Absorver o líquido no buraco com listra fina de algodão estéril para tornar a superfície do SC tão seca quanto possível. Em seguida, coloque uma camada fina de gelatina esponja pré-embebidas com 6% Fluoro-Gold na superfície de SC (FG é absorvido pelos terminais dos axônios de células ganglionares da retina bilateralmente e transportados retrogradamente à sua somas na retina).
- Encha o buraco com gelfoam e fechar a ferida da pele com clips de sutura.
- Os animais foram autorizados a se recuperar com luz incandescente para manter aquecido. Analgésico, a buprenorfina (100mcg/kg), é aplicada por via oral na água de beber durante 5 dias após a rotulagem SC.
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Discussion
- Por que usar este método cirúrgico para a contagem de células ganglionares da retina?
Em ratos cerca de 98% das células ganglionares da retina (RGC) são conhecidas por projeto para o colículo contralateral superior (SC). Aplicação de flúor em dourado sobre a superfície do SC pode rotular quase todos os RGCs, para que possamos concentrar-se neste neurônio mais vulneráveis da retina em glaucoma. Compare com rotulagem retrógrado de RGC colocando FG no coto do nervo óptico seccionado por 2 dias, a interferência de sobrevivência RGC é minimizado. Compare com coloração violeta cresil que mancha a célula amácrinas, RGC e células endoteliais dos vasos sanguíneos na camada de células ganglionares da retina, este método é mais específico para o RGC. - Como evitar sangramento excessivo?
Primeiro, verifique se o rato está devidamente anestesiados, verificando o tônus muscular e do reflexo da córnea. Anestesia insuficiente irá causar hemorragia extensa. Segundo, evitar operações que irá danificar o seio, como a perfuração muito próxima à sutura ou rasgar das meninges na parede do seio. Em terceiro lugar, ter o cuidado de manter a mentira dura superficialmente sobre a intacta SC especialmente na região nasal. - Quanto tempo demora até que o RGCs são rotulados?
Quatro dias após a rotulagem SC, o RGC pode ser rotulado. Eu normalmente esperar sete dias para melhores resultados.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o apoio do Programa Nacional de Glaucoma da Fundação Americana de Saúde Adjunto.
References
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