Toepassing van een C. elegans Dopamine neuron degeneratie Assay voor de validatie van Potentieel de ziekte van Parkinson Genen

Summary

Deze video laat zien hoe C. elegans te gebruiken om dopaminerge neuron neurodegeneratie te beoordelen als een model voor de ziekte van Parkinson. Verder worden genetische screens gebruikt om de factoren die een verbetering van degeneratie of neuroprotectieve identificeren.

Abstract

Verbeteringen aan de diagnose en behandeling van de ziekte van Parkinson (PD) zijn afhankelijk van de kennis over de gevoeligheid factoren die de bevolking maakt in gevaar. In het proces van een poging om nieuwe genetische factoren die samenhangen met ziekte van Parkinson te identificeren, hebben wetenschappers gegenereerd vele lijsten van kandidaat-genen, polymorfismen, en eiwitten die belangrijke vorderingen te vertegenwoordigen, maar deze leidt blijven mechanistisch undefined. Ons werk is erop gericht in de richting van aanzienlijk vernauwing deze lijsten door gebruik te maken van de voordelen van een eenvoudig dier modelsysteem. Terwijl de mensen hebben miljarden neuronen, de microscopische rondworm Caenorhabditis elegans is precies 302, waarvan er slechts acht produceren dopamine (DA) in hemaphrodites. Expressie van een menselijk gen dat codeert voor het PD-geassocieerd eiwit, alfa-synucleïne, in C. elegans DA neuronen resulteert in een dosering en leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie.

Wormen die humaan alfa-synucleïne in DA neuronen isogene en express zowel GFP en het menselijk alfa-synucleïne onder de DA-transporter promotor (Pdat-1). De aanwezigheid van GFP dient als een gemakkelijk gevisualiseerd marker voor de volgende DA neurodegeneratie bij deze dieren. We in eerste instantie aangetoond dat alfa-synucleïne-geïnduceerde DA neurodegeneratie zouden kunnen worden gered bij deze dieren door torsinA, een eiwit met moleculaire chaperone activiteit ^1. Verder, de kandidaat-PD-gerelateerde genen geïdentificeerd in ons lab via grote schaal RNAi screening inspanningen met behulp van een alfa-synucleïne misfolding test werden vervolgens over-uitgedrukt in C. elegans DA neuronen. We hebben vastgesteld dat vijf van de zeven genen vertegenwoordigd belangrijke kandidaat-modulatoren van PD getest als ze gered alfa-synucleïne-geïnduceerde DA neurodegeneratie ^2. Daarnaast heeft de Lindquist Lab (dit nummer van Jove) uitgevoerd gist schermen, waarbij alfa-synucleïne-afhankelijke toxiciteit wordt gebruikt als een uitlezing voor de genen die kunnen versterken of onderdrukken cytotoxiciteit. We vervolgens de gist kandidaat genen onderzocht in onze C. elegans alfa-synucleïne-geïnduceerde neurodegeneratie assay en met succes gevalideerd veel van deze doelstellingen ^{3, 4.}

Onze methodologie bestaat genereren van een C. elegans DA neuron-specifieke expressie vector met behulp van recombinationele klonen van kandidaat-gen cDNA onder controle van de Pdat-1 promotor. Deze plasmiden worden dan gemicroinjecteerd in wild-type (N2) wormen, samen met een selecteerbare merker voor succesvolle transformatie. Meerdere stabiele transgene lijnen de productie van de kandidaat-eiwit in DA neuronen worden verkregen en vervolgens onafhankelijk van elkaar gekruist in de alfa-synucleïne degeneratieve stam en beoordeeld voor neurodegeneratie, zowel op het dier en de individuele neuron-niveau, in de loop van het ouder worden.

Protocol

A. expressieplasmide Bouw Twee plasmiden zijn nodig: een voor weefsel-specifieke expressie van het gen van interesse en een tweede als selecteerbare marker transformatie (hoewel de marker plasmide meestal beschikbaar is vanuit de onderzoekswereld). Experimentele Plasmide Selecteer een promotor die wordt uitgedrukt in de weefsels / cellen type van belang, in dit geval, de DA transporter (Pdat-1) promotor wordt gebruikt. Deze uitdrukking plasmide werd opger…

Discussion

De leeftijd-afhankelijke verlies van dopamine neuronen is een klinisch kenmerk van de ziekte van Parkinson en is in verband gebracht met de accumulatie of misfolding van een eiwit genaamd alfa-synucleïne. Hier laten we zien hoe een label, via een fluorescerende transgen, de dopaminerge neuronen van C. elegans en bootsen de neurodegeneratie gezien bij de ziekte van Parkinson door coexpressing menselijk alfa-synucleïne in deze cellen.

Deze video toont de methodologie voor de groei, de genetische kruising, montage, en scoren…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Agarose	Ultrapure	Invitrogen	15510-027
Coverglass 20×30 mm		Fisher	12-548-5A
Microscope Slides	Plain, 3×1″	Fisher	12-549
Dissecting with Fluorescence	Microscope	Nikon	SMZ800
Dissecting	Microscope	Nikon	SMZ645
Epifluorescent	Microscope	Nikon	Model E-800
Filter Cube, GFP HYQ	Endow Bandpass	Chroma Technology