Summary

Aplicación de un ensayo de C. elegans la degeneración neuronal de dopamina para la validación del potencial de la enfermedad de Parkinson genes

Published: July 18, 2008
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Summary

Este video muestra cómo utilizar C. elegans para evaluar la neurodegeneración nerviosas dopaminérgicas como un modelo para la enfermedad de Parkinson. Además, las pantallas de genética se utilizan para definir los factores que mejoran la degeneración o neuroprotectoras.

Abstract

Mejoras en el diagnóstico y el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (EP) dependen de los conocimientos sobre factores de vulnerabilidad que hacen que las poblaciones en riesgo. En el proceso de tratar de identificar nuevos factores genéticos asociados con la enfermedad, los científicos han generado muchas listas de genes candidatos, los polimorfismos y proteínas que representan importantes avances, pero estos conductores siguen mecánicamente indefinido. Nuestro trabajo está dirigido a reducir significativamente estas listas mediante la explotación de las ventajas de un sistema modelo animal simple. Mientras que los humanos tienen miles de millones de neuronas, la lombriz Caenorhabditis elegans microscópica tiene precisamente 302, de los cuales sólo ocho producir dopamina (DA) en hemaphrodites. Expresión de un gen humano que codifica la proteína asociada a la EP, la alfa-sinucleína, en C. elegans resultados neuronas DA de la dosis y la neurodegeneración dependiente de la edad.

Gusanos expresar humana alfa-sinucleína en las neuronas DA son isogénicas y expresar tanto las buenas prácticas agrarias y los derechos humanos alfa-sinucleína en el promotor del transportador de DA (Pdat-1). La presencia de GFP sirve como un marcador visualiza fácilmente para el seguimiento de la neurodegeneración DA en estos animales. Inicialmente se demostró que la alfa-sinucleína la neurodegeneración inducida por DA podrían ser rescatados en estos animales por torsinA, una proteína con actividad chaperona molecular 1. Además, el candidato PD relacionadas con los genes identificados en nuestro laboratorio a través de grandes esfuerzos de detección RNAi mediante una prueba de mal plegamiento de la alfa-sinucleína eran entonces sobre-expresado en C. elegans neuronas DA. Se determinó que cinco de los siete genes probados representado moduladores candidato importante de la EP, ya que rescató a la alfa-sinucleína inducida por la neurodegeneración DA 2. Además, el laboratorio de Lindquist (este número de Jove) ha llevado a cabo las pantallas de la levadura por el que la alfa-sinucleína toxicidad dependiente se utiliza como una lectura de los genes que pueden aumentar o suprimir la citotoxicidad. Nos examinó a continuación los genes candidatos de la levadura en nuestro ensayo de C. elegans neurodegeneración alfa-sinucleína y la inducida por validado con éxito muchos de estos tres objetivos, 4.

Nuestra metodología se basa en la generación de un vector de expresión de C. elegans DA neuronal específica con la clonación de cDNAs de recombinación de genes candidatos bajo el control del Pdat-1 promotor. Estos plásmidos son entonces microinyección de tipo salvaje (N2) gusanos, junto con un marcador de selección para la transformación exitosa. Múltiples líneas transgénicas estables de producir la proteína en las neuronas DA candidato se obtienen y se cruzó de manera independiente en la cepa de la alfa-sinucleína degenerativas y evaluados por la neurodegeneración, en el animal y el nivel de las neuronas individuales, en el curso del envejecimiento.

Protocol

A. Construcción de plásmido de expresión Dos plásmidos son necesarios: una para la expresión específica de tejido del gen de interés y un segundo como marcador de transformación seleccionables (aunque el marcador plásmido está generalmente disponible dentro de la comunidad de investigación). Experimental plásmido Seleccione un promotor que se expresa en el tipo de tejidos / células de interés, en este caso, el transportador de DA (Pdat-1) se…

Discussion

La pérdida depende de la edad de las neuronas de dopamina es una característica clínica de la enfermedad de Parkinson y se ha asociado con la acumulación o el mal plegamiento de una proteína llamada alfa-sinucleína. Aquí se demuestra la forma de etiqueta, a través de un transgén fluorescentes, las neuronas dopaminérgicas de la C. elegans e imitar la neurodegeneración en la enfermedad de Parkinson por coexpressing humana alfa-sinucleína en estas células.

Este video muestra la metodología para el crecimiento, cr…

Acknowledgements

Queremos reconocer el espíritu de cooperación de todos los miembros Caldwell laboratorio. Movimiento de investigación trastornos en el laboratorio ha sido apoyado por la distonía Bachmann-Strauss y la Fundación Parkinson, Reino Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, Asociación de la Enfermedad de Parkinson de Alabama, la Fundación Michael J. Fox para la Investigación del Parkinson, y una investigación de Pregrado

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027  
Coverglass 20×30 mm   Fisher 12-548-5A  
Microscope Slides Plain, 3×1″ Fisher 12-549  
Dissecting with Fluorescence Microscope Nikon SMZ800  
Dissecting Microscope Nikon SMZ645  
Epifluorescent Microscope Nikon Model E-800  
Filter Cube, GFP HYQ Endow Bandpass Chroma Technology    

References

  1. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  2. Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
  3. Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
  4. Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -. C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson’s disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).

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Cite This Article
Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson’s Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835, doi:10.3791/835 (2008).

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