Summary
Bu video C. elegans dopaminerjik nöron nörodejenerasyon, Parkinson hastalığı için bir model olarak değerlendirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ayrıca, genetik ekranlar ya dejenerasyon geliştirmek veya nöroprotektif faktörleri tanımlamak için kullanılır.
Abstract
Parkinson hastalığı (PH) tanı ve tedavi gelişmeler, risk altındaki populasyonlarda hale yatkınlık faktörleri hakkında bilgi bağımlı. PD ile ilişkili yeni bir genetik faktörleri belirlemek için çalışırken sürecinde, bilim adamları, aday genler, polimorfizmleri ve önemli ilerlemeler temsil eden proteinler birçok listeler oluşturulur, ancak bu yol açar mekanistik tanımsız kalır. Bizim işimiz böyle listelere basit bir hayvan modeli sisteminin avantajlarını istismar ederek önemli ölçüde daralması doğru hedeflenmektedir. Insanlar milyarlarca nöron olmasına rağmen, mikroskopik tür solucanın Caenorhabditis elegans tam 302 var ve bunların sadece sekiz hemaphrodites üretmek dopamin (DA). İfade bir insan gen dozaj ve yaşa bağımlı nörodejenerasyon C. elegans DA nöronlar sonuçları PD-ilişkili protein, alfa-sinüklein kodlama.
DA nöronların insan alfa-sinüklein ifade Worms isogenic ve DA taşıyıcı organizatörü (Pdat 1) altında GFP ve insan alfa-sinüklein ifade. GFP varlığı kolayca görüntülenebilmekte, bu hayvanlar DA nörodejenerasyon için bir marker olarak hizmet vermektedir. Biz başlangıçta alfa-sinüklein indüklenen DA nörodejenerasyon torsinA, moleküler şaperon aktivite 1 ile bir protein tarafından bu hayvanlar kurtarıldı olabileceğini gösterdi. Ayrıca, aday PD-ilişkili genlerin sonra C. elegans DA nöronların aşırı ifade edildi alfa-sinüklein misfolding assay kullanarak büyük ölçekli RNAi tarama çabaları ile laboratuvar belirlemiştir. Biz alfa-sinüklein indüklenen DA nörodejenerasyon 2 kurtardı beş yedi genlerin PD temsil önemli aday modülatörleri test olduğunu belirledi. Ayrıca, alfa-sinüklein bağımlı toksisite sitotoksisite geliştirmek veya bastırmak genler için bir okuma olarak kullanılmasını sağlayan Lindquist Lab (vallahi bu konuda) maya ekranlarında sahne aldı. Biz daha sonra C. elegans alfa-sinüklein indüklenen nörodejenerasyon tahlil maya aday genler incelenecek ve başarılı bir şekilde bu hedeflere 3, 4 çok valide .
Metodoloji Pdat-1 promotör kontrolü altında aday gen cDNAs recombinational klonlama kullanarak C. elegans DA nöron spesifik ifade vektör nesil içerir. Bu plazmid sonra başarılı bir dönüşüm için seçilebilir bir işaret ile birlikte, wild-tip (N2) solucanlar microinjected. DA nöronları aday proteini üreten Çoklu istikrarlı transgenik çizgiler yaşlanma boyunca, hayvan ve bireysel nöron düzeyinde hem de elde edilen ve daha sonra bağımsız olarak geçti ve alfa-sinüklein dejeneratif gerginlik içine nörodejenerasyon açısından değerlendirildi.
Protocol
A. İfade Plazmid İnşaat
İki plazmid gerekli doku özel ilgi gen ekspresyonu ve seçilebilir dönüşüm belirteci olarak ikinci bir (plazmid marker araştırma toplum içinde genellikle mevcut olmasına rağmen).
Deneysel Plazmid
- Ilgi doku / hücre tipi olarak ifade edilir bir yararlanıcı seçin; DA taşıyıcı (Pdat 1) Bu durumda, organizatörü kullanılır. Bu ifade plazmid recombinational klonlama 1 organizatörü ilgi downstream herhangi bir gen ekleme sağlamak için bir Invitrogen Gateway sisteminin uyumlu hedef vektör (pDEST-DAT-1) olarak yaratılmıştır.
- Ilgi genin cDNA Gateway att B recombinational dizisi içeren primerler kullanılarak amplifiye. Amplifiye cDNA ilk giriş vektörü oluşturmak için donör vektör pDONR201 içine recombined ve sonra E. coli suşu DH5α dönüştü. Başarılı rekombinantlar ve DNA mini hazırlık izolasyon seçimi takiben, giriş vektörü ifade plazmid yaratmak için pDEST-DAT-1 hedef vektör recombined. Recombinational klonlama Ayrıntılar Invitrogen Ağ Geçidi manuel veya Caldwell ve ark mevcuttur. 5.
Plazmid Seçilebilir Marker
Plazmid bir transgenik işaretleyici bariz bir doku floresan protein ifadesi itici bir yararlanıcı bir vektör oluşur. Bu özel prosedür, unc-54 organizatörü sürücüler vücut duvarı kas kiraz protein ekspresyonu (: kiraz Nokt-54).
Mikroenjeksiyon yoluyla Transgenik C. elegans B. Üretimi
Bkz: vallahi ilgili makale http://www.jove.com/index/details.stp?ID=833
C. Genetik DA nörodejenerasyon Analizi için haçlar
- Worms standart prosedürler kullanarak 6 yetiştirilmektedir.
- 10 Pdat-1: α-syn; Pdat-1: 3-4 aşama L4 transgenik çift cinsiyetli bir çiftleşme tabağa GFP erkeklerde 1, 2 (: gen X ve Nokt-54: Pdat-1 ifade: kiraz) . Bu oluşturulan üç ayrı istikrarlı hatları her biri için ayrı ayrı yapılmalıdır. İki gün sonra, erkek çıkarın.
- F1 nesil kontrol edin; birkaç erkek döl varsa, çiftleşme başarılı oldu.
- Her çapraz 5 hermafrodit L4 hayvanlar dışarı Clone sergi hem Pdat-1: GFP floresan işaretleyici (erkek ebeveyninizden miras) ve Nokt-54: kiraz floresan vücut duvarı kas işaretleyici (hermafrodit ebeveyn miras). Klonlanmış hayvanların henüz plakası üzerinde bulunan erkek hayvanlar ile evlendirilen olduğunu sağlamak için L4 aşamasında olması gerekir. Onları kendi kendine çapraz ve F2 döl üretmek izin ver.
- 3. adımda üretilen F2 hayvanların klonlanmış. Özellikle, transfer ~ kendi bireysel plakaları hem flüoresan işaretleyiciler sergi 5-10 hayvanlar. Ekran hayvanların ifade DA nöronlar GFP ve bazı hayvanların% 100 vücut duvarı kas hücrelerinde ifade kiraz plakaları için F3 nesil. Bu hayvanlar Pdat-1 için homozigot olacak: α-syn; Pdat-1:: GFP geninin stably yeni oluşturulan transgen (gen X) iletimi sırasında.
D. dopaminerjik Nöron Analizi
- Her üç satır yukarıda oluşturduğumuz yeni bir plaka, yanı sıra Pdat-1 hazırlayın: α-syn; Pdat-1: GFP yalnız gerginlik. Yetişkinliğe büyümesine izin verin.
- Her satırı 30-40 transgenik yetişkin taze bir tabağa aktarın. , 20 º C'de 4 saat embriyolar koymak için izin ver
- Yetişkinler çıkarın. L4 aşamaya ulaşmak kadar embriyoların 20 º C'de 3-4 gün geliştirmeye izin verir.
- 0.04 mg / ml 5-floro-2'-dezoksiuridin (FUDR) içeren bir plaka ~ 100 transgenik L4 hayvanlar seçin. DNA sentezinin inhibisyonu yoluyla yeni nesil bu nükleotid analog blok gelişimi, böylece deney hayvanları 7 ezici bir döl önler. Işığa duyarlı olduğundan ışık FUDR plakaları koruyun.
- Yetişkin hayvanların yumurtlama sonrasında çeşitli gün analiz edilecektir. Ampirik olarak analiz uygun gün belirlenir. Örneğin, biz tespit ettik% 77,% 87 ve% 90 Pdat-1: α-syn Pdat-1: GFP hayvanlar sırasıyla, dejenere DA nöronları gün 6, 7 ve 10 yazılan gelişimi sergilerler. Bu nedenle, biz ilgi transgen nörodejenerasyon geliştirmek olabileceğini tahmin, biz günde 6 ve 7 / veya analiz eder. Aynı şekilde, 7 ve 10 gün nörodejenerasyon bastırmak olabilir transgenlerin analiz edilecektir.
- 4 taze agaroz pedleri (mikroenjeksiyon agar pedleri aksine, bu taze kullanılan ve kurumasına izin verilmez) olun. Çapında bir parça bant iki mikroskop lamı ayarlayın; bant eşdeğer kalın pedler için ayırıcı olarak hizmet vermektedir. Üçüncü Lay(üç ayak yerleştirilmiş) bankta aralarında kaydırın. Merkezi slayt erimiş agaroz bir damla koyun ve hızlı bir şekilde dik ve her üç slayt boyunca, agaroz üstüne başka bir slayt yatıyordu. Ped kullanmak için hazır olana kadar birlikte iki slayt bırakarak, birkaç ek pedleri olun.
- Solucan DA nöronları analiz etmek için, 22 x 30 mm cam kapak 3 mM levamizol (anestezi) 6 ul damla yerleştirin. Agaroz ped üzerine kapak cam invert sonra, açılan (10 30 dışında ekstra atılır) 40 yetişkin hayvanların seçin. Diğer çizgilerin her biri için yineleyin.
- Puan Epifloresans ve FITC veya GFP görselleştirme sağlayan bir filtre küp ile bir bileşik mikroskop kullanılarak her CEP ve ADE nöron varlığı için hat başına 30 hayvan. GFP HYQ filtre küp (Chroma Teknolojisi) bağışlamak kullanın. Ekli puanlama kağıda kayıt verileri. Wild-tip hayvanlar tam 4 CEP GFP floresan ve 2 ADE nöronlar koruyacaktır. DA nöronların kaybı sergileyen bireysel hayvanlar olmayan WT veya "dejenere" olarak attı. Aynı şekilde, dejenerasyon ölçüde her hayvanın yanı sıra nüfus olarak kaybedilen toplam nöron sayarak atılır.
- Analizi (deneme satır başına başına 30 daha fazla hayvan) 2 kez daha tekrarlayın. Analizler üç tur solucanlar, yabani tip DA nöronların sergileyerek toplam sayısı ortalaması alınır. Analitik nöro için istatiksel analizi daha sonra kontrolü solucanlar (: α-syn; Pdat-1: Pdat-1: GFP) karşılaştırmak için öğrenci en t-testi (p <0.05) kullanılarak gerçekleştirilir. Suşları ile DA nöronların aşırı-ifade aday genler .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dopamin nöronlarının yaşa bağlı kayıp, Parkinson hastalığının bir klinik özelliğidir ve alfa-sinüklein adı verilen bir protein birikimi veya misfolding ile ilişkili bulunmuştur. Burada C dopaminerjik nöronlar, floresan transgen üzerinden, etiket nasıl göstermek elegans ve bu hücrelerin coexpressing insan alfa-sinüklein Parkinson hastalığında görülen nörodejenerasyon taklit.
Bu video, büyüme, genetik geçişi, montaj ve nörodejenerasyon ya da geliştirmek veya yaşlanma boyunca nöro-genetik faktörleri değerlendirmek amacıyla transgenik nematodların puanlama metodolojisi gösteriyor. Bakım uygun nöron kaybı veya koruma puanlama erkek ve başarılı genetik haçlar sağlamak için hermafroditlerde sahnelenen ve tutarlılık transgen bakım işaretleri kullanmak için alınır. Bu şekilde, C. elegans, genetik faktörler ya nörodejenerasyon katkıda bulunmak ya da artırılması nöron hayatta kalmak için tedavi hedefleri temsil edebilir hızlı değerlendirme kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz tüm Caldwell Lab üyeleri işbirliği ruhu kabul etmek istiyoruz. Bachmann-Strauss Distoni ve Parkinson Vakfı, Birleşik Parkinson Vakfı, Amerikan Parkinson Hastalığı Derneği, Parkinson Hastalığı Derneği Alabama, Michael J. Fox Parkinson Araştırma Vakfı ve Lisans Araştırma laboratuarında Hareket bozuklukları araştırma tarafından desteklenmektedir
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Coverglass 20x30 mm | Fisher Scientific | 12-548-5A | ||
| Microscope Slides | Plain, 3x1" | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Dissecting with Fluorescence | Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Epifluorescent | Microscope | Nikon Instruments | Model E-800 | |
| Filter Cube, GFP HYQ | Endow Bandpass | Chroma Technology Corp. |
References
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
- Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).
