סרט הווידאו הזה מדגים 2 צבעים הר שלם הכלאה באתרו, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של 2 גנים שונים יכולים להיות דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי דייוויד וילקינסון, דומינגוס אנריקה, פיל אינגהם ודוד איש-Horowicz.
עובר אפרוח הוא כלי רב ערך במחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. שקיפות, שלה נגישות וקלות מניפולציה, הופכים אותו לכלי אידיאלי ללימוד ביטוי גנים במוח, בצינור העצבי, somite היווצרות primordia לב. סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים בהר 2 צבעים שלם הכלאה באתרו, ראשית, העובר גזור מן הביצה ואת קבוע paraformaldehyde. שנית, העובר עיבוד עבור prehybridization. העובר היא הכלאה אז עם שתי בדיקות שונות, אחת יחד לחפור, ואף אחד מצמידים את FITC. בעקבות הכלאה בין לילה, העובר הוא מודגרות עם נוגדנים בשילוב לחפור. תגובת צבע על מצע DIG מבוצע, ואת האזור של עניין נראה כחול. העובר הוא מודגרות אז בשילוב עם נוגדנים FITC. העובר מעובד לתגובת צבע עם FITC, ואת האזור של עניין נראה אדום. לבסוף, העובר מקובע ומעובד phtograph ואת חתך. מדריך לפתרון בעיות מוצג גם.
הר 2 צבעים כולו בשיטת הכלאה באתרו משמש כדי לקבוע הן תבניות במרחב ובזמן של ביטוי גנים, תוך שימוש באחד או שני גנים של עניין. היישומים כוללים הערכת דפוסי ביטוי גנים של גנים הרומן (למשל 1,2, כמו גם שינויים עלבון גן הביטוי הבא (מניפולציות עובריים 3, 4 חרוזים, ו electroporation של רנ"?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מ 'מרגרט Alkek קרן אל RHF.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Eggs | Animal | Charles River | Premium Fertile | |
Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher | 14-062 | |
Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
Microcapillary tube | Sigma | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Tween-20 | Reagent | Sigma | P1379-100ML | |
Proteinase K | Sigma | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher | PR-V4261 | |
EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher | ||
SDS | Reagent | Fisher | BP166-100 | |
Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
Boehringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Applied Sciences | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson Immuno | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Applied Sciences | 11093274910 | |
NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Applied Sciences | 11681451001 | |
Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Applied Sciences | 11426338910 | |
2M Tris | BP1759-500 | Fisher | ||
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma | 429325-100ML | Under hood |