A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Deze video laat zien hoe in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen te voeren om embryoid lichamen met behulp van de opknoping drop methode.

Abstract

Stamcellen hebben de opmerkelijke potentie uit te groeien tot een groot aantal verschillende celtypen. Wanneer een stamcel deelt, elke nieuwe cel de mogelijkheid om ofwel te blijven een stamcel of worden een ander type cel met een meer gespecialiseerde functie heeft, is deze veelbelovende van de wetenschap vooraanstaande wetenschappers de mogelijkheid van cel-gebaseerde therapieën voor behandeling van de ziekte te onderzoeken. Wanneer cultuur in suspensie zonder antidifferentiation factoren, embryonale stamcellen spontaan differentiëren en vormen drie-dimensionale meercellige aggregaten. Deze cel aggregaten worden genoemd embryoid organen (EB). Opknoping druppel cultuur is een veel gebruikt EB formatie inductie methode. De afgeronde onderkant van opknoping druppel maakt de samenvoeging van de ES-cellen die kunnen zorgen voor MES-cellen een goede omgeving voor het vormen van EBS. Het aantal van de ES-cellen aggregatied in een opknoping druppel kan worden geregeld door het variëren van het aantal cellen in de eerste celsuspensie te worden opgehangen als een druppel uit het deksel van de petrischaal. Met behulp van deze methode kunnen we reproduceerbare vorm homogene EBS vanuit een vooraf bepaald aantal ES-cellen.

Protocol

Gelatineren T75 fles met behulp van een 0,1% gelatine-oplossing en incubeer plaat in een 37 ° C, 5% CO 2 weefselkweek incubator 's nachts een dag voor. Haal de MES-cellen van broeden, zuig het medium, spoel de ES-cel-cultuur met PBS, toe te voegen 0,05% trypsine oplossing voor laag de bodem van de schaal (2 ml/100mm plaat). Incubeer bij 37 ° C gedurende ongeveer een minuut, totdat de cellen afstoten van de plaat. Voorzichtig vermaal (pipet op en neer) de getrypsiniseerd cellen vier t…

Discussion

De nadelen van opknoping drop methode zijn als volgt: de vloeistof volume van een druppel is beperkt tot minder dan 50ul te wijten aan het behoud van opknoping druppels op het deksel door oppervlaktespanning, en het is onmogelijk om het medium te veranderen voor opknoping druppels. Observatie van het vormen van EBS in druppels direct met microscopie is ook zeer moeilijk tijdens de teelt. Verder, de opknoping druppel methode bestaat uit twee stappen, kan daarom een ​​reeks stap van de opknoping drop methode lastig.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM	Reagent	Gibco	11965-092
Fetal Bovine Serum(FBS)	Reagent	Hyclone	SH30070.03
L-Glutamine	Reagent	Gibco	25030
Non-Essential Amino Acids	Reagent	Gibco	11140-050
Penicllin / Streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122
Sodium Pyruvate	Reagent	Gibco	11360-70
β-mercaptoethanol	Reagent	Chemicon	ES-007-E
leukemia inhibitory factor(LIF)	Reagent	Chemicon	LIF2005
96-well ultralow attachment plate	Tool	Corning	3474