Summary
Een eenvoudige en specifieke methode werd aangetoond voor tl-etikettering en de verbeterde detectie van cel-oppervlakte-eiwitten zonder fractionering stap. Differentiële overvloed in cel oppervlakte-eiwitten werd geanalyseerd met behulp van twee-dimensionale (2-D) elektroforese en Ettan ™ DIGE technologie.
Abstract
Oppervlakte-eiwitten staan centraal in het vermogen van de cel om te reageren op zijn omgeving en de interactie met naburige cellen. Ze staan bekend als inductoren van bijna alle intracellulaire signalering. Bovendien spelen ze een belangrijke rol in het milieu aanpassing en behandeling met geneesmiddelen, en zijn vaak betrokken zijn bij de ziekte pathogenese en pathologie (1). Eiwit-eiwit interacties zijn intrinsiek aan signaalwegen, en om meer inzicht te krijgen in deze complexe biologische processen, zijn gevoelige en betrouwbare methoden nodig voor het bestuderen van cel-oppervlakte-eiwitten. Twee-dimensionale (2-D) electroforese wordt op grote schaal gebruikt voor de detectie van biomarkers en andere doelen in complexe eiwit monsters differentiële veranderingen te bestuderen. Cel oppervlakte-eiwitten, mede door hun lage abundantie (1 2% van cellulaire eiwitten), zijn moeilijk te detecteren in een 2-D gel zonder fractionering of een andere vorm van verrijking. Ze zijn ook vaak slecht vertegenwoordigd in 2-D gels vanwege hun hydrofobe karakter en een hoog moleculair gewicht (2). In deze studie presenteren we een nieuw protocol voor het intacte cellen met behulp van CyDye DIGE Fluor minimale kleurstoffen voor specifieke etikettering en de opsporing van deze belangrijke groep van eiwitten. De resultaten toonden aan specifieke etikettering van een groot aantal cel-oppervlakte-eiwitten met een minimale etikettering van intracellulaire eiwitten. Dit protocol is een snelle, eenvoudig te gebruiken, en alle drie CyDye DIGE Fluor minimale kleurstoffen (Cy 2, 3 en Cy Cy 5) kan worden gebruikt om cel-oppervlakte-eiwitten label. Deze functies zorgen voor multiplexing het gebruik van de 2-D fluorescentie Verschil gelelektroforese (2-D DIGE) met Ettan DIGE techniek en de analyse van eiwit-expressie veranderingen met behulp van DeCyder 2-D Differentiële analyse software. Het niveau van de cel-oppervlakte-eiwitten werd gevolgd tijdens het serum uithongering van de CHO-cellen voor verschillende lengtes van de tijd (zie tabel 1). Kleine veranderingen in overvloed werden gedetecteerd met hoge nauwkeurigheid, en de resultaten worden ondersteund door omschreven statistische methoden.
Protocol
Celcultuur
- Groei Chinese hamster ovarium cellen (CHO-K1) met behulp van standaard celkweek procedures in F-12 Ham medium met Glutamax ik dat 10% foetaal kalf serum, 50 U / ml penicilline, en 50 ug / ml streptomycine sulfaat (Invitrogen).
- Exchange het kweekmedium aan serum-vrije media. Label de cel oppervlakte-eiwitten werden op verschillende tijdstippen met CyDye DIGE Fluor Cy3 of Cy5 minimale kleurstoffen (zie rubriek celoppervlak Labeling, hieronder).
- Pool gelijke aantallen van cellen van elk tijdstip en label met CyDye DIGE Fluor Cy2. Gebruik deze als een interne standaard voor elke 2-D gel.
- Het merendeel van de experimenten kan worden uitgevoerd met CHO-K1 cellen, maar de muis embryo fibroblasten (3T3 L1) en de muis ascites lymfoom lymfoblasten (EL4) kan ook gebruikt worden (gegevens niet getoond).
- Groeien de twee laatste soorten cellen in DMEM medium met Glutamax II, maar gebruik anders identieke omstandigheden gebruikt worden voor de CHO-K1 cellen.
Celoppervlak etikettering
- Haal voorzichtig hechtende cellen niet-enzymatisch, tellen en te delen in porties van 5-10 x106 cellen. Voor cellen in suspensie te groeien, laat het los stap.
- Centrifugeer de celsuspensies op ongeveer 800 xg gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatanten die het medium.
- Was de pellets door resuspendion in Balanced Salt Solution 1 ml ijskoud Hank's (HBSS) pH 8,5. Gecentrifugeerd bij 800 xg bij 4 ° C gedurende 2 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 200 ui ijskoude etikettering buffer (HBSS pH 8,5, 1 M ureum).
- Label de intacte cellen met 600 pmol CyDye DIGE kleurstoffen Fluor minimaal gedurende 20 minuten op ijs in het donker.
- Quench de reactie door het toevoegen van 20 pi 10 mM lysine. Incubeer gedurende 10 minuten.
- Was twee keer de oppervlakte-gemerkte cellen door resuspensie in 500 pi HBSS pH 7,4, gevolgd door centrifugatie bij 800 xg bij 4 ° C gedurende 2 minuten.
Cellysis en fractionering
- Lyse de oppervlakte-gemerkte cellen in 150 ul koude lysis buffer (7 M ureum, 2 M thio, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM magnesiumacetaat pH 8,5). Laat het ijs gedurende ten minste 1 uur met af en toe vortexen.
- Centrifugeer de lysaten bij 10 000 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Breng het supernatans naar een nieuwe buis. Dit monster is de niet-gefractioneerde monster dat alle cellulaire eiwitten.
- Parallel, wassen celpellets, zoals hierboven, dan fractioneren (met behulp van een membraan fractionering kit, Pierce) in membraan en de cytosolische fracties voorafgaand aan de 2-D gel elektroforese. Het membraan fractie bevat interne en celoppervlak membraaneiwitten.
- Ter vergelijking, volg dan de standaard Ettan DIGE procedure 3, en lyse, label, en, ten slotte, fractioneren van de cellen. Bepaal de proteïne concentratie in de monsters met behulp van de 2 - D Quant Kit (GE Healthcare).
2-D elektroforese
- Hydrateren Immobiline DryStrip gels, pH 3-11NL (24 cm) met behulp van Immobiline DryStrip Reswelling tray, 24 cm in 450 ul DeStreak rehydration solution (0,5% IPG Buffer) 's nachts.
- Breng de CyDye-gelabelde monsters (wat overeenkomt met 50 ug totaal eiwit) om DryStrip gels Immobiline door anodische cup laden in het spruitstuk en de iso-elektrische focussering (IEF) met behulp van Ettan IPGphor II IEF-systeem volgens de instructies uit te voeren.
- Na het IEF, evenwicht van de strips in twee stappen en plaats op de top van grote (26 x 20 cm) 12,5% polyacrylamide gels (SDS-PAGE). Overlay met 0,5% agarose (in rijklare buffer met broomfenolblauw). Run 2-D elektroforese met behulp van Ettan DALTtwelve grote verticale System bij 5 W / gel gedurende 30 minuten, en dan bij 15 W / gel totdat de kleurstof front bereikt de onderkant van de gel.
Imaging en data-analyse
- Na het voltooien van 2-D elektroforese, scan de gels voor Cy2, Cy3 of Cy5 met behulp van een Typhoon 9410 Variable Mode Imager.
- Vergelijk spot kaarten van membraanfracties, cytosolische fracties, en niet-gefractioneerd monsters met behulp van DeCyder 2-D-Verschil Analyse Software 4.
Post-vlekken
- Na de beeldvorming, zilver vlekken op de gels volgens de standaard procedure 5.
Eiwit identificatie
- Telen, oogsten, wassen en lyseren preparatieve bedragen (ongeveer 1 mg totaal eiwit van 10 x106 CHO-cellen) van cellen, zoals hierboven beschreven voor een niet-gefractioneerde monster. Gebruik een Cy5 celoppervlak gelabelde monster (zie boven) als een piek, en toe te passen in combinatie met de niet-geëtiketteerde preparatieve hoeveelheden eiwitten.
- Het uitvoeren van 2-D elektroforese als hierboven beschreven, maar deze keer, aplly 600 ug ongelabelde cel lysaat samen met 50 ug celoppervlak gelabeld spike door anodische cup toepassing. Gebruik referentie markers om de juiste plek plukken toe te staan, en plaats wordentussen de glazen platen voor de gel gieten volgens de aanbevelingen 3.
- Scan de gel in Cy5 kanaal naar de Cy5 celoppervlak spot kaart, gevolgd door een totaal eiwit kleuring met behulp van Deep purple totaal eiwit vlek 3 te verkrijgen.
- Match samen de twee plek kaarten met behulp van de DeCyder 2-D software en maak een keuze lijst voor alle plaatsen die overeenkomt met de Cy 5 gelabelde cel oppervlakte-eiwitten. Pick cel-oppervlakte-eiwitten met behulp van de Ettan plek handling station, uittreksel uit de gel stekkers, en trypsinate het gebruik van de Ettan vergister. Identificeren met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie.
Tabel 1. Een Ettan DIGE experiment werd uitgevoerd met behulp van monsters van serum uitgeputte cellen geëtiketteerd volgens de cel-oppervlakte-eiwit labeling protocol in figuur 1.
| Monster | De tijd van het serum uitputting | Gelabeld met CyDye | Gel nummer |
| 1 | - | Cy 3, Cy 2 | 1 |
| 2 | 30 minuten | Cy 5, Cy 2 | 1 |
| 3 | 2 uur | Cy 3, Cy 2 | 2 |
| 4 | 4 uur | Cy 5, Cy 2 | 2 |
| 5 | 16 uur | Cy 5, Cy 2 | 3 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eiwitconcentratie
Een overzicht van de twee etikettering workflows is weergegeven in figuur 1. Omdat de cellen zijn nog steeds intact wanneer geëtiketteerd volgens de cel-oppervlakte-eiwit labeling-protocol, worden alleen de cel oppervlakte-eiwitten worden blootgesteld aan de kleurstof. In de standaard Ettan DIGE protocol, worden de cellen gelyseerd voor de etikettering en de eiwitten zowel binnen als buiten de cel zijn gelabeld (Fig 1). De relatieve hoeveelheid kleurstof aan eiwit in de cel-oppervlakte-eiwit labeling-protocol is niet bekend, omdat cel-oppervlakte-eiwitten niet specifiek kunnen worden gekwantificeerd. Het is echter bekend dat cel-oppervlakte-eiwitten een zeer klein deel van de cellulaire eiwitten 2 vormen. Ongeveer 5-10 x10 6 cellen tot 600 pmol van de kleurstof gebruikt. Het kan mogelijk zijn om minder cellen te gebruiken, aangezien slechts 12,5 tot 25% van de nonfractionated steekproef in deze studie werd gebruikt voor 2-D elektroforese.
Fig 1. Overzicht van de etikettering workflow protocollen
Eiwit concentraties in de verschillende fracties werden bepaald met behulp van de 2-D Quant Kit. De totale hoeveelheid eiwit bedraagt afgeleid van 10 x10 6 CHO-K1-cellen was 920 ug in de niet-gefractioneerde monster, 225 ug in het membraan / hydrofobe fractie en 770 ug in de cytosolische / hydrofiele fractie. Deze bedragen zal waarschijnlijk variëren, afhankelijk van het celtype en de celgrootte. Het aandeel van eiwitten die zijn geëtiketteerd in de cel-oppervlakte-protocol kan hoger zijn dan de standaard Ettan DIGE minimale etikettering, die is 2-3% van het totale eiwit. Het lijkt erop dat er slechts een kleurstof molecuul is bevestigd per eiwitmolecuul, want de plek is rond en de verticale strepen van de lage moleculaire eiwitten op de gels afwezig is (Figuur 2 en 3). Twee en meer kleurstof moleculen per eiwit zou leiden tot verticale strepen als gevolg van toegenomen moleculaire gewicht van de gelabelde eiwitten. Dit fenomeen zou vooral worden gezien met de laag moleculair gewicht eiwitten, omdat een verandering in de moleculaire gewicht van deze eiwitten zal leiden tot een grotere verschuiving op de gel in vergelijking met een hoog moleculair gewicht eiwitten.
Cel-oppervlakte-eiwit specifieke etiketteringsvoorschriften
Twee identieke monsters van cellen werden gelabeld met het oppervlak CyDye DIGE Fluor Cy3. Een van hen was gelyseerd en direct gebruikt voor 2-D elektroforese. Het andere monster werd gelyseerd en gefractioneerd in de membraan en cytosolische fracties. De hele fluorescent label verscheen in het membraan fractie; de cytosolische fractie was zonder enige gelabelde eiwitten (afb. 2). Hetzelfde gel met de cytosolische eiwit monster werd zilver gekleurd en het resultaat bleek dat er eiwitten in de gel, maar ze waren niet gelabeld met behulp van de cel-oppervlakte-eiwit labeling protocol. Deze resultaten suggereren dat deze nieuwe etikettering protocol is specifiek voor cel-oppervlakte-eiwitten. De CyDye DIGE Fluor minimaal dye lijkt niet de cel of door het celmembraan te voeren. De cellen worden bewaard op ijs voorafgaand aan de etikettering en dit kan alle vervoer te verminderen over het membraan. De tijd voor CyDye DIGE Fluor minimaal kleurstof blootstelling is ook relatief kort (20 minuten), wat voldoende is voor eiwitten etikettering, maar niet voor de toegang tot de cel. Een andere mogelijke verklaring voor het ontbreken van een etiket in de cel is dat zelfs als de kleurstof gaat over het membraan, de pH-waarde in de cel te laag is (<pH 7,4) voor een efficiëntie-etikettering reactie optreden (optimale pH 8,5). De etikettering reactie wordt gedoofd gevolgd door wassen van de cellen, die verder voorkomt eiwit etiket na de cellen zijn gelyseerd. Deze methode is met succes toegepast op menselijke cellijnen in vitro, alsook om een complex biologisch systeem in vivo 7.
Fig. 2. Specificiteit van cel-oppervlakte-eiwit labeling.
De cellsurface eiwitten van CHO-K1 cellen werden gemerkt met Cy3 en gefractioneerd. De verschillende fracties werden gescheiden door 2-D elektroforese en gescand voor Cy3 fluorescentie (A). Dezelfde gels werden vervolgens zilver gekleurd (B).
Fractionering
Er zijn slechts kleine verschillen in de plek patroon voor de membraan-gefractioneerde monster vergeleken met de nonfractionated monster (afb. 2). De twee spot kaarten werden vergeleken met behulp DeCyder 2-D Differentiële analyse-software en alle plekken ontdekt in de membraan fractie waren ook aanwezig in de niet-gefractioneerde monster. Fractionering is daarom niet nodig om de detectie van cel-oppervlakte-eiwitten te verbeteren, maar kan worden gebruikt om gebrek aan herkenbaarheid van eiwitten in de cellen te controleren.
Vergelijking tussen protocollen
Om de voordelen te evalueren met de nieuwe celoppervlak proeiwit labeling protocol, een vergelijking met de standaard Ettan DIGE protocol werd uitgevoerd. Twee identieke monsters van CHO-K1 cellen gekweekt in dezelfde kolf werden bestempeld in parallel met de twee verschillende protocollen, respectievelijk (afb. 1). Een cel-oppervlak Cy5 gelabelde monster werd op dezelfde gel als een Cy3 gelabeld cellysaat. De groene vlekken (Cy3) op de gel (figuur 3A) vertegenwoordigen de eiwitten gelabeld met behulp van de standaard Ettan DIGE procedure die is gevolgd door membraan fractionering. Deze vlekken zijn vermoedelijk membraaneiwitten waaronder cel oppervlakte-eiwitten als eiwitten uit membranen in de cel (ER, Golgi, mitochondrion, en nucleus). Standaard Ettan DIGE etikettering procedure die is gevolgd door een membraan fractionering stap werd gekozen voor de vergelijking, omdat het zou de grootste kans voor het detecteren van de lage overvloedige cel-oppervlakte-eiwitten te geven. De rode vlekken (Cy 5) op de gel (figuur 3A) zijn celoppervlak specifieke eiwitten gelabeld met behulp van de nieuwe cel oppervlakte-eiwit labeling-protocol die niet zichtbaar zijn met de standaard etikettering procedure (groene vlekken). Bovendien zijn de gele vlekken geven overlappende eiwitten die voorkomen in beide monsters met behulp van de procedure (fig. 3A). Een andere nuttige toepassing zou zijn om zowel de etikettering protocollen om eiwitten te onderscheiden op het celoppervlak van die op intracellulaire membranen te combineren. Bovendien kan informatie over de relatieve veranderingen in de cel oppervlakte / membraaneiwit niveau na verschillende stimuli worden gevolgd met behulp van zowel de etikettering technieken tegelijk.
Fig 3.
(A) 2-D gel beelden van een CHO-K1 Cy5 celoppervlak gelabelde sample (rode vlekken, zie protocol 1, fig. 1) en een membraan gefractioneerd Cy3 monster (groene plekjes, zie protocol 2, fig. 1) geëtiketteerd overeenkomstig standaard Ettan DIGE protocol loopt in dezelfde 2-D gel. (B) DeCyder 2-D Differentiële Analyse Software uitzicht vanaf het 2-D gel met een cel-oppervlakte-gelabeld eiwit niet zichtbaar is met behulp van het standaard Ettan DIGE protocol.
Identificatie van cel-oppervlakte-eiwitten
Omdat de plek patroon is heel anders dan tussen een gelabelde celoppervlak monster en een totale proteïne label monster, was het noodzakelijk om een celoppervlak gelabeld spike aan matching en de identificatie van het celoppervlak plekken in de voorbereidende spot kaart kan bevatten. Alle cel-oppervlakte-eiwitten werden geplukt. Cel-oppervlakte-eiwitten kan moeilijk zijn te identificeren door hun lage abundantie heeft. De werkelijke hoeveelheid eiwit bedraagt op sommige plaatsen kan onvoldoende zijn voor identificatie, omdat de cel oppervlakte-eiwitten visueel verrijkt en fysiek niet verrijkt met behulp van dit protocol. Ter bevordering van succesvolle identificatie van laag overvloedige cel-oppervlakte-eiwitten, kunnen de voorbereidende hoeveelheid totaal eiwit worden verrijkt voor membraaneiwitten voor toepassing op 2-D elektroforese. In deze CHO-cellen, intracellulaire membraaneiwitten en cel-oppervlakte-eiwitten vormen ongeveer 20% van de totale hoeveelheid eiwit in de cellen. Voor dit type cel, kan het eiwit bedrag in de vlekken eventueel worden verhoogd met een factor 5 door verrijking van membraaneiwitten. Ook zal het gebruik van smalle gradiënt pH intervallen van de IPG-strips maken de toepassing van grotere hoeveelheden eiwit. In deze studie gebruikten we alleen 600 ug totaal eiwit, zonder verrijking voor membraaneiwitten, en een breed scala IPG strip. We waren nog steeds in staat om een groot aantal cel-oppervlakte-eiwitten, waarvan 82% voorheen bekend als membraan-geassocieerde eiwitten te identificeren.
Multiplexing
Voor het testen van de cel oppervlakte-eiwit labeling-protocol in een Ettan DIGE experiment met behulp van alle drie kleurstoffen 6, een serie van monsters van serum uitgeputte CHO-cellen werden verzameld en cel-oppervlakte-eiwitten gelabeld op verschillende tijdstippen (Tabel 1). Monsters werden gescheiden door 2-D elektroforese. De voorbereiding van een interne standaard voor een celoppervlak DIGE experiment is eenvoudig. In dit geval werden Cy 2 celoppervlak gelabeld monsters (van alle tijden punten) gebundeld en gebruikt als een interne standaard toegepast op elk 2-D gel. Alle drie de CyDye DIGE Fluor minimale kleurstoffen gelabelde cel-oppervlakte-eiwitten op dezelfde (gegevens niet getoond). Veranderingen in de expressie tijdens het serum honger voor veel van de cel-oppervlakte-eiwitten werden gedetecteerd met behulp DeCyder 2-D software (afb. 4).
Fig 4.
Verandering in de expressie van twee cel-oppervlakte-eiwitten tijdens de hongersnood van de CHO-K1 cellen. Spot kaarten werden geanalyseerd met behulp van DeCyder 2-D differentiële analyse software.
Conclusies
De nieuwe Ettan DIGE protocol voor het celoppervlak-eiwit labeling is een snelle, eenvoudig te use en zeer specifiek voor het labelen van cel-oppervlakte-eiwitten. Veel nieuwe cel-oppervlakte-eiwitten alleen detecteerbaar bij gebruik van de cel-oppervlakte-eiwit labeling protocol. Meer dan 80 nieuwe cel-oppervlakte-eiwitten voor CHO cellen werden gedetecteerd met behulp van DeCyder 2-D Differentiële analyse software. Meer dan 80% van de geïdentificeerde celoppervlak gelabeld plekken waren membraan geassocieerde eiwitten.
Multiplexing is bereikt met de drie CyDye DIGE Fluor minimale kleurstoffen, en in combinatie met DeCyder 2-D-software, is dit nieuwe protocol is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van cel-oppervlakte-eiwitten met alle voordelen verkregen met de 2-D DIGE technologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Professor Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer en Sigurd Krieger aan het Instituut voor Klinische Pathologie van de Universiteit van Wenen, Oostenrijk voor hun samenwerking.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye DIGE Kit, 2 nmol | Reagent | GE Healthcare | 28-9345-30 | |
| 2-D Quant Kit | Reagent | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| IPG Buffer pH 3-11NL | Reagent | GE Healthcare | 17-6004-40 | |
| Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-77 | |
| IPGbox | Tool | GE Healthcare | 28-9334-65 | |
| IPGbox kit | Tool | GE Healthcare | 28-9334-92 | |
| DeStreak Rehydration solution | Reagent | GE Healthcare | 17-6003-19 | |
| Immobiline DryStrip Cover Fluid | Reagent | GE Healthcare | 17-1335-01 | |
| Ettan IPGphor 3 IEF Unit | Instrument | GE Healthcare | 11-0033-64 | |
| Ettan IPGphor Manifold | Instrument component | GE Healthcare | 80-6498-38 | |
| Ettan DALTtwelve Gel Caster | Tool | GE Healthcare | 80-6467-22 | |
| Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit | Instrument | GE Healthcare | 80-6466-46 | 230 V unit: 80-6466-27 |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | Instrument | GE Healthcare | 63-0055-81 | |
| Ettan Spot Picker | Instrument | GE Healthcare | 18-1145-28 | |
| Ettan Digester | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-68 | |
| Ettan Spotter | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-67 | |
| Ettan MALDI-TOF | Instrument | GE Healthcare | 18-1142-33 | |
| DeCyder 2-D Differential Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-4012-01 | |
| ImageQuant Analysis Software | Other | GE Healthcare | 28-9236-62 | |
| Urea | Reagent | GE Healthcare | 17-1319-01 | |
| CHAPS | Reagent | GE Healthcare | 17-1314-01 | |
| PlusOne Dithiothreitol (DTT) | Reagent | GE Healthcare | 17-1318-01 | |
| Bromophenol Blue | Reagent | GE Healthcare | 17-1329-01 | |
| Tris | Reagent | GE Healthcare | 17-1321-01 | |
| Sodium Dodecylsulfate (SDS) | Reagent | GE Healthcare | 17-1313-01 | |
| PlusOne Glycerol 87% | Reagent | GE Healthcare | 17-1325-01 | |
| PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C | Reagent | GE Healthcare | 17-1310-01 | |
| PlusOne TEMED | Reagent | GE Healthcare | 17-1312-01 | |
| PlusOne Ammonium Persulfate | Reagent | GE Healthcare | 17-1311-01 | |
| PlusOne Glycine | Reagent | GE Healthcare | 17-1323-01 | |
| 2-D Sample Prep for membrane proteins | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 89864 | |
| Streptomycin sulphate | Reagent | Invitrogen | 15140-122 |
References
- Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
- Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
- Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
- DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
- 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
- CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
- Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
- Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).
