Summary
Este vídeo demuestra cómo llevar a cabo en la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón a cuerpos embrioides utilizando el método de gota.
Abstract
Las células madre tienen el potencial extraordinario para convertirse en muchos tipos celulares diferentes. Cuando una célula madre se divide, cada nueva célula tiene la capacidad de seguir siendo una célula madre o convertirse en otro tipo de célula con una función más especializada, Esta prometedora de la ciencia está llevando a los científicos a investigar la posibilidad de terapias basadas en células para tratar la enfermedad. Cuando la cultura en suspensión sin factores de antidiferenciación, las células madre embrionarias se diferencian y espontánea forma tridimensional agregados multicelulares. Estos agregados de células se llaman cuerpos embrioides (EB). Colgando cultura gota es una formación muy utilizado EB método de inducción. La parte inferior redondeada de gota colgante permite la agregación de células madre embrionarias que pueden proporcionar las células MES un buen ambiente para la formación de EBS. El número de células madre embrionarias aggregatied en una gota se puede controlar variando el número de células en la suspensión inicial de la célula para ser colgado como una gota de la tapa de la placa de Petri. El uso de este método que puede reproducible forma homogénea EBs de un número determinado de células madre embrionarias.
Protocol
- Gelatinizar T75 frasco con una solución de gelatina al 0,1% y la placa se incuba en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora de cultivo de tejidos durante la noche un día antes.
- Saque las células MES de incubar, se aspira el medio, enjuague el cultivo de células ES con PBS, se añaden 0,05% de solución de tripsina para cubrir el fondo del plato (2 placas ml/100mm).
- Se incuba a 37 ° C durante aproximadamente un minuto, hasta que las células son desprendimiento de la placa.
- Suavemente triturar (pipeta de arriba y abajo) de las células trypsinized cuatro a seis veces para dispersar las células madre embrionarias con una pipeta Pasteur conectada,. Transferencia de las células madre embrionarias se dispersaron en un tubo de centrífuga de 15 ml cónicos que contengan precalentado (37 ° C) medio MES.
- Recoger las células por centrifugación. Aspirar el sobrenadante, agregar 10 ml de medio de MES y la pipeta hacia arriba y abajo para formar una suspensión de células individuales.
- La transferencia de la suspensión celular en un matraz T75 pre-recubiertas con gelatina al 0,1% y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 durante una hora
* Después de una hora, los fibroblastos se han adherido a la placa, pero las células madre permanecen en el medio. Pipeta hasta el medio para recolectar las células madre. - Vuelta a las células a 1000 rpm durante 5 min y se aspira el medio de MES. A continuación, añadir otra de 10 ml de medio de diferenciación MES y volver a suspender las células mediante pipeteo repetitivo hasta que parece que hay una suspensión fina de las células.
- Recuento de células con un medio de diferenciación hemocitómetro utilizar para diluir la suspensión de células madre a una concentración de 400 a 500 células por 20 ul (20ul/drop) en un recipiente estéril.
- Levante la tapa, con cuidado invertir y colocar en la parte superior de la cápsula que contiene 10 ml de PBS. Con una pipeta multicanal, hacer filas de las gotas de 20 ul en la superficie interna hasta convertido de la tapa de la placa de cultivo de tejidos.
- Coloque cuidadosamente el plato en la incubadora por 2 días. Después de dos días, con cuidado a su vez sobre la cubierta de la placa, aspirar el medio 180 ul diferenciación fresca y poner unas gotas en el pocillo de una placa de 96 pozos ultra adjunto. Luego de recogida la caída de las gotas de pipeta y la transferencia, una por una, a la placa de 96 pocillos. Coloque las placas en el reposo durante tres días incubadora.
- Cubrir cada pocillo de una placa de tejido de 48 pocillos con 300ul de 0,1% de gelatina. Después de añadir la gelatina, se incuba la placa durante la noche a 37 ° C, un día antes antes de la transferencia de la EBS.
- Al día siguiente, se aspira que la gelatina de la placa de 48 pocillos. A continuación, añadir 300 ul de medio de diferenciación a cada pocillo. Transferir el EBs de la 96 y placas a los 48 y recubiertos de gelatina placas de uno por uno. Cambiar el medio al día siguiente y luego cambiar el medio de cada dos días para mantener las células.
- Contracciones espontáneas cardiaomyocyte debe ser evidente en los últimos 7 días.
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Discussion
Las desventajas del método de gota son los siguientes: el volumen de líquido de una caída se limita a menos de 50 ul por el mantenimiento de las gotas colgando de la tapa por la tensión superficial, y es imposible cambiar el medio para colgar gotas. La observación de la formación de EBS en gotas directamente con el microscopio es también muy difícil durante el cultivo. Más aún, el método de la gota colgante consta de dos pasos, por lo tanto, una serie de pasos del método de gota puede ser un problema.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Reagent | Hyclone | SH30070.03 | |
| L-Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| Penicllin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11360-70 | |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Chemicon International | ES-007-E | |
| leukemia inhibitory factor(LIF) | Reagent | Chemicon International | LIF2005 | |
| 96-well ultralow attachment plate | Tool | Corning | 3474 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
- Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).
