Summary
סרט הווידאו הזה מדגים כיצד ההתנהגות בידול במבחנה של תאים עובריים בעכבר לגופים embryoid בשיטת ירידה תלוי.
Abstract
לתאי גזע יש פוטנציאל מדהים להתפתח הרבה סוגי תאים שונים. כאשר תא גזע מתחלק, בכל תא חדש יש פוטנציאל או להישאר תא גזע או להיות סוג אחר של תא עם פונקציה מיוחדת יותר, זה מבטיח של המדע המוביל מדענים לחקור את האפשרות של טיפולים מבוססי תאים לטיפול במחלות. כאשר התרבות השעיה ללא גורמי antidifferentiation, בתאי גזע עובריים ספונטני להבדיל צורה תלת ממדית אגרגטים תאיים. אגרגטים אלה התא נקראים גופים embryoid (EB). תלוי תרבות ירידה היא היווצרות בשימוש נרחב EB שיטת האינדוקציה. תחתית מעוגלת הירידה תלוי מאפשר צבירה של תאים ES אשר יכול לספק תאים MES סביבה טובה עבור יצירת EBS. מספר תאים ES aggregatied לירידה תלוי יכול להיות נשלט על ידי שינוי מספר התאים בתרחיף התא הראשוני להיות תלויים כמו ירידה מן המכסה של צלחת פטרי. באמצעות שיטה זו אנו יכולים reproducibly טופס EBS הומוגנית מתוך מספר קבוע מראש של תאים עובריים.
Protocol
- Gelatinize T75 הבקבוק באמצעות פתרון ג'לטין 0.1% ו צלחת דגירה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 רקמה תרבות יום חממה בן לילה לפני.
- להוציא את התאים מן MES דגירה, לשאוב את המדיום, לשטוף את תרבית תאים ES עם PBS, להוסיף פתרון טריפסין 0.05% ל המעיל התחתון של המנה (2 צלחת ml/100mm).
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 1 דקות, עד התאים ומשילה מעליה את הצלחת.
- בעדינות triturate (pipet למעלה ולמטה) התאים trypsinized ארבע עד שש פעמים כדי לפזר את תאים ES עם פקוק פיפטה פסטר,. העברת התאים ES התפזרו לתוך צינור 15 מ"ל צנטריפוגה חרוטי המכיל prewarmed (37 ° C) בינוני MES.
- איסוף תאים על ידי צנטריפוגה. לשאוב supernatant, הוסף 10 מ"ל של מדיום MES ו פיפטה מעלה ומטה כדי ליצור השעיה תא בודד.
- העברת ההשעיה לתוך תא בקבוק T75 מראש מצופה 0.1% לטין לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך שעה אחת
* לאחר כשעה, fibroblasts יש המצורפת הצלחת אבל בתאי גזע להישאר בינוני. פיפטה את המדיום כדי לאסוף את בתאי גזע. - ספין התאים בסל"ד 1000 דקות 5 ו לשאוב את המדיום MES. ואז להוסיף עוד 10 מ"ל של מדיום בידול MES ו resuspend התאים על ידי pipetting חוזרות עד שנראה השעיה וקנס של תאים.
- ספירת תאים עם מדיום להשתמש hemocytometer בידול לדלל את ההשעיה בתאי גזע כדי בריכוז של 400-500 תאים לכל 20ul (20ul/drop) באגן סטרילית.
- הרם את המכסה, להפוך אותו בזהירות ומניחים אותו על גבי צלחת המכילה 10 מ"ל של PBS. בעזרת פיפטה רב, לעשות שורות של טיפות 20ul על פני השטח עד שהפך הפנימי של המכסה של המנה בתרבית רקמה.
- בזהירות במקום צלחת בחממה במשך 2 ימים. לאחר יומיים, בזהירות להתהפך לכסות את הצלחת, לשאוב 180 בידול ul בינוני טרי לשים מספר טיפות לתוך הבאר של צלחת 96-מצורף גם ultralow. ואז הטנדר טיפה עם טפטפת טיפות והעברה, אחד על אחד, הצלחת 96-היטב. מניחים את הלוחות לתוך החממה באין מפריע במשך 3 ימים.
- מעיל אחד טוב של 48-היטב בתרבות רקמה צלחת עם 300ul של 0.1% ג'לטין. לאחר הוספת ג'לטין, דגירה את הצלחת לילה בשעה 37 ° C יום אחד קדימה לפני העברת EBS.
- למחרת, לשאוב את הג'לטין מהצלחת 48-הבאר. ואז להוסיף 300 ul של המדיום בידול היטב כל אחד. העברת EBS של 96 צלחות היטב את הג'לטין 48 מצופה צלחות גם אחד על אחד. שנה את בינונית למחרת ולאחר מכן שנה את בינונית בכל יום אחר כדי לשמור על התאים.
- התכווצויות cardiaomyocyte ספונטנית צריך להיות ברור תוך 7 ימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
החסרונות של שיטה טיפה תלויה הן כדלקמן: נפח נוזל טיפה מוגבל פחות 50ul עקב שמירה על טיפות תלויות על מכסה ידי מתח פנים, ואי אפשר לשנות את המדיום לתליית טיפות. תצפית של יצירת EBS בטיפות ישירות עם מיקרוסקופיה הוא גם קשה מאוד במהלך הטיפוח. עוד יותר, השיטה ירידה תלוי מורכב משני שלבים, אם כן, סדרה של צעד של השיטה ירידה תלוי עשוי להיות בעייתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Reagent | Hyclone | SH30070.03 | |
| L-Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| Penicllin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11360-70 | |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Chemicon International | ES-007-E | |
| leukemia inhibitory factor(LIF) | Reagent | Chemicon International | LIF2005 | |
| 96-well ultralow attachment plate | Tool | Corning | 3474 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
- Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).
