Summary
Bu video asılı bırak yöntemini kullanarak embriyoid organları fare embriyonik kök hücreleri in vitro farklılaşması nasıl yürütüleceğini gösteriyor.
Abstract
Kök hücreler birçok farklı hücre türleri geliştirmek için olağanüstü bir potansiyele sahiptir. Bir kök hücre böler, her yeni hücre, ya da bir kök hücre kalır veya daha uzmanlaşmış bir fonksiyonu ile başka bir tür hücre haline potansiyele sahiptir, bilim Bu umut verici bir hastalığın tedavisi için hücre tabanlı tedavi olasılığını araştırmak için bilim adamları lider. Antidifferentiation faktörleri olmadan süspansiyon kültür, embriyonik kök hücreler kendiliğinden farklılaştırmak ve üç boyutlu çok hücreli bir araya toplanırlar. Bu hücre agrega embriyoid organları (EB) olarak adlandırılır. Açılan kültür Asma yaygın olarak kullanılan bir EB oluşumu indüksiyon yöntemi. Asılı damla yuvarlak alt MES hücreleri oluşturan EBS için iyi bir ortam sağlayabilir ES hücrelerinin toplama sağlar. Petri kabı kapağı bir damla gibi asılı ilk hücre süspansiyon hücrelerinin sayısını değiştirerek asılı açılan aggregatied ES hücrelerinin sayısı kontrol altına alınabilir. Bu yöntemi kullanarak tekrarlanabilir ES hücrelerinin belli sayıda homojen EBS oluşabilir.
Protocol
- T75 şişesi önce 37 ° C,% 5 CO 2 doku kültürü inkübatör gecede bir gün içinde% 0,1 jelatin solüsyonu ve inkübe plaka kullanarak jelatinleştirmeye.
- Inkübe gelen MES hücreler dışarı atın, orta aspirat, PBS ile ES hücre kültürü durulama, çanak alt kat (2 ml/100mm plaka)% 0.05 tripsin çözüm ekleyin.
- Tabak kapatın hücrelerinin dökülmesi kadar, 37 ° C'de yaklaşık 1 dakika boyunca inkübe edin.
- Yavaşça (pipetlemeyin yukarı ve aşağı) bir takılı Pasteur pipeti ile 4-6 kez ES hücreleri dağıtmak için tripsinize hücreleri, çiğnemek. Prewarmed (37 ° C), orta (MES) içeren 15 ml konik santrifüj tüpü içine dağılmış ES hücrelerinin transferi.
- Santrifüj hücreleri toplayın. Süpernatantı aspire MES orta 10 ml ekleyin ve bir tek hücre süspansiyon formu için yukarı ve aşağı pipetle.
- 37% 0.1 jelatin ve inkübe ile kaplı ön T75 balona hücre süspansiyonu Transfer ° C, bir saat süreyle% 5 CO2
* Bir saat sonra, fibroblastlar plakasına bağlı ama kök hücreler orta kalır. Kök hücreleri toplamak için orta Pipet. - 1000 rpm'de 5 dakika boyunca hücreleri Spin ve MES orta aspire. Sonra başka bir 10 ml MES farklılaşma orta ekleyin ve hücrelerin ince bir süspansiyon var görünene kadar tekrarlayan pipetleme hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin.
- Kök hücre süspansiyonu steril bir havza 20ul (20ul/drop) başına 400 ila 500 hücreden bir konsantrasyon sulandırmak için hemasitometre kullanımı farklılaşması orta hücreleri saymak.
- Kapağı kaldırın, dikkatlice ters ve 10 ml PBS içeren yemeğin üstüne koyun. Bir çok kanallı pipet kullanarak, doku kültürü çanak kapağı yukarı döndü iç yüzeyine 20ul damla satır olun.
- 2 gün boyunca dikkatlice inkübatör tabak koyun. İki gün sonra, dikkatle plaka kapağın üzerine açmak 180 ul taze farklılaşması orta aspirat ve 96 kuyu, ultra eki plaka kuyunun içine birkaç damla koymak. Sonra bırak pipet ve transfer damla, bire-bir, 96 plaka ile pikap. Plakalar 3 gün boyunca rahatsız kuvöz içine yerleştirin.
- Coat her iyi jelatin 0.1% 300ul ile 48 iyi doku kültürü plakası. Jelatin ekledikten sonra, 37 gecede plaka inkübe ° C bir gün öncesinde önce Ebs aktarmak.
- Ertesi gün, 48 plaka jelatin aspirat. Sonra her bir kuyunun 300 ul farklılaşması orta ekleyin. 96 kuyucuğu EBS iyi 48 jelatin kaplı plakaları tek-tek aktarın. Ertesi gün orta değiştirin ve sonra hücreleri korumak için her gün orta değiştirmek.
- Spontan cardiaomyocyte kasılmaları 7 gün içinde belirgin olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
: Bir damla sıvı hacmi, yüzey gerilimi kapağı nedeniyle asılı damla korumak için daha az 50ul sınırlı ve damla asılı orta değiştirmek imkansız asılı damla yöntemi dezavantajları aşağıdaki gibidir. Mikroskobu ile doğrudan damla EBS oluşturan Gözlem ekimi sırasında da çok zordur. Dahası, asılı damla yöntemi iki aşamadan oluşur, bu nedenle, asılı damla yöntemi adım bir dizi sorun olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Reagent | Hyclone | SH30070.03 | |
| L-Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| Penicllin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11360-70 | |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Chemicon International | ES-007-E | |
| leukemia inhibitory factor(LIF) | Reagent | Chemicon International | LIF2005 | |
| 96-well ultralow attachment plate | Tool | Corning | 3474 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
- Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).
