Summary
シンプルで具体的な方法は、分別工程なしで蛍光標識し、細胞表面タンパク質の拡張検出用に実証された。細胞表面タンパク質の差の存在量は、（2 - D）二次元電気泳動とEttan™DIGE技術を用いて解析した。
Abstract
表面タンパク質は、その環境に反応すると、隣接細胞と相互作用する細胞の能力の中心となっています。彼らはほとんどすべての細胞内シグナル伝達の誘導剤であることが知られている。また、彼らは環境適応や薬物治療で重要な役割を果たしており、しばしば疾患の病因と病理学（1）に関与している。タンパク質 - タンパク質相互作用は、シグナル伝達経路に固有であり、これらの複雑な生物学的プロセスのより多くの洞察を得るために、高感度かつ信頼性の高い方法は、細胞表面のタンパク質を研究するために必要とされる。二次元（2 - D）電気泳動は、差動の変化を研究するために複雑なタンパク質サンプルのバイオマーカーや他の標的の検出のために広範に使用されます。彼らの低濃度（細胞タンパク質の1 2％）が部分的に原因の細胞表面タンパク質は、分画もしくは濃縮のいくつかの他のタイプなしで2 - Dゲルで検出するのは困難である。彼らはまた、しばしば不十分な彼らの疎水性の性質と高分子量（2）による2 - Dゲルで表されます。本研究では、我々はタンパク質のこの重要なグループの特定のラベリングと検出のためのCyDye DIGEフルーア最小限の染料を使用して完全な細胞のための新しいプロトコルを提示する。結果は、細胞内タンパク質の最小限のラベルを持つ細胞表面タンパク質の大量の特定のラベルを示した。このプロトコルは、使用するために、迅速に簡単です、そしてすべての3つのCyDye DIGEフルーア最小限の色素（CY 2、サイ3、Cyの5）の細胞表面タンパク質を標識するために使用することができます。これらの機能は、DeCyder 2次元差分解析ソフトウェアを用いてタンパク質発現の変化のEttan DIGE技術と解析との2次元蛍光差ゲル電気泳動（2 - D DIGE）を用いて多重化することができます。細胞表面タンパク質のレベルは、時間の種々の長さのためのCHO細胞（表1参照）の血清飢餓の間に続いた。存在量の小さな変化を高精度に検出され、その結果は定義されている統計的手法によってサポートされています。
Protocol
細胞の培養
- グルタミンとF - 12ハムの培地私は10％ウシ胎児血清、50 U / mlペニシリン、および50μg/ mlの硫酸ストレプトマイシン（Invitrogen）を含むの標準的な細胞培養の手順を使用して、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO - K1）を成長する。
- 無血清培地に培地を交換する。 CyDye DIGEフルーアと異なる時間点Cy3またはCy5最小限の色素（以下、節の細胞表面のラベルを参照）にあった細胞表面タンパク質にラベルを付けます。
- CyDye DIGEフルーアCy2と、各時点とラベルからの細胞のプールが同数。それぞれの2 - Dゲルのための内部標準としてこれらを使用してください。
- 実験の大半は、CHO - K1細胞で行うことができますが、マウス胚線維芽細胞（3T3 L1）とマウスの腹水リンパ腫リンパ芽球（EL4）も（データは示さず）が使用できます。
- グルタミンIIを含むDMEM培地での後者の2つの種類の細胞を成長させる、しかし、そうでない場合は、CHO - K1細胞に使用する同一の条件を使用してください。
細胞表面のラベリング
- 慎重に数えて、5〜10 x106細胞のアリコートに分割し、非酵素的に接着細胞を切り離します。懸濁液中で増殖する細胞の場合は、切り離し手順を省略します。
- 5分間、約800 × gで細胞懸濁液を遠心してください。培地を含む上清を取り除く。
- 1ミリリットルの氷冷ハンクス平衡塩溶液（HBSS）pH8.5中でresuspendionでペレットを洗浄してください。 4 800 XG℃で2分間で遠心分離。
- 上清を除去し、200μlの氷冷標識バッファー（HBSS pHは8.5、1 Mの尿素）で細胞ペレットを再懸濁します。
- 暗所で氷上で20分間、600 pmolのCyDye DIGEフルーア最小限の色素との完全な細胞にラベルを付けます。
- リジン20μlの10mMのを加えて反応をクエンチ。 10分間インキュベートする。
- 4 800 × gで遠心分離℃で2分間に続いて500μlのHBSS pHを7.4に再懸濁によって二回表面標識細胞を洗う。
細胞溶解と分画
- 150μlの冷溶解バッファー（7 M尿素、2 Mチオ尿素、4％CHAPS、30mMのトリス、5mMの酢酸マグネシウムのpH 8.5）で表面標識細胞を溶解する。時々ボルテックスしながら少なくとも1時間氷上にしておきます。
- 4℃で10 000 × gでライセートを遠心℃で5分間。上清を新しいチューブに移す。このサンプルは、すべての細胞タンパク質を含有する非画したサンプルです。
- 並行して、前の2次元ゲル電気泳動への膜と細胞質分画に（膜分画キットを使用して、Pierce）を分画するし、上記のように、細胞ペレットを洗浄する。膜画分は、内部と細胞表面の膜タンパク質が含まれています。
- 比較のために、標準的なEttan DIGEの手順3を実行し、溶解、ラベル、および、最終的に、細胞を分画する。 Dクワントキット（GEヘルスケア） - 2を用いてサンプル中のタンパク質濃度を決定する。
2次元電気泳動
- イモビのDryStripゲル、イモビDryStrip Reswellingトレイ、一晩450μlのDeStreakの補液で24センチメートル（0.5％、IPGバッファー）を用いてpH 3 - 11NL（24センチ）再水和。
- マニホールドの陽極カップローディングでDryStripゲルをイモビ、指示に従ってEttan IPGphor II IEF Systemを使用して等電点電気泳動（IEF）を実行するCyDye標識サンプル（50μgの総タンパク質量に相当）適用されます。
- IEF後、大（26 × 20センチ）12.5％ポリアクリルアミドゲル（SDS - PAGE）上の二つの手順と場所でストリップを平衡化します。 0.5％アガロース（ブロモフェノールブルーを含むバッファを実行しているの）とのオーバーレイ。色素フロントがゲルの底に達するまで30分間、5 W /ゲルで、その後15 W /ゲルでEttan DALTtwelve大きな垂直軸システムを用いて2次元電気泳動を実行します。
イメージングとデータ解析
- 2次元電気泳動を完了した後、台風9410可変モードのイメージャを使用してCy2と、Cy3またはCy5用ゲルをスキャン。
- 膜画分、細胞質分画、およびDeCyder 2次元差分解析ソフトウェア4を使用して非画した試料からスポットマップを比較する。
後染色
- イメージング後、銀は標準的な手順5にしたがってゲルを染色。
タンパク質の同定
- 、収穫の成長、などの非画したサンプルのため、上記の分取量（10 x106 CHO細胞から約1 mgの総タンパク質）の細胞を、洗浄し、溶解する。スパイクとしてCy5標識細胞表面標識サンプル（上記参照）を使用し、そしてタンパク質の非標識取量と一緒に適用されます。
- 上記のような2次元電気泳動を行うが、今回は、aplly 600μgのラベルの付いていないセルは、アノードカップのアプリケーションによってスパイクラベル付け50μgの細胞表面と一緒にライセート。正しいスポットピッキングを可能にするために、基準マーカを使用して、となる配置提言3に記載のゲルキャスティングの前にガラス板をトゥイーン。
- ディープパープルの全タンパク質染色3を使って総タンパク質の染色をCy5で細胞表面のスポットのマップを、得るためにCy5をチャネルでゲルをスキャンします。
- DeCyder 2次元ソフトウェアを使用して2つのスポットのマップを一緒に一致させるとCy 5標識細胞表面タンパク質に対応する全てのスポットのピックリストを作成します。 Ettanのスポット処理ステーションを使用して細胞表面タンパク質を選んで、ゲルプラグから抽出し、EttanのDigesterを使ってtrypsinate。 MALDI - TOF質量分析法を用いて識別する。
表1。Ettan DIGEの実験は図1の細胞表面タンパク質標識プロトコールに従ってラベル血清枯渇細胞からサ ンプルを用いて行った。
| サンプル | 血清枯渇の時間 | CyDyeでLabelled | ゲル番号 |
| 1 | - | CY 3、CY 2 | 1 |
| 2 | 30分 | CY 5、CY 2 | 1 |
| 3 | 2時間 | CY 3、CY 2 | 2 |
| 4 | 4時間 | CY 5、CY 2 | 2 |
| 5 | 16時間 | CY 5、CY 2 | 3 |
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Discussion
タンパク質濃度
twoラベリングワークフローの概要を図1に示されています。細胞表面タンパク質標識プロトコールに従ってラベル際に細胞がまだそのままなので、唯一の細胞表面タンパク質は、染料にさらされている。細胞内部だけでなく外部の標識とタンパク質が（図1）ラベルが付いている前に、標準的なEttan DIGEプロトコールでは、細胞を溶解している。細胞表面タンパク質は、特に定量することができないので、細胞表面のタンパク質標識プロトコルのタンパク質への染料の相対的な量は、知られていない。しかし、それは細胞表面のタンパク質が細胞タンパク質2の非常に低い割合を構成することが知られている。染料の600 pmolのに約5〜10 × 10 6細胞を使用した。本研究でnonfractionatedサンプルの唯一の12.5から25パーセントは、2次元電気泳動のために使用されて以来、それは少数の細胞を使うこともできます。
図1。ワークフローのプロトコルのラベル付けの概要
異なる画分のタンパク質濃度は2 - Dクワントキットを用いて測定した。 10 × 10 6のCHO - K1細胞由来の全タンパク質量は、膜/疎水性画分および細胞質/親水性画分で770μgのある225μgの非画したサンプルで920μgのだ。これらの金額はほとんどの細胞タイプと細胞の大きさによって異なります。細胞表面のプロトコルでラベル付けされているタンパク質の割合は、全タンパク質の2-3％である標準Ettan DIGE最小限のラベリング、より高くなる場合があります。それは、スポット形状はゲル上での低分子タンパク質のラウンドと垂直方向のストリーキングであるため、唯一の色素分子がタンパク質分子ごとに添付されているようだ（図2および3）存在しない。タンパク質ごとに2つおよびより多くの色素分子が標識されたタンパク質の増加した分子量に起因する縦のストリーキングの原因となります。これらのタンパク質の分子量の変化は高分子量のタンパク質に比べてゲル上での大きなシフトの結果になるので、この現象は主に、低分子量のタンパク質で見られるでしょう。
細胞表面のタンパク質のラベリング
細胞の2つの同一の試料は表面がCyDye DIGEフルーアCy3で標識した。一つは、溶解し、2次元電気泳動のために直接使用した。他のサンプルを溶解し、膜と細胞質画分に分画した。全体の蛍光標識は、膜画分に登場した、サイトゾル画分は、任意の標識タンパク質（図2）を欠いていた。サイトゾルのタンパク質試料と同一のゲルは銀染色し、その結果、ゲル中のタンパク質があったことを示したが、それらは細胞表面のタンパク質標識のプロトコルを用いて標識されていない。これらの結果は、この新しいラベルのプロトコルは、細胞表面のタンパク質に特異的であることを示唆している。 CyDye DIGEフルーア最小限の色素は、細胞膜を通して細胞またはパスを入力する表示されません。細胞は、前のラベルに氷上で保持され、これは膜を通過する任意のトランスポートを減らすことができます。 CyDye DIGEフルーア最小限の色素の露出のための時間は、タンパク質標識用ではなく、細胞に入るために十分である、また、（20分）は比較的短いです。セル内にラベルの欠如のための別の可能な説明は、染料が膜を横切って通過する場合であっても、細胞内のpHが発生するための効率的なラベリング反応（至適pH 8.5）のために（<pH7.4）に低すぎるということです。標識反応は、細胞が溶解させた後の任意のタンパク質のラベリングを防ぐ細胞、洗浄に続いて急冷する。このメソッドが正常にin vitroでヒト細胞株にだけでなく、生体7の複雑な生物学的システムに適用されています。
図2。細胞表面タンパク質標識の特異性。
CHO - K1細胞のcellsurfaceタンパク質をCy3と画したで標識した。別の画分を2次元電気泳動により分離し、Cy3蛍光（）のためにスキャンされた。同じゲルは、銀染色（B）であった。
分別
nonfractionatedサンプル（図2）と比較して膜分画サンプルのスポットパターンのわずかな違いがあります。 2つのスポットのマップは、非画した試料中に存在していたDeCyder 2次元差分解析ソフトウェアおよび膜画分で検出された全てのスポットを用いて比較した。分画は、従って、細胞表面のタンパク質の検出を向上させるために必要ではありませんが、細胞内のタンパク質のラベリングの欠如を検証するために使用できます。
プロトコル間の比較
新しい細胞表面proでの利点を評価できるようにするにはテインラベリングプロトコル、標準的なEttan DIGEプロトコールとの比較を行った。同じフラスコで増殖させたCHO - K1細胞から二つの同一の試料は、それぞれ二つの異なるプロトコル、（図1）と並行して標識した。細胞表面Cy5標識サンプルは、Cy3標識細胞溶解液と同じゲル上で実行されました。ゲル上の緑色のスポットは（Cy3標識）（図3A）膜の分画に続いて標準的なEttan DIGEのプロシージャを使用して標識タンパク質を表しています。これらのスポットは、おそらく細胞表面のタンパク質だけでなく細胞内の膜（ER、ゴルジ体、ミトコンドリア、および核）からタンパク質を含む膜タンパク質である。それは低豊富な細胞表面タンパク質を検出するための最も高い確率を与える必要がありますので、膜の分画のステップに続いて標準的なEttan DIGEの標識法は、比較のために選ばれました。ゲル上に赤い斑点が（CY 5）（図3A）標準的な標識法（緑のスポット）と表示されていない新たな細胞表面タンパク質のラベリングのプロトコールを用いて標識細胞表面の特定の蛋白質である。さらに、黄色の斑点は、いずれかの手順（図3A）を使用して、両方のサンプルで発生する重複するタンパク質を表す。別の有用なアプリケーションは、細胞内膜上のものから、細胞表面上のタンパク質を区別するラベルの両方のプロトコルを組み合わせることです。また、種々の刺激後の細胞表面/細胞膜蛋白質レベルでの相対的な変更に関する情報は、同時に両方のラベリング技術を使用して続くことがあります。
図3。
（A）の2次元ゲル画像CHO - K1 Cy5で細胞表面標識サンプル（赤スポット、プロトコール1、図1を参照）し、膜分画し、Cy3のサンプル（緑斑、プロトコル2、図1を参照）に従ってラベル付け標準的なEttan DIGEプロトコルは、同じ2 - Dゲルで実行されます。 （B）DeCyder 2 - Dの標準Ettan DIGEプロトコルを使用して表示されていない細胞表面標識タンパク質を示す2次元ゲルからの差分解析ソフトウェアの景色。
細胞表面タンパク質の同定
スポットパターンは、細胞表面標識サンプルおよび総タンパク質標識試料の間で非常に異なっているので、それは取スポットマップで細胞表面のスポットのマッチングと識別を可能にするスパイク標識細胞表面を含むのに必要でした。すべての細胞表面タンパク質を採取した。細胞表面タンパク質は、それらの低濃度のため、識別が困難になる可能性があります。場所によっては、実際のタンパク質の量は、細胞表面のタンパク質が視覚的に豊かにし、物理的にこのプロトコルを使用して濃縮されていないので、識別のために不十分な場合があります。低豊富な細胞表面タンパク質の正常な識別を容易にするために、総タンパク質の分取量は、2次元電気泳動上でのアプリケーションの前に膜タンパク質を濃縮することができます。これらのCHO細胞で、細胞内の膜タンパク質と細胞表面タンパク質は、細胞中の全タンパク質の約20％を占めている。この細胞型の場合は、スポット中のタンパク質量は、潜在的に膜タンパク質の濃縮により、ファクター5で増加させることができた。また、IPGストリップの狭いグラデーションのpHの間隔の使用は、タンパク質の大量のアプリケーションを許可します。本研究では、膜タンパク質の無濃縮、および広い範囲のIPGストリップで、わずか600μgのトータルタンパク質を使用していました。我々はまだ82％が以前に膜関連タンパク質として知られていたそのうちの細胞表面タンパク質の多数を、識別することができた。
多重
すべての3つの色素6を使用して EttanのDIGEの実験で細胞表面のタンパク質標識のプロトコルをテストするには、血清枯渇したCHO細胞からの一連の試料を採取し、細胞表面タンパク質は、異なる時点（表1）で標識した。サンプルは、2次元電気泳動により分離した。細胞表面のDIGEの実験のための内部標準の調製が簡単です。このケースでは、CY 2細胞表面標識サンプルは、（すべての時間の点から）をプールし、それぞれの2 - Dゲルに適用される内部標準として使用。すべての3つのCyDye DIGEフルーア最小限の色素は、（データは示さず）、同様に細胞表面タンパク質を標識し。細胞表面のタンパク質の多くは血清飢餓の間に発現の変化は、DeCyder 2次元ソフトウェア（図4）を用いて検出した。
図4。
CHO - K1細胞の飢餓の間に二つの細胞表面タンパク質の発現の変化。スポットマップはDeCyder 2次元差分解析ソフトウェアを用いて分析した。
結論
細胞表面タンパク質のラベリングの新しいEttan DIGEのプロトコルは、uに迅速、簡単です。SEと細胞表面のタンパク質を標識するための高度に特異的。細胞表面タンパク質標識プロトコルを使用するときに多くの新しい細胞表面タンパク質のみ検出可能です。 CHO細胞では80以上の新しい細胞表面タンパク質は、DeCyder 2次元差分解析ソフトウェアを用いて検出した。同定された細胞表面標識されたスポットの80％以上が膜結合タンパク質であった。
多重化は、次の3つのCyDye DIGEフルーア最小限の染料を使用して達成し、DeCyderと2次元ソフトウェアの組み合わせで、この新しいプロトコルは2 - D DIGE技術を用いて得られたすべての利点と細胞表面のタンパク質を研究するための強力なツールです。
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Acknowledgments
我々は、彼らのコラボレーションのための臨床病理学、ウィーン、オーストリアの大学の研究所で教授Dontscho Kerjaschki、コリーナマイルホーファーとシグルドリーガーに感謝。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Healthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Differential Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| 2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 89864 | |
| Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |
References
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
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- Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
