Применение допамина Элеганс C. Анализ дегенерация нейронов для проверки потенциальных болезни Паркинсона Гены
Summary
В этом видео показано, как использовать Элеганс C. оценить дофаминергических нейронов нейродегенерации в качестве модели для лечения болезни Паркинсона. Кроме того, генетические экраны используются для выявления факторов, которые либо повышения дегенерация или нейропротекторное.
Abstract
Улучшение диагностики и лечения болезни Паркинсона (БП), зависят от знания о восприимчивости факторов, которые оказывают групп риска. В процессе попытки выявить новые генетические факторы, связанные с ПД, ученые сформировали множество списков кандидатов генов, полиморфизмы, и белки, которые представляют собой важные достижения, но это приводит остаются неопределенными механистически. Наша работа направлена на значительное сужение такие списки, используя преимущества простой модели системы животного. Хотя люди имеют миллиарды нейронов, микроскопических круглых червей Caenorhabditis Элеганс имеет ровно 302, из которых только восемь производство допамина (ДА) в hemaphrodites. Выражение человеческого гена, кодирующего PD-связанных белков, альфа-синуклеина, в Элеганс C. Д. А. Результаты нейронов в дозировке и возраст-зависимых нейродегенерации.
Черви выражения человеческих альфа-синуклеина в нейронах DA являются изогенных и выразить как GFP и человеческий альфа-синуклеина под промоутером Д. транспортер (Pdat-1). Наличие GFP служит легко визуализировать маркером следующее DA нейродегенерации у этих животных. Сначала мы показали, что альфа-синуклеина вызванных Д. нейродегенерации можно было спасти этих животных от torsinA, белок с молекулярной активности шаперона 1. Кроме того, кандидат, связанных с ПД генов, определенные в нашей лаборатории с помощью крупномасштабного скрининга RNAi усилия использовании альфа-синуклеина неправильного сворачивания анализа были затем вытесняется в Элеганс C. Д. нейронов. Мы решили, что пять из семи генов испытания представляют собой важные модуляторы кандидат PD, как они спасли альфа-синуклеина вызванной нейродегенерации Д. А. 2. Кроме того, лаборатория Линдквист (этот вопрос Юпитера) выступал дрожжей экранах которых альфа-синуклеина зависит от токсичности используется как для считывания генов, которые могут усиливать или подавлять цитотоксичности. Впоследствии мы изучили гены дрожжей кандидата в нашем C. Элеганс альфа-синуклеина вызванной нейродегенерации анализа и успешно проверены многие из этих целей 3, 4.
Наша методика включает в себя генерацию Д. С. Элеганс нейрон-специфическая экспрессия вектора с использованием рекомбинационной клонирование кДНК генов-кандидатов под контролем Pdat-1 промоутера. Эти плазмиды затем microinjected в дикого типа (N2) червей, а также селективного маркера для успешной трансформации. Несколько стабильной трансгенных линий производства кандидата белка в нейронах Д. получаются, а затем самостоятельно перешли в альфа-синуклеина дегенеративные деформации и оценены на нейродегенерации, как на животных и на индивидуальном уровне нейрона, в течение старения.
Protocol
Discussion
Возрастной потерей дофаминовых нейронов, клинические признаком болезни Паркинсона и была связана с накоплением или неправильного сворачивания белка, называемого альфа-синуклеина. Здесь показано, как на этикетке, с помощью флуоресцентных трансгенов, дофаминергических нейронов C. Элеганс и ?…
Acknowledgements
Мы хотим отметить дух сотрудничества всех членов Колдуэлл Lab. Двигательные расстройства исследования в лаборатории была поддержана Бахман-Стросс дистонии и Паркинсона фонд, Соединенные Паркинсона Фонда, американский Паркинсона Болезнь ассоциации, Болезнь Паркинсона Ассоциации Алабама, Майкл Дж. Фокс Фонд исследований болезни Паркинсона, а Бакалавриат исследований
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agarose | Ultrapure | Invitrogen | 15510-027 | |
| Coverglass 20×30 mm | Fisher | 12-548-5A | ||
| Microscope Slides | Plain, 3×1″ | Fisher | 12-549 | |
| Dissecting with Fluorescence | Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Dissecting | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Epifluorescent | Microscope | Nikon | Model E-800 | |
| Filter Cube, GFP HYQ | Endow Bandpass | Chroma Technology |
References
- Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
- Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model. PNAS. 105, 728-733 (2008).
- Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -. C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. The Parkinson’s disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. PNAS. 105, 145-150 (2008).
- Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).
